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Biology

Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em Published: November 13, 2014 doi: 10.3791/52043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MRC/ARUK Centre for Musculoskeletal Ageing Research, University of Nottingham

Summary

O músculo esquelético é essencial para a locomoção e é a principal loja de proteína dos corpos. Medidas de saúde musculares dentro de C. elegans são descritos. Mudanças potenciais na estrutura e função muscular são avaliados usando GFP localizada e corantes catiônicos.

Abstract

O músculo é um tecido dinâmico que responde a mudanças na alimentação, exercício e estado de doença. A perda de massa muscular e função com a doença ea idade são encargos significativos para a saúde pública. Atualmente, entender pouco sobre a regulação genética da saúde muscular com a doença ou idade. O nemátodo C. elegans é um modelo estabelecido para a compreensão da regulação genômica dos processos biológicos de interesse. Os músculos da parede do corpo deste verme apresentar um elevado grau de homologia com os músculos de espécies de metazoários mais elevados. Desde C. elegans é um organismo transparente, a localização de GFP para mitocôndrias e sarcómeros permite a visualização de estas estruturas in vivo. Similarmente, a alimentação de animais corantes catiónicos, que se acumulam com base na existência de um potencial de membrana mitocondrial, permite a avaliação da função mitocondrial in vivo. Estes métodos, bem como a avaliação de homeosta proteína muscularsis, são combinados com avaliação da função muscular animal inteiro, sob a forma de ensaios de movimento, para permitir a correlação de defeitos sub-celulares com medidas funcionais de desempenho muscular. Assim, C. elegans fornece uma plataforma poderosa para avaliar o impacto das mutações do gene, o knockdown, e / ou compostos químicos sobre a estrutura e função musculares. Por último, como a GFP, corantes catiónicos, e ensaios de circulação são avaliadas de forma não invasiva, estudos prospectivos da estrutura e função do músculo pode ser conduzida ao longo de todo o curso da vida e, actualmente, esta não pode ser facilmente investigada in vivo em qualquer outro organismo.

Introduction

O músculo é um tecido multifuncional, bem apreciado por seu papel na locomoção, sustentação postural e metabolismo. O desenvolvimento ea manutenção do músculo saudável requer a coordenação de vários processos celulares e componentes. Ou através de dano ou doença, a desregulação pode ocorrer, o que resulta na estrutura muscular alterada e / ou função. Declínio associado à idade na função muscular apresenta um encargo significativo para os orçamentos de saúde no mundo ocidental, uma vez que a massa muscular de 1,2 e, particularmente, força e resistência muscular 3-5 são negativamente correlacionados com a mortalidade. A medição de aspectos relacionados com a deterioração da função muscular, tais como a função mitocondrial alterada ou sarcômero interrupção, pode permitir uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes desenvolvimento muscular global e saúde.

Elegans C aenorhabditis (C. elegans) é uma microscópicas bes nematóidest conhecido, pois foi o primeiro organismo multicelular a ter todo o seu genoma sequenciado 6, a primeira a ter genes silenciados usando RNAi 7, eo único a ter suas metazoan toda linhagem celular 8 e 9 de neuroanatomia determinado. C. elegans foi proposto pela primeira vez como um modelo para o estudo do controle genético do comportamento em 1974 por Sydney Brenner 10 e da importância deste trabalho e posterior foi reconhecida com o primeiro dos três prêmios Nobel concedidos a C. elegans pesquisadores. Cerca de 35% dos genes de C. elegans identificaram ortólogos em seres humanos, com C. elegans ser um organismo chave usada para compreender o controle genético do desenvolvimento muscular 11. Quase todos os genes no genoma C. elegans pode ser derrubado por meio de RNAi 7,12. Assim, derrubando genes no músculo totalmente desenvolvido, componentes genéticos contribuindo para a regulamento da saúde muscular pode ser investigada com relativa simplicidade 13.

A capacidade combinada de usar RNAi, mutantes, e compostos químicos torna C. elegans um sistema premier para explorar a regulação genética 7,14,15 da estrutura e função muscular com 16 anos de idade e em modelos de doenças 17. O impacto de knockdown do gene, mutação, e / ou exposição a compostos químicos sobre a estrutura e / ou função do músculo pode ser medido através de vários aspectos. Aqui, descrevemos brevemente técnicas simples para avaliar C. elegans estrutura e função do músculo, muitos dos quais podem ser utilizados em estudos prospectivos de saúde muscular.

O desenvolvimento da proteína verde fluorescente (GFP) 18 permitiu a visualização de ambos a localização de proteínas específicas e a estrutura geral de organelos em C. elegans. Aqui explicamos como GFP expressa especicamente dentro do corpo da parede muscular mitocôndrias, núcleos, ou sarcómeros pode ser utilizado para determinar se a distrofia destas estruturas sub-celular está presente. Como a estrutura não é sempre um substituto confiável para a função, nós também explicar como o uso de corantes catiônicos in vivo permite a avaliação do potencial de membrana mitocondrial prejudicada dentro do músculo. Quando os corantes são usados ​​em combinação com GFP, eles permitem o estudo da estrutura e funcionamento de uma forma temporal, durante toda a vida. Por último, nós também explicar como homeostase proteínas dentro do músculo pode ser avaliado e como todas essas medidas pode ser usado para correlacionar as mudanças na saúde músculo animal inteiro através da utilização de ensaios de movimento. Estas técnicas, combinadas com knockdown gene, mutações, e / ou compostos químicos proporcionam um poderoso arsenal para o estudo de como os genes ou compostos específicos influenciar a saúde do músculo in vivo. Os paralelos na estrutura, metabolismo e função do músculo bruta entre C. elegans emamíferos significa C. elegans é um organismo modelo excelente para a compreensão da regulação do músculo em organismos superiores, incluindo os seres humanos.

Protocol

1. Cepas, Cultura, e de Microscopia

  1. Manipular e manter cepas de C. elegans como descrito anteriormente 19. As estirpes estão disponíveis a partir do Centro de Genética Caenorhabditis (CGC).
    NOTA: As estirpes utilizadas nestas experiências foram CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-lacZ; Pmyo-3 :: Mtgfp) eu; o-8 (e1489 IV)) com proteínas de fusão GFP localizadas para mitocôndrias e núcleos; PJ727 (jls01 (mio-3 :: GFP, rol-6 (su1006)); unc-54 :: lacZ V) com proteínas de fusão GFP localizadas ao aparato contrátil e PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5); unc- 54 :: lacZ) V) com proteínas de fusão β-galactosidase localizadas para o citosol.
  2. Experimentos de ARNi completos como anteriormente descritos para as experiências com várias gerações de ARNi 13 e ARNi obter bactérias a partir da sequência verificada biblioteca ORF-RNAi construído por Marc Vidal et al. 12.
  3. Construir cepas contendo <em> CCIs 4251, jls01 ou CCIs 55 usando técnicas convencionais 20. Use esses transgenes para criar uma tensão para avaliar a estrutura da rede mitocondrial, organização miosina ou o estado de Proteostase, respectivamente. Atravesse as tensões em um mutante procura em um desses compartimentos sub-celulares em cada animal é desejado.
  4. Usar o inibidor de PtdIns-3-quinase, LY-294002 (LY) como previamente descrito 21. Resumidamente, adicionar LY-294002 numa concentração final de 160 uM em cima de placas de OP50-semeado secos NGM.
  5. Capturar todas as imagens usando um filtro de GFP para experiências baseadas em GFP e um microscópio com um filtro passa-triplo que permite imagens de canais vermelho, verde e azul, simultaneamente, para a avaliação do potencial de membrana vivo com C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, vulgarmente comercializado como MitoTracker Red CMXRos. Realizar análise de imagem e figura preparação em software de processamento de imagem.

  1. Um mínimo de 1 dia antes necessário, fazer tampão M9 - 22,04 mM KH 2 PO 4, 42,27 mM Na 2 HPO 4, NaCl mM 85,56 (concentrações finais), e esterilizar em autoclave. Uma vez arrefecida a 45 ° C, adicionar estéril MgSO 4 a 1 mM após a autoclavagem para evitar a precipitação 22. Permitir que a M9-se arrefecer a 4 ° C, e alíquota em tubos de 50 ml.
  2. No dia da experiência, adicionar 3 ml de tampão M9 para uma única placa 9 cm, com elevados números de larvas L1. Lava-se a placa várias vezes por aspiração do líquido M9 e pipetagem contra a superfície do agar com a placa mantida num ângulo.
  3. Lavar os L1 do a partir da placa e, em seguida, transferir o M9 para um tubo de ensaio de 10 ml usando uma pipeta.
  4. Deixar durante 2,5 min para permitir que a maior adulto e posteriores animais fase larval a cair para o fundo do tubo de teste e os animais L1 menores permanecem perto do top do tampão M9.
  5. Remover os melhores 500 ul de M9 no tubo de ensaio usando uma pipeta. Em seguida, pipetar as larvas M9 contendo L1 para uma nova placa NGM semeado com 500 mL OP50 sob um escopo dissecar.
  6. Normalmente, o objectivo de transferir ~ 200-300 larvas L1 por placa. Monitorar diariamente das placas idade adulta e, se necessário, pegar os animais para novas placas NGM OP50 para evitar fonte de alimento OP50 sendo consumido.
    NOTA: Este é geralmente 1-3 gotas de M9 usando uma pipeta P1000, embora varie, dependendo, em grande medida o número de L1 do na placa original.
  7. Se estudos prospectivos em animais individuais são desejados, uma vez que os animais atingem a idade adulta, pegar animais individuais para separar placas NGM semeados. Transferência animais cada 24-48 horas para separar os animais de larvas.

3. Movimento Ensaios 19

  1. Um mínimo de 2 horas antes do início da experimentação, remover uma alíquota de 50 ml de M9 e deixar equilibrar à temperatura ambienteratura.
  2. Escolha um único animal adulto em tampão M9 50 mL em uma lâmina de microscópio.
  3. Contar o número de curvas do corpo esquerda e para a direita na 10 seg, onde uma curva para a esquerda e uma direita é igual a um acidente vascular cerebral.
  4. Repetir a contagem de acidentes vasculares cerebrais do corpo para se obter um total de pelo menos 5 medições a partir do qual podem ser tomadas em média. Multiplique esses números por seis a dar a taxa de movimento por min.
  5. Com uma pipeta, transferir o animal de volta para a placa de Petri. Este método permite a medição temporal do movimento ao longo de todo o tempo de vida em C. elegan s.

A Figura 1
Figura 1: ensaios Movimento. Uma vez que os vermes são colhidos em buffer, uma para a esquerda (A) e um para a direita (B) curva são somados para dar um movimento completo(Acidente vascular cerebral).

4. Imagem de mitocondriais Redes e Sarcômeros em Wall Corpo Muscle

  1. NOTA: O mesmo protocolo aplica-se para a imagem latente, tanto da mitocôndria e sarcômeros.
  2. Sincronize vermes como descrito anteriormente (Seção 1) e crescer para 48-60 horas a 20 ° C, quando eles vão chegar na idade adulta jovem.
  3. Escolha 20 worms (representativas da placa) das placas em 20 l M9 em uma lâmina de microscópio.
  4. Aplique uma lamínula e proceder à imagem usando um microscópio de fluorescência sob um filtro GFP (460-500 nm, a luz azul de excitação) em 40X.

5. Avaliação do Potencial de Membrana usando uma In Vivo Ensaio de Acumulação com MitoTracker Red CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O)

  1. Sincronizar CB5600 (Secção 1), todas marcadas com GFP na mitocôndria de músculos, e crescer até à idade adulta precoce em NGM contendo OP50 para 48-60 hr a 20 ° C.
  2. Adicionar 100 ul de DMSO para a alíquota de 50 ug de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O para produzir uma solução stock de 940,692 uM.
  3. Tomar 1 ml da solução de estoque 940,692 pM e ressuspender em 199 ul M9 para criar uma solução de trabalho de 4,70 uM (4,70346 uM). Prepare esta em marrom tubos de 1,5 ml, porque C 32 H 32 Cl 2 N 2 O é fotossensível.
  4. Preparar alíquotas de 20 mL da solução 4,70 mM (20 vermes adultos por 20 l alíquota) de trabalho.
  5. Escolher 20 animais adultos em 20 ul de 4,70 uM C 32 H 32 Cl 2 N 2 O em castanhos os tubos de 1,5 ml. Incubar a 20 ° C durante 1 hora.
  6. Após a incubação de 1 hora, adicionar 1 ml M9 para os marrons tubos de 1,5 ml contendo os vermes, centrifugar a 2000 xg por 10 segundos e, em seguida, remover o sobrenadante. Repita esta etapa de lavagem antes de ressuspender a pellet verme e transferir os restantes 20 μl (contendo os vermes) para um slide para a imagem latente.
  7. Tome imagens da mitocôndria com 40X de ampliação usando um filtro de passagem de triplo que permite a visualização de ambos os canais vermelho, azul e verde simultaneamente. Imagiologia utilizando o filtro de passagem tripla mostra a co-localização de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O com GFP localizada a mitocôndria que aparecem como laranja.
  8. Tendo tomado uma imagem da mitocôndria alaranjado, foto-branquear o animal por 10 segundos usando a luz de comprimento de onda 540/25 nm em configurações máximas com todos os filtros removidos. Isto irá branquear a vermelho dentro das mitocôndrias e revelar a GFP mitocondrial só para confirmar co-localização em mitocôndrias musculares.

6. Avaliação da degradação da proteína muscular em C. elegans

  1. Sincronize PD55s (ou qualquer tensão contendo o transgene lacZ) sobre a placas NGM semeado com OP50 (Seção 1). Crescer para a idade adulta em 48-60 horas a 20 ° C.
  2. Escolha 20 vermes adultos em 20 mL DDH 2 O em uma lâmina de microscópio. Tenha cuidado para tentar pegar apenas o verme, e não todas as bactérias com a picareta. Rotular a lâmina de microscópio a lápis.
  3. Colocar no exsicador durante 30 min para secar e rachar a cutícula dos animais. Assegurar uma boa vedação em exsicador com massa em torno do selo.
  4. Verifique a dessecação tem sido eficaz no âmbito de um escopo de dissecação (Figura 2).
  5. Submerge a lâmina de microscópio em acetona gelada durante 3,5 min, em seguida, deixar a lâmina de microscópio sobre uma toalha de papel à temperatura ambiente durante 15 min para permitir que a acetona no slide a evaporar-se. Neste ponto descongelar o tampão de X-gal e à oxidação e permitir equilibrar à temperatura ambiente.
  6. Adicionar 2 mL X-gal para 100 mL de buffer oxidação e vortex suavemente para garantir isso é homogênea. Esta é a mistura principal tampão X-gal / oxidação.
  7. Adicionar 20 ml da mistura principal tampão X-gal / oxidação para cada oárea riginal de 20 vermes. Inspecione sob um escopo dissecar para garantir a mistura principal cobre completamente todos os animais totalmente. Incline a lâmina de microscópio para mover o mix mestre sobre as áreas onde os animais não são cobertos.
  8. Colocar a lâmina do microscópio numa câmara de humidade durante 1-2,5 h a 20 ° C. Animais imagem quando uma cor azul escuro está presente nos músculos da parede do corpo dos animais controle. Avaliar animais controle sob um escopo dissecar cada 15 minutos para determinar quando os animais deve ser trabalhada.

A Figura 2
Figura 2: Avaliação da degradação da proteína muscular utilizando ensaios β-galactosidase. (A) Os animais que contêm um transgene lacZ são colhidos a partir das placas de Petri de 20 ul ddH2O numa lâmina de microscópio (B). Os animais são dessecada e tornar-se fraturado (D). Uma vez que a acetona evapora a mistura principal tampão X-gal / oxidação é adicionado (E). O desenvolvimento da cor azul em animais de controlo é avaliada a intervalos de 15 min (FL) a partir de t = 0 min (F), até que uma cor azul escuro é obtida através do comprimento dos animais (L). Imagens de vermes são tomadas com ampliação de 2.5X na AE e 8X em FL. Aproxima C, D, F, G e L são 4X a ampliação original.

Representative Results

Movimento ensaios de quantificação Defeitos Movimento

Declínio Movimento é um bom preditor de mortalidade em C. elegans 16, com a diminuição das taxas indicando problemas com o sistema neuromuscular. Alterações na circulação, tal como avaliado por ensaios de movimento, pode resultar de ARNi contra um gene específico ou tratamento da toxicodependência (Figuras 3-5) ou em animais mutantes 13, 23. Um declínio no movimento pode resultar de desenvolvimento alterado por exemplo, após batida de desenvolvimento para baixo de genes de transporte de elétrons que codificam complexo I, III, IV ou V 24. Adicionalmente, as intervenções específicas podem ser testados em adultos apenas C. elegans, a fim de investigar o efeito sobre a fisiologia pós-desenvolvimento. Por exemplo, os animais tratados com o ARNi contra unc-112, que codifica o ortólogo de C. elegans Kindlin-1, que está localizada a integrina contendocomplexos de fixação muscular (Figuras 3 e 4), ou gás-1, que codifica um componente do complexo I da cadeia de transporte de elétrons (Figura 4), ​​apresentar uma redução progressiva no movimento contra o controle 48-72 horas pós-vida adulta. Isto pode ser indicativo de problemas com a fisiologia muscular. De igual modo, uma perda de movimento 24-72 horas é observado em resposta ao tratamento de adultos normalmente desenvolvidos com o tratamento com o inibidor de PI3K LY-294002 (Figura 5). Também é possível testar o efeito de um segundo tratamento de RNAi, mutação, ou de uma droga no restabelecimento da circulação em animais que exibem uma redução do movimento em resposta a uma intervenção inicial. Por exemplo, unc- 112 mutantes exibem uma redução quantificáveis ​​em circulação em comparação com animais de tipo selvagem que é atenuado na presença de uma segunda mutação no dim-1 13. Assim, ensaios de movimento pode identificar ambas as intervenções que alteram neuromuscudesenvolvimento lar e / ou função, bem como aquelas que melhoram e / ou restaurar a função neuromuscular.

Avaliação da Perturbação sarcômero

Tendo identificado um defeito movimento, é muitas vezes desejável para determinar se a causa do defeito movimento pode ser explicado por problemas dentro de nervos, músculo, ou ambos. Sarcômeros são os complexos multi-protéicos dentro do músculo que permitem a contração e, assim, forçar a geração e movimento. Por animais que expressam proteínas de fusão utilizando miosina GFP localizadas ao aparelho contráctil, o grau de perturbação de filamentos de miosina e sarcómeros pode ser observado relativamente não invasiva e prospectivamente em animais individuais através do desenvolvimento e / ou a idade adulta. Do tipo selvagem animais exibir sarcômeros dispostos que aparecem como várias linhas verdes retas paralelas dentro de cada músculo-parede do corpo (Figura 3). A ruptura de estas matrizes normais pode ser relativamente menor comsarcômeros dispostos aparecem para mesclar ao invés de permanecer em paralelo. Este fenótipo, visível com unc-112 RNAi em t = 24 h ou 48 h (Figura 3), é comparável a Z-linha de transmissão de sítios de ligação à actina muscular em mamíferos. Do mesmo modo, as pequenas porções das matrizes podem entrar em colapso ou eles podem desaparecer completamente, tais como o tratamento com unc-112 RNAi em t = 48 h ou t = 72 h (Figura 3). A presença de defeitos sarcômero no interior do músculo de animais que exibem um defeito de circulação (Figura 3) é suficiente para explicar o defeito movimento, mas não necessariamente excluir outros problemas com o músculo, nervo, e / ou em outros tecidos em resposta a uma intervenção .

Avaliação da Estrutura mitocondrial Rede

Na presença de um defeito movimento é por vezes desejável para examinar músculo para outros defeitos que podem causar ou contribuir para o movimento defect. As mitocôndrias fornecer a maior parte da energia celular e declina em movimento pode ser o resultado da disposição de ATP reduzida, reduzindo a energia disponível para a contracção muscular. Assim, a estrutura da mitocôndria podem ser examinados para anormalidades. É importante que não se anestesiar os animais com azida de sódio, uma vez que induz a fragmentação rápida mitocondrial; animais nestas experiências foram imobilizados pela pressão aplicada pelo deslizamento da tampa. Dentro do tipo selvagem C. elegans muscular da parede do corpo, as mitocôndrias estão contidas dentro de redes organizadas (Figura 4) e existem mitocôndrias e funcionam como um retículo 25. O rompimento da rede de mitocôndrias apresenta como fragmentação da rede (gás-1 RNAi, Figura 4B) 26. A fragmentação pode tornar-se grave o suficiente para que nenhuma aparência de redes organizadas permanece como o tratamento com RNAi unc-112 (Figura 4B e C) 13. Como with rupturas na estrutura do sarcômero, defeitos no músculo estrutura mitocondrial em animais que apresentam um defeito movimento pode ser suficiente para dar conta do defeito movimento, mas isso não significa necessariamente descartar outros problemas com músculos, nervos, e / ou outros tecidos. Por exemplo, UNC-112 mutantes 13 e tratamento com UNC-112 RNAi (Figuras 3 e 4) exibição ambos os sarcômeros interrompidas e rompimento da estrutura mitocondrial.

Avaliação da Função Mitocondrial In Vivo

O potencial de membrana mitocondrial determina a capacidade das mitocôndrias para criar a força motriz de protões do ATP e 27 geram, por conseguinte, a capacidade de avaliar o potencial de membrana mitocondrial in vivo indica a capacidade desse animal para a produção de ATP. Como rupturas estruturais mitocondriais podem ou não alterar a capacidade funcional mitocondrial, pode ser desirable para avaliar a função mitocondrial em animais que apresentam a estrutura mitocondrial alterada. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O acumula nas mitocôndrias, de todos os tipos de células, onde um potencial de membrana está presente e manchas da mitocôndria 28 (Figura 4C). Para avaliar especificamente a função mitocondrial no músculo, pode-se usar C 32 H 32 Cl 2 N 2 O e GFP marcado mitocôndrias musculares para demonstrar os efeitos de uma intervenção especificamente sobre mitocôndrias musculares (Figura 4C). Por exemplo, a perda de potencial de membrana mitocondrial de tratamento seguinte com unc-112 RNAi impede C 32 H 32 Cl 2 N 2 O entrem na matriz. As mitocôndrias, por conseguinte, apresentam pouca, se alguma coloração vermelha da mitocôndria para além da rotulagem de mitocôndrias GFP (Figura 4C). Foto-branqueamento também pode ser utilizada para confirmar que o observadomitocôndrias são aqueles especificamente no músculo (Figura 4C). Identificação de uma reduzida capacidade para produzir ATP é suficiente para dar conta de um defeito movimento observado, mas não descarta outros problemas dentro do músculo, nervo, e / ou outros tecidos. Independentemente disso, como a redução da capacidade de produção de ATP está associada com estados de doença em seres humanos 29 e 30 de envelhecimento, a identificação de um tal defeito na resposta a uma intervenção proporciona uma plataforma para o rastreio de compostos e / ou tratamentos de ARNi que melhoram a capacidade de produção de ATP e estes podem, em seguida ser mais explorado para potencial terapêutico.

Avaliação da degradação de proteínas

Na presença de um defeito de movimento e sarcómeros normais e mitocôndrias é por vezes desejável para examinar músculo para outros defeitos que podem causar ou contribuir para o defeito movimento. A capacidade de manter a homeostase de proteína é uma assinatura de nemmal de saúde, enquanto que uma redução na síntese de proteínas e / ou um aumento da degradação de proteínas é uma consequência do envelhecimento 31 e vários estados de doença 32,33. Portanto pode ser desejável para examinar os músculos de animais com um defeito de movimento para a homeostase proteína alterada. Isto pode ser realizado através de avaliação dos níveis de proteínas musculares citosólicas. A utilização de proteínas transgenicamente codificados permite a avaliação de Proteostase específica do músculo. Por exemplo, o uso de animais contendo β-galactosidase, fundida com uma porção N-terminal da miosina, que é sintetizado sob o controlo de um promotor da miosina e potenciador permite a avaliação do teor de proteínas do músculo citosólico 19. A presença de corante azul de tipo selvagem em adultos demonstra a presença de β-galactosidase activa e a ausência de degradação da proteína citosólica patológica. Uma perda de coloração em resposta ao tratamento sugere a degradação da proteína patológica está a ocorrer (Figura 5 13,14,19. Por exemplo, animais de tipo selvagem não tratados exibir uma intensa mancha azul 72 h após a idade adulta, enquanto que LY-249002 animais tratados exibir uma ausência de mancha (Figura 5). Tal como acontece com defeitos na estrutura do sarcômero e função mitocondrial, a presença de degradação de proteína muscular patológico é suficiente para dar conta de um defeito movimento observado, mas não necessariamente descartar outros problemas com músculos, nervos, e / ou outros tecidos.

A Figura 3
Figura 3: (A) unc-112 RNAi provoca um defeito movimento significativo em t = 72 h (B) Avaliação da estrutura A-banda dispostas dentro do músculo da parede do corpo.. Em wt, A-bandas no músculo aparecem como linhas retas no início da vida adulta (t = 0 h) e permanecem em grande parte uniforme até além de 72 horas de vida adulta (ver zoom peso). unc-112 RNAi faz com que os sarcômeros perder arquitetura em pequenas áreas de músculo (t = 24 h), entrou em colapso e sarcômeros em falta (t = 48 h), a agregação (painel superior t = 72 horas e zoom) e perda de linearidade de sarcômeros (painel inferior t = 72 horas e zoom). Barras de escala representam 25 mM e zooms são 2.5X.

Figura 4
Figura 4: (A) unc-112 ou gás-1 RNAi provoca um defeito de circulação (B) Avaliação da estrutura mitocondrial dentro do músculo da parede do corpo.. As mitocôndrias no músculo aparecer linhas retas como em rede na idade adulta jovem (em peso). O tratamento dos animais com unc-112 resulta em RNAi mitochondrfragmentação ial como observado anteriormente entre 24 horas e 72 horas da vida adulta (zooms e flecha) 13. Da mesma forma, RNAi contra gás -1 resulta em fragmentação das redes mitocondriais como observado anteriormente 26. Estes estão presentes como pequenas lacunas na rede mitocondrial em t = 24 horas e progresso para a desorganização generalizada a 72 hr (ver zoom e flecha). (C) Avaliação do potencial de membrana mitocondrial in vivo. Em animais também contendo GFP localizada a mitocôndria, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O acumula na mitocôndria do músculo da parede do corpo e aparece laranja sob um filtro de passagem de triplo da vida adulta (t = 0 horas) até 72 horas após a idade adulta. O tratamento com unc-112 RNAi provoca uma perda progressiva do potencial de membrana, conforme mostrado em 72 h onde as mitocôndrias restantes mostram menos acumulação de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O em peso vs. Fotodegradação de 10 sec usando alvejantes 540/25 nm luz vermelha do MitoTracker e revela a GFP localizada mitocôndrias musculares (+ Foto lixívia). Barras de escala representam 25 mm e zooms são 2.5X.

A Figura 5
Figura 5: (A) O tratamento com LY-294002 animais induz um defeito de movimento (B) Avaliação da degradação de proteínas utilizando um ensaio de β-galactosidase.. Idade sincronizado em peso larvas L1 são cultivadas para a idade adulta a 20 ° C (t = 0 h) antes de transferir para NGM semeada com OP50 (controlo de peso) ou NGM semeada com LY-294002 (tratamento com inibidor de PI3K) durante 24 horas a 20 ° C . Em A, cerca de 20-30 animais estão manchadas de atividade β-galactosidase (azul) em t = 0 horas e após 24 horas, 48 ​​horas e 72 horas.

Discussion

Estes métodos permitem a exploração do músculo do macrophysiology de movimento para identificação de defeitos subcelulares que são suficientes para causar um defeito movimento. Quando combinados estes métodos permitem a análise detalhada do músculo. O conhecimento adquirido permite que mais testes de hipóteses orientada para o músculo que pertencem a fisiologia geral, fisiopatologia e envelhecimento.

Movimento Ensaios

Um defeito movimento indica uma perturbação da função neuromuscular normal. Isto pode ser específico para nervos ou músculos ou que pode ser comum entre os vários tecidos. As fases mais difíceis de completar ensaios movimento está selecionando vermes que são representativas da população e / ou o tratamento, e também garantir que o experimentador não ferir o animal em cima de transferência para M9. É importante ter um tamanho de amostra grande para se obter uma avaliação representativa e precisa do movimento. Quando o ensaio altamente canetaefeitos etrant, por exemplo, como freqüentemente visto em mutantes, uma amostra de dez animais cada avaliado para o movimento dez vezes é suficiente para encontrar diferenças estatisticamente significativas contra o tipo selvagem. No entanto, a simplicidade dos ensaios de circulação e facilidade de cultura de C. elegans significa que centenas de vermes podem ser rapidamente avaliado, a fim de garantir resultados quantitativamente robustos. Ao ensaiar os efeitos que aparecem presente em apenas uma parte de uma população que é importante para determinar qual a proporção da população parece ser afectada, bem como a gravidade dos defeitos nos animais mais afectados. Em tais situações, um maior número de animais deve ser avaliada, a fim de fornecer os dados mínimos para a proporção da população afetada. Frequentemente tanto de drogas e tratamentos de RNAi irá produzir defeitos graves movimento em uma pequena proporção da população. Em alguns casos, o aumento da dose do tratamento e ou o método de entrega irá aumentar a proporção de affected animais e curvas de resposta de dose de corrida pode ser útil para determinar a concentração óptima de um fármaco ou de RNAi. Uma segunda limitação de movimento neste ensaio é que os vermes são manipuladas para avaliar o movimento. Assim, os vermes são ambas estimuladas e submetido a algum grau de stress osmótico quando apanhado em líquido. O grau de stress osmótico pode ser limitada por meio M9 ou BU tampão 19, em oposição à água. Algumas dessas limitações são atenuadas medindo movimento habitual em placas utilizando sistemas de rastreamento disponíveis no mercado 34 ou plug-ins gratuitos para ImageJ 35. Medir a taxa de movimento de um animal pode fornecer informações importantes sobre a saúde geral do músculo, incluindo alterações na função que podem ser medidos ao longo da vida ea não-invasivo deste método é fundamental para futuros estudos da função muscular ao longo da vida.

Imagens do aparato contrátil

<p class = "jove_content"> A tensão verme usado aqui para estrutura aparato contrátil imagem foi PJ727 36 que expressa uma proteína de fusão GFP miosina que está localizada a sarcômeros dentro dos músculos da parede do corpo. O uso deste esforço permite a visualização da estrutura do sarcômero em animais vivos. Semelhante ao ensaio de movimento descrito acima, uma das principais vantagens da utilização de GFP marcada sarcómeros para avaliar estrutura sarcómero é que o método é relativamente não-invasiva e, portanto, pode ser usado para seguir prospectivamente estrutura sarcómero em animais individuais ao longo do tempo de vida. A maior dificuldade com este método é que os vermes que está sendo fotografada ainda estão vivos e, portanto, em movimento, o que torna difícil obter imagens bem focadas. Vários métodos podem ser empregues para reduzir o movimento e fazer imagiologia mais simples; estes incluem anestesiar ou paralisar os vermes e imobilização através de pressão, sucção, ou o uso de uma solução de alta viscosidade. Cada um destes métodos de immobilizção tem a desvantagem de que ele pode-se alterar a função neuromuscular. Portanto, é essencial incluir controlos não tratados na análise apropriados. Também pode ser prudente utilizar, pelo menos, dois métodos independentes de imobilização para confirmar os resultados não são devido a problemas com o método de imobilização, dependendo de como amplamente utilizado o método de imobilização é escolhido para a questão em estudo. Aqui nós usamos simples pressão da lamela sobre o worm para induzir movimento reduzida. Depois de colocar a lamela, o líquido sob a lamela irá evaporar ea lamela, consequentemente, começar a produzir mais pressão sobre os vermes, normalmente isso leva 2-5 min para produzir o suficiente movimento reduzido para permitir a fácil criação de imagens.

É essencial para monitorar estreitamente os vermes após a lamela foi introduzida como a pressão irá, eventualmente, aumentar o suficiente para fazer com que os vermes para rebentar a partir de uma pressão excessiva, tipicamente 10-15 minutos após a coAlém verslip. Tampão adicional pode ser introduzido com o auxílio de uma pipeta de ponta em torno das bordas da lamela para evitar lesão por esmagamento para os vermes. Verniz de unhas pode ser usado para selar as arestas da lamela de cobertura e impedir a evaporação, embora isto evita a recuperação de animais de sob a lamela de cobertura, se desejado. Da mesma forma, a utilização de grânulos de silicone na solução pode ajudar a reduzir a quantidade de pressão que os locais de lamelas sobre os vermes.

Assim como com a avaliação de movimento de um defeito, é importante considerar a penetrância do efeito. Penetrância pode ser considerado alto se 80-100% dos animais apresentam um fenótipo na placa NGM, parcial se 21-79% e de baixo se ≤20% do visor população um afeto. Para efeitos altamente penetrantes, tamanhos de amostra menores podem ser usados ​​para produzir dados quantitativos significativos sobre defeitos sarcômero. Nos casos em que o efeito tem uma penetrância baixa, selecção de animais que exibem um defeito claro movimento em resposta a drogaou tratamento de RNAi pode ser útil no ensaio de defeitos sarcômero na maioria dos animais afectados pelo tratamento. No entanto, não é necessariamente o caso em que a extensão do efeito do tratamento em circulação e da estrutura subcelular é o mesmo. Assim, pode ser desejável para examinar a extensão dos defeitos presentes numa grande população, por exemplo, 100 animais. Isto permite a compreensão da distribuição de defeitos ao longo de uma população. Também pode ser desejável para examinar a extensão do defeito nos animais mais severamente afectados e / ou examinar a correlação entre a extensão da defeito sarcómero e extensão de defeito movimento. As dificuldades potenciais de lado, este método é mais rápido e mais fácil do que outros métodos de avaliação da estrutura do sarcômero. Esta velocidade e facilidade, no entanto, sujeita a uma limitação fundamental, sarcômeros contêm proteínas de fusão GFP não são inteiramente normal 37 e, portanto, a avaliação de sarcômeros interrompido deve ser confirmado utilizando métodos mais intensivos em trabalho adicionais.Estes métodos incluem o uso de luz polarizada 38, phalloidin coloração 39 e 40 de imunofluorescência indireta. Destes métodos, apenas a luz polarizada é relativamente não invasiva; os outros métodos requerem fixação e, por conseguinte, não pode ser utilizado em estudos prospectivos de animais individuais, e elas só podem ser usadas para confirmar, atravessar seccionalmente, os resultados de tais estudos.

Imagens de mitocondriais Networks

A estirpe sem-fim utilizado para as experiências de imagiologia mitocondriais foi CB5600 7 que expressa uma proteína de fusão de GFP localizada na mitocôndria e uma GFP β-galactosidase proteína de fusão localizada para os núcleos, tanto nos músculos da parede do corpo. Tal como acontece com o uso de PJ727 para sarcômeros de imagem, o uso desta estirpe permite a visualização da estrutura de rede mitocondrial em animais vivos. Assim, esta estirpe pode ser utilizada para avaliar alterações dinâmicas que ocorrem, por exemplo, reduzida mitochondrial fusão e / ou aumento de fissão mitocondrial 41. Além disso, como para sarcômeros de imagem, a maior dificuldade com este método é que os vermes sendo fotografada ainda estão vivas e em movimento, o que torna difícil obter imagens bem focadas. Embora vários métodos, como discutido em maior detalhe acima, pode ser empregue para reduzir o movimento, as mitocôndrias parecem ser particularmente sensíveis a intervenções que induzem a circulação reduzida. Por exemplo, o mais geralmente usado anestésicos componentes alvo da cadeia respiratória mitocondrial e são, por conseguinte, deve ser utilizada com precaução em estudos de estrutura normal e função mitocondrial. Do mesmo modo, a maioria dos agentes paralisantes deve ser utilizada com precaução em estudos de estrutura normal e função mitocondrial, tal como a maioria dos agentes paralisantes causar menos sinal para passar através da junção neuromuscular e desnervação funcional do músculo é suficiente para induzir a fragmentação mitocondrial. Os experimentos deste estudo utilizou pressão para imobilizar animaiss, mas outros têm usado com sucesso levamisol 42, embora seja essencial para os animais imagem imediatamente.

Por último, vários contaminantes bacterianos em culturas, por exemplo B. subtilis, pode induzir a fragmentação mitocondrial; Por conseguinte, é essencial incluir controlos não tratados na análise apropriados. Para efeitos altamente penetrantes, tamanhos de amostras menores podem ser utilizados para produzir os dados quantitativos sobre os defeitos significativos de rede mitocondriais. No entanto, devido à prevalência de pequenos defeitos na rede mitocondrial, este pequeno número de animais é provável que seja o dobro do número necessário para a avaliação da estrutura sarcómero. Nos casos em que o efeito tem uma penetrância baixa, a selecção de animais que apresentam claramente um defeito de movimento em resposta a tratamento medicamentoso ou ARNi podem ser úteis no ensaio de defeitos mitocondriais na maioria dos animais afectados pelo tratamento. No entanto, como mencionado acima, não é necessariamente o caso em que omedida do efeito do tratamento em circulação e da estrutura subcelular é o mesmo. Assim, pode ser desejável para examinar a extensão dos defeitos presentes numa grande população, por exemplo 150-200 animais, bem como a extensão da perturbação nos animais mais severamente afectados e da presença ou ausência de extensão da perturbação com a extensão da defeito movimento. Outras estirpes com mitocôndrias marcado por fluorescência pode ser utilizada para confirmar os resultados obtidos em CB5600, contudo, o uso de diferentes proteínas fluorescentes podem influenciar a rede de linha de base das mitocôndrias. Por exemplo, a utilização de uma proteína RFP TOMM-20 de fusão de visualizar as mitocôndrias parece provocar um aumento de fragmentação mitocondrial da linha de base versus a utilização de GFP localizada 17 para as mitocôndrias. Enquanto outros métodos tais como microscopia electrónica de imunofluorescência e pode ser utilizado para avaliar a estrutura mitocondrial, eles não permitem a avaliação in vivo da dinâmica mitocondrial, porque um passo de fixação é exigird. Outros métodos, tais como a utilização de corantes para as mitocôndrias localizadas podem ser utilizados sem fixação e, por conseguinte, também pode ser usado no lugar de utilização de GFP localizada para as mitocôndrias. Como discutido na próxima seção, o uso de tais corantes também permite a avaliação in vivo bruto da função mitocondrial.

Avaliando Membrana Mitocondrial Potencial In Vivo em C. elegans

Uma variedade de corantes estão disponíveis para rotulagem mitocôndrias 28. Esses corantes proporcionam um método alternativo de visualização estrutura de rede mitocondrial em C. elegans vivos. Muitos destes corantes também permitir a avaliação em bruto de funcionalidade mitocondrial in vivo, porque eles se acumulam na mitocôndria com base no potencial de membrana mitocondrial. Aqui nós usamos C 32 H 32 Cl 2 N 2 O que é ingerido através deo tracto digestivo, com alguns adicionalmente entrar no sem-fim através da cutícula por causa da permeabilização proporcionada por ser dissolvido em 0,5% de DMSO. Após a entrada na célula C 32 H 32 Cl 2 N 2 O está oxidado e sequestrado pelas mitocôndrias, onde se liga aminoácidos contendo enxofre (por exemplo, metionina e cisteína). A formação destes complexos de corante-péptido significa C 32 H 32 Cl 2 N 2 O permanece nas mitocôndrias, uma vez marcados 28. Uma dificuldade fundamental com a utilização de corantes mitocondriais é que eles vão rotular todas as mitocôndrias no animal. Por isso temos realizado rotulagem em CB5600, da mesma estirpe acima descrita para avaliação do músculo estrutura de rede mitocondrial. Usando um corante vermelho mitocondrial, uma estirpe de vermes que expressam GFP em mitocôndrias do músculo, e um filtro de passagem de tripla, que é relativamente simples para a imagem apenas mitocôndrias no músculo, encontrando mitocôndrias que são Ogama de co-localização de corante vermelho e mitocôndrias GFP rotulados. O passo mais difícil na realização desta abordagem é co-localização de imagem porque o corante é em segundos sob luz fluorescente de alta intensidade-branqueada foto. Este efeito pode ser limitada, mantendo a fluorescência de baixa potência até que o experimentador está pronto para a imagem e, em seguida, ajustando a intensidade de fluorescência em conformidade. Uma vez que se tem experiência com o uso de corantes outra abordagem é utilizar microscopia confocal com Z-stacks a imagem apenas mitocôndrias no tecido direito; as redes mitocondriais no músculo são bastante distintos em comparação com outros tecidos. Infelizmente, a incapacidade de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O para deixar mitocôndrias 28 significa que, ao contrário das técnicas de sarcômero e imagiologia mitocondrial discutido acima, não pode ser usado para seguir prospectivamente perda da função mitocondrial com o tempo, a menos que C 32 H 32 Cl 2 N 2 Oé adicionado em pontos de tempo discretos para separar populações de animais. Esta limitação pode ser ultrapassada pela utilização de corantes, tais como JC-10 que faz sair a mitocôndria após colapso do potencial 43 de membrana. As mitocôndrias também pode ser isolado a partir de C. elegans 30 para análises bioquímicas subseqüentes. Tal extracção permite a quantificação do potencial de membrana mitocondrial por quantificação da taxa de absorção do corante catiónico lipofílico utilizando citometria de fluxo ou um leitor de placa fluorescente 44. Tendo estabelecido um potencial de membrana mitocondrial prejudicada, também é possível determinar se a perda de gradiente de protões traduz-se numa perda de produção de ATP, utilizando um método à base de luciferase bioluminometric 45 sensível.

Avaliando a degradação de proteínas em C. elegans

A cepa verme usada aqui para avaliar a degradação da proteína muscular foi PD55, que contém uma β específica muscular-galactosidase, que é continuamente ao longo do desenvolvimento sintetizados até à idade adulta é atingido e que permanece estável no citosol para o próximo 72-96 hr 19. Assim, a medição dos níveis de β-galactosidase durante o desenvolvimento predominantemente indica o impacto das intervenções sobre a síntese do promotor miosina enquanto que a perda de β-galactosidase durante a idade adulta indica uma intervenção provocou aumento da degradação da proteína citosólica 19. O passo chave na avaliação da actividade β-galactosidase é eficaz para assegurar a dessecação. Falha eficazmente para desidratar os animais resulta em mau disposição do substrato X-gal e, portanto, pobres cor azul nos músculos da parede do corpo dos animais. Para garantir uma boa dessecação o selo do secador deve ser verificado e, a amostra deve ser verificado em 10/05 minutos de intervalo durante todo dessecação para avaliar o progresso (ou seja, a amostra de 20 l deveria ter secado dentro de 10 minutos e os restantes 20 miné assegurar a dessecação abrangente). O ensaio de β-galactosidase é um ensaio de actividade, por conseguinte, um controlo apropriado é essencial. Além disso, a coloração diminuiu de adultos em uma condição de tratamento relativamente ao controlo não prova de que está a ocorrer a degradação; pelo contrário, indica diminuição da actividade enzimática em resposta ao tratamento. Para confirmar a degradação, mais western blot de trabalho intensivo deve ser concluída contra β-galactosidase 13 e isso permite a degradação de proteínas quantificação em pequenas populações de vermes contados. Densidades banda Western blot pode ser quantificado usando ImageJ 46. Uma outra limitação deste método é que o uso de proteínas transgénicas não informar como alvos para fisiológicas de degradação e para tais respostas hipótese impulsionado western blots proteomic e / ou orientadas devem ser empregues 13. Por último, como a síntese da proteína transgénica utilizada nestes estudos é desligado no início da idade adulta 19 C. elegans muscular; por exemplo, métodos de isótopos estáveis ​​ou radioativos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) Invitrogen M-7512 Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential
DMSO Thermo Scientific 67-63-5
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Na2HPO4 BDH 301584L
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
MgSO4 Sigma M-7506
Microscopy Slides Starfrost K220
Microscopy Cover Slips VW2 International 631-0124
1.5 ml Eppendorph Tubes Fisher Scientific FB74031
Dessicator Nalgene D2672
Nikon Microscope Nikon H600L Nikon H600L microscope with proprietary software
Nikon Camera Nikon DS-Fi1 Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera 
Zeiss Microscope Zeiss Ax10 Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter
Plates 9 cm Starstedt 82-1473
Plates 6 cm Gosselin BP53-01
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich 14459-95-1 
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Na3PO4 Sigma-Aldrich 7601-54-9
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside Sigma-Aldrich 7240-90-6 
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 68-12-2 

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References

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