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Biology

Méthodes d'évaluation de Subcellular compartiments de muscle en Published: November 13, 2014 doi: 10.3791/52043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MRC/ARUK Centre for Musculoskeletal Ageing Research, University of Nottingham

Summary

Le muscle squelettique est essentiel pour la locomotion et est le principal magasin de protéine de corps. mesures de santé musculaire dans C. elegans sont décrits. Changements éventuels à la structure et la fonction musculaire sont évalués à l'aide GFP localisée et colorants cationiques.

Abstract

Le muscle est un tissu dynamique qui répond aux changements dans la nutrition, l'exercice et l'état de la maladie. La perte de la masse musculaire et la fonction de la maladie et l'âge sont les charges publiques importantes pour la santé. Nous comprenons actuellement peu de choses sur la régulation génétique de la santé des muscles de la maladie ou de l'âge. Le nématode C. elegans est un modèle établi pour la compréhension de la régulation génomique des processus biologiques d'intérêt. Les muscles de la paroi du corps de ce ver affichent un grand degré d'homologie avec les muscles des espèces de métazoaires plus élevés. Etant donné que C. elegans est un organisme transparent, la localisation de la GFP à la mitochondrie et sarcomères permet la visualisation de ces structures in vivo. De même, l'alimentation des animaux des colorants cationiques, qui accumulent basé sur l'existence d'un potentiel de membrane mitochondriale, permet l'évaluation de la fonction mitochondriale in vivo. Ces méthodes, ainsi que l'évaluation de la protéine de muscle Homeostasis, sont combinées avec la fonction d'évaluation de l'ensemble des muscles des animaux, sous la forme de dosages de déplacement, afin de permettre la corrélation des défauts sous-cellulaires avec les mesures fonctionnelles de la performance musculaire. Ainsi, C. elegans fournit une puissante plate-forme permettant d'évaluer l'impact des mutations, knockdown de gènes, et / ou des composés chimiques sur la structure et la fonction musculaire. Enfin, comme la GFP, les colorants cationiques, et les analyses de mouvement sont évalués de manière non invasive, des études prospectives de la structure et de la fonction musculaire peuvent être menées sur l'ensemble du cycle de vie et ce à l'heure actuelle ne peuvent pas être facilement étudiés in vivo dans tout autre organisme.

Introduction

Le muscle est un tissu multifonctionnel, très apprécié pour son rôle dans la locomotion, soutien postural et le métabolisme. Le développement et l'entretien des muscles en bonne santé nécessite la coordination de plusieurs processus et de composants cellulaires. Soit par des dommages ou maladie, dérèglement peut se produire, entraînant dans la structure et / ou la fonction musculaire altérée. déclin lié à l'âge dans la fonction musculaire présente une charge importante pour les budgets des soins de santé dans le monde occidental, depuis la masse musculaire 1,2 et en particulier de la force musculaire et l'endurance 3-5 sont corrélés négativement avec la mortalité. La mesure des aspects liés à la détérioration de la fonction musculaire comme la fonction mitochondriale modifiée ou perturbation du sarcomère, peut permettre une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent les développement musculaire global et la santé.

Elegans C aenorhabditis (C. elegans) est un microscopiques bes de nématodest connu parce qu'il a été le premier organisme multicellulaire d'avoir l'ensemble de son génome a été séquencé 6, le premier à avoir des gènes au silence en utilisant l'ARNi 7, et le seul à avoir des métazoaires toute sa lignée cellulaire 8 et 9 neuroanatomie déterminé. C. elegans a été proposée comme un modèle pour l'étude du contrôle génétique du comportement en 1974 par Sydney Brenner 10 et l'importance de ce travail et la suite a été reconnu avec la première des trois prix Nobel attribués à C. elegans chercheurs. Environ 35% des gènes de C. elegans ont identifié orthologues chez l'homme, avec C. elegans est un organisme clé utilisée pour comprendre le contrôle génétique du développement musculaire 11. Presque chaque gène dans le génome de C. elegans peut être renversé par ARNi 7,12. Ainsi, en abattant des gènes dans le muscle pleinement développé, les composants génétiques contribuer à la remisegulation de la santé des muscles peut être étudiée avec simplicité relative 13.

La capacité combinée d'utiliser l'ARNi, des mutants et des composés chimiques permet de C. elegans un système de choix pour explorer la régulation génétique 7,14,15 de la structure et de la fonction musculaire avec 16 ans et dans les modèles de la maladie 17. L'impact de l'effet de choc de gène, mutation et / ou l'exposition à des composés chimiques sur la structure et / ou la fonction des muscles peut être mesurée par plusieurs aspects. Ici, nous décrivons brièvement des techniques simples pour l'évaluation de C. elegans la structure musculaire et la fonction, dont beaucoup peuvent être utilisés dans des études prospectives de la santé des muscles.

Le développement de la protéine fluorescente verte (GFP) 18 a permis la visualisation à la fois de la localisation de protéines spécifiques et la structure générale des organites chez C. elegans. Nous expliquons ici comment GFP exprimé spécifiquequement à l'intérieur de corps mitochondries paroi musculaire, des noyaux ou des sarcomères peuvent être utilisés pour déterminer si la dystrophie de ces structures sous-cellulaires est présent. Comme la structure est pas toujours un substitut fiable pour fonction, nous expliquons aussi comment l'évaluation du potentiel de membrane mitochondriale altérée dans le muscle de l'utilisation de colorants cationiques in vivo permet. Quand les colorants sont utilisés en combinaison avec la GFP, ils permettent l'étude de l'architecture et le fonctionnement d'une manière tout au long de la durée de vie temporelle. Enfin, nous expliquons aussi comment homéostasie protéique dans le muscle peut être évaluée et comment toutes ces mesures peuvent être utilisées pour établir une corrélation entre les changements dans l'ensemble de la santé des muscles des animaux via l'utilisation de tests de mouvement. Ces techniques, combinées avec knock-down de gènes, de mutations et / ou des composés chimiques fournissent un arsenal puissant pour étudier la façon dont les gènes ou les composés spécifiques influent sur ​​la santé de muscle in vivo. Les parallèles de la structure, le métabolisme et la fonction du muscle brut entre C. elegans etmammifères signifient C. elegans est un organisme modèle exceptionnel pour la compréhension de la régulation de muscle dans les organismes supérieurs, y compris les humains.

Protocol

1. souches, de la Culture, et Microscopie

  1. Manipuler et à entretenir des souches de C. elegans comme décrit précédemment 19. Les souches sont disponibles sur le Centre de Génétique Caenorhabditis (CCG).
    NB: Les souches utilisées dans ces expériences étaient CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3-lacZ :: NGFP; Pmyo-3 :: Mtgfp) I; lui-8 (e1489 IV)) avec des protéines de fusion GFP localisées aux mitochondries et des noyaux; PJ727 (jls01 (myo-3 :: GFP, rol-6 (su1006)); unc-54 :: lacZ V) avec des protéines de fusion GFP localisée à l'appareil contractile et PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5); unc- 54 :: lacZ) V) avec β-galactosidase des protéines de fusion localisées dans le cytosol.
  2. Expériences ARNi complet tel que décrit précédemment pour les expériences de RNAi plusieurs générations 13 et obtenir bactéries ARNi de la séquence vérifiées bibliothèque ORF-ARNi construit par Marc Vidal et al. 12.
  3. Construire des souches contenant <em> CCIS 4251, jls01 ou CCI 55 en utilisant des techniques standard de 20. Utilisez ces transgènes pour créer une souche à évaluer la structure du réseau mitochondrial, l'organisation de la myosine ou l'état de protéostasie, respectivement. Centre des souches dans un mutant dans lequel la recherche à l'un de ces compartiments sous-cellulaires dans chaque animal est souhaitée.
  4. Utilisation de l'inhibiteur PtdIns-3-kinase, LY-294002 (LY) comme 21 précédemment décrit. En bref, ajouter LY-294002 à une concentration finale de 160 uM au-dessus de plaques sèches de OP50 tête de série NGM.
  5. Capturer les images en utilisant un filtre de GFP pour les expériences à base de GFP et un microscope avec un filtre passe triple qui permet l'imagerie des canaux rouge, vert et bleu en même temps pour l'évaluation in vivo du potentiel de membrane dans de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, communément commercialisé sous le MitoTracker Red CMXRos. Effectuer une analyse de l'image et la préparation des figures dans le logiciel de traitement d'image.

  1. Un minimum de 1 jour avant nécessaire, faire tampon M9 - 22.04 mM KH 2 PO 4, 42,27 mM Na 2 HPO 4, NaCl 85.56 (Les concentrations finales), et stériliser à l'autoclave. Une fois refroidi à 45 ° C, ajouter stérile MgSO 4 à 1 mm après passage à l'autoclave pour 22 empêcher la précipitation. Laisser refroidir le M9 à 4 ° C et aliquote dans des tubes de 50 ml.
  2. Le jour de l'expérience, ajouter 3 ml de tampon M9 à une seule plaque de 9 cm avec un grand nombre de larves L1. Laver la plaque à plusieurs reprises par l'aspiration du liquide M9 et pipetage contre la surface de l'agar-agar avec la plaque maintenue à un angle.
  3. Laver les L1 de de la plaque, puis transférer le M9 dans un tube à essai de 10 ml à l'aide d'une pipette.
  4. Laisser pendant 2,5 minutes pour permettre à la plus grande des adultes et animaux au stade larvaire ultérieures de tomber au fond du tube à essai et les animaux de L1 plus petits restent près de la top de la mémoire tampon M9.
  5. Retirez les 500 premières ul de M9 dans le tube à essai avec une pipette. Puis ajouter le M9 contenant des larves L1 à une nouvelle plaque NGM ensemencé avec 500 pi OP50 sous un microscope à dissection.
  6. En règle générale, visant à transférer ~ 200-300 larves L1 par plaque. Surveiller les plaques quotidiennement à partir de l'âge adulte et, si nécessaire, enlèvement des animaux sur des plaques NGM OP50 fraîches pour empêcher source de nourriture consommée OP50.
    Remarque: il est généralement de 1 à 3 gouttes de M9 à l'aide d'une pipette P1000, bien que cela varie en grande partie en fonction du nombre de L1 de la plaque d'origine.
  7. Si des études prospectives sur des animaux individuels sont souhaitées, une fois les animaux atteignent l'âge adulte, choisir des animaux individuels de séparer les plaques NGM graines. animaux de transfert chaque 24-48 h pour séparer des animaux larvaires.

3. Mouvement dosages 19

  1. Un minimum de 2 heures avant le début de l'expérimentation, retirez 50 ml aliquote de M9 et ramener à la température ambianterature.
  2. Choisissez un animal adulte seul dans le tampon M9 de 50 pi sur une lame de microscope.
  3. Comptez le nombre de courbes du corps gauche et vers la droite en 10 sec, où un à gauche et un coude vers la droite est égale à un accident vasculaire cérébral.
  4. Répétez le nombre de coups de corps pour donner un total d'au moins 5 mesures à partir de laquelle une moyenne peut être prise. Multipliez ces chiffres par six pour donner le taux de mouvement par minute.
  5. Avec une pipette, transférer le dos de l'animal à la boîte de Pétri. Cette méthode permet de mesurer le temps de mouvement tout au long de la durée de vie en C. elegan s.

Figure 1
Figure 1: tests de mouvement. Une fois que les vers sont pris en tampon, une vers la gauche (A) et une droite (B) courbure sont additionnées pour donner un mouvement complet(Accident vasculaire cérébral).

4. Imagerie de mitochondriales Réseaux et sarcomères dans le muscle du corps mur

  1. REMARQUE: Le même protocole applique pour l'imagerie à la fois les mitochondries et sarcomères.
  2. Synchroniser vers tel que décrit précédemment (section 1) et pousser pour 48-60 h à 20 ° C quand ils atteindront l'âge adulte.
  3. Choisissez 20 vers (représentatives de la plaque) des plaques dans 20 ul M9 sur une lame de microscope.
  4. Appliquer une lamelle et procéder à l'image en utilisant un microscope à fluorescence sous un filtre de la GFP (460-500 nm, bleu clair excitation) à un grossissement de 40X.

5. Évaluer le potentiel de membrane à l'aide d'une accumulation essai in vivo avec MitoTracker Rouge CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O)

  1. Synchroniser CB5600 (Section 1), tous étiquetés avec la GFP dans les mitochondries des muscles, et de grandir à l'âge adulte sur NGM contenant OP50 pour 48-60 h à 20 ° C.
  2. Ajouter 100 ul DMSO à l'aliquote de 50 mg de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O pour obtenir une solution stock de 940,692 uM.
  3. Prendre 1 pl de la solution mère de 940,692 uM et remettre en suspension dans 199 ul M9 pour créer une solution de travail de 4,70 uM (4,70346 pm). Préparer cette brune en tubes de 1,5 ml car C 32 H 32 Cl 2 N 2 O est photosensible.
  4. Préparer aliquotes de 20 pi de 4,70 uM solution (20 vers adultes par 20 pi aliquote) de travail.
  5. 20 Choix des animaux adultes dans 20 pl de 4,70 uM C 32 H 32 Cl 2 N 2 O dans des tubes de 1,5 ml brun. Incuber à 20 ° C pendant 1 heure.
  6. Après l'incubation de 1 heure, ajouter 1 ml M9 pour les brunes tubes de 1,5 ml contenant les vers, centrifuger à 2000 g pendant 10 secondes, puis éliminer le surnageant. Répétez cette étape de lavage avant de remettre en suspension le culot de ver et de transférer les 20 restants μl (contenant les vers) à une diapositive pour l'imagerie.
  7. Prendre des images de la mitochondrie avec un grossissement de 40X en utilisant un filtre passe triple qui permet la visualisation à la fois des canaux rouge, bleu et vert simultanément. L'imagerie en utilisant le filtre passe-montre triple co-localisation de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O avec GFP localisée aux mitochondries apparaissant comme orange.
  8. Ayant pris une image de la mitochondrie orange, photo-blanchiment de l'animal pendant 10 secondes en utilisant la lumière de longueur d'onde 540/25 nm sur les réglages maximum avec tous les filtres retirés. Cela blanchir le rouge dans les mitochondries et de révéler la GFP mitochondrial seul à confirmer colocalisation dans les mitochondries musculaires.

6. Évaluation de la dégradation des protéines musculaires chez C. elegans

  1. Synchroniser PD55s (ou toute souche contenant le transgène LacZ) sur des plaques NGM ensemencé avec OP50 (Section 1). Grandir à l'âge adulte pour 48-60 h à 20 ° C.
  2. Choisissez 20 vers adultes dans 20 ul ddH 2 O sur une lame de microscope. Veillez à essayer et choisir seulement le ver et non les bactéries avec le choix. Étiqueter la lame de microscope au crayon.
  3. Placez dans le dessiccateur pendant 30 min à sécher et craquer la cuticule des animaux. Assurer l'étanchéité sur le dessiccateur avec de la graisse autour du joint.
  4. Vérifiez la dessiccation a été efficace sous un microscope à dissection (figure 2).
  5. Plonger la lame de microscope dans l'acétone glacée pendant 3,5 min, puis quittent la lame de microscope sur une serviette en papier à la température ambiante pendant 15 minutes pour permettre à l'acétone sur la diapositive à évaporer. A ce stade, dégeler le tampon de X-gal et de l'oxydation et de permettre l'équilibrage de la température ambiante.
  6. Ajouter 2 pi X-gal à 100 pi de tampon d'oxydation et vortex doucement pour assurer ce soit homogène. Ceci est le maître de tampon mélange X-gal / oxydation.
  7. Ajouter 20 ul du maître de tampon mélange X-gal / oxydation de chaque ozone riginal de 20 vers. Inspectez sous un microscope à dissection pour assurer le mélange maître couvre complètement tous les animaux totalement. Inclinez doucement la lame de microscope pour déplacer le mélange maître sur les zones où les animaux ne sont pas couverts.
  8. Placer la lame de microscope dans une chambre humide pendant 1 à 2,5 h à 20 ° C. animaux d'image quand une couleur bleu foncé est présent dans les muscles de la paroi de corps d'animaux de contrôle. Évaluer les animaux de contrôle sous un microscope à dissection toutes les 15 minutes afin de déterminer si les animaux doivent être imagés.

Figure 2
Figure 2: Evaluation de la dégradation des protéines musculaires en utilisant des essais β-galactosidase. (A) Les animaux contenant un transgène lacZ sont cueillis à partir des boîtes de Pétri de 20 ul trou DDH 2 O sur une lame de microscope (B). Les animaux sont desséchés et deviennent fracturé (D). Une fois l'acétone évapore le maître de tampon mélange X-gal / oxydation est ajouté (e). Le développement de la couleur bleue dans les animaux témoins est évaluée à des intervalles de 15 min (FL) à partir de t = 0 min (F) jusqu'à ce qu'une couleur bleu foncé est obtenue sur toute la longueur des animaux (L). Images de vers sont prises à 2,5x en AE et 8X en Floride. Zoom avant C, D, F, G et L sont 4X le grossissement d'origine.

Representative Results

Mouvement essais pour quantifier les défauts Mouvement

déclin du mouvement est un bon prédicteur de la mortalité en C. elegans 16, avec des taux indiquant des problèmes avec le système neuromusculaire diminué. Changements dans le mouvement, comme évalué par des tests de mouvement, peuvent résulter de l'ARNi contre un gène spécifique ou un traitement médicamenteux (figures 3-5) ou chez les animaux mutants 13, 23. Une baisse de mouvement peut résulter d'un développement altéré par exemple suite à coup vers le bas du développement des gènes de transport d'électrons codant complexe I, III, IV ou V 24. En outre, des interventions spécifiques peuvent être testés que sur des adultes de C. elegans pour étudier l'effet sur ​​la physiologie post-développement. Par exemple, les animaux traités avec l'ARNi contre unc-112, qui code pour le C. elegans orthologue de Kindlin-1 qui est localisée à l'intégrine contenantcomplexes de fixation musculaire (figures 3 et 4), ou gaz-1, qui code pour un composant de complexe I de la chaîne de transport d'électrons (Figure 4), affichent une diminution progressive de mouvement par rapport au contrôle de 48 à 72 heures après l'âge adulte. Cela peut être le signe d'un problème avec la physiologie des muscles. De même, une perte de mouvement 24 à 72 heures est observée en réponse au traitement d'adultes normalement développés avec le traitement avec l'inhibiteur de PI3K LY-294002 (Figure 5). Il est également possible de tester l'effet d'un second traitement d'ARNi, d'une mutation ou d'un médicament dans le rétablissement de mouvement dans les animaux présentant réduit mouvement en réponse à une intervention initiale. Par exemple, les mutants 112 unc- présentent une réduction quantifiable en mouvement par rapport aux animaux de type sauvage qui est atténuée en présence d'une seconde mutation dans une dim-13. Par conséquent, des tests de mouvement peuvent identifier les interventions qui modifient neuromuscudéveloppement de LAR et / ou de la fonction ainsi que ceux qui améliorent et / ou restaurer la fonction neuromusculaire.

Évaluation des Sarcomère perturbation

Après avoir identifié un défaut de circulation, il est souvent souhaitable de déterminer si la cause du défaut de circulation peut être expliqué par des problèmes dans les nerfs, les muscles, ou les deux. Sarcomères sont les complexes multi-protéines dans les muscles qui permettent la contraction et donc la génération de forces et de mouvements. En utilisant des animaux exprimant la myosine protéines de fusion GFP localisée à l'appareil contractile, l'ampleur de la perturbation de filaments de myosine et de sarcomères peut être observée relativement non invasive et de façon prospective dans des animaux individuels par le développement et / ou à l'âge adulte. Animaux de type sauvage affichent sarcomères disposés en réseau qui apparaissent comme de multiples verts droites parallèles au sein de chaque muscle tégument (figure 3). Perturbation de ces tableaux normaux peut être relativement mineursarcomères disposés apparaissant à fusionner plutôt que de rester en parallèle. Ce phénotype, visible avec unc-112 ARNi à t = 24 h ou 48 h (Figure 3), est comparable à Z en ligne en streaming des sites de fixation de l'actine dans le muscle des mammifères. De même, les petites parties des matrices peuvent réduire ou ils peuvent disparaître complètement comme un traitement avec unc-112 ARNi à t = 48 h ou t = 72 h (Figure 3). La présence de défauts de sarcomère dans le muscle des animaux qui présentent un défaut de mouvement (Figure 3) est suffisante pour expliquer le défaut de mouvement, mais ne règle pas nécessairement d'autres problèmes avec le muscle, nerf, et / ou d'autres tissus en réponse à une intervention .

Évaluation de la structure mitochondriale réseau

En présence d'un défaut de mouvement, il est parfois souhaitable d'examiner muscle pour les autres défauts qui peuvent causer ou contribuer au mouvement deparfaite. Les mitochondries fournissent l'essentiel de l'énergie cellulaire et diminue en mouvement peut être le résultat de la prestation ATP réduit, ce qui réduit l'énergie disponible pour la contraction musculaire. Ainsi, la structure des mitochondries peut être examinée pour les anomalies. Il est important de ne pas anesthésier les animaux avec de l'azoture de sodium comme il induit la fragmentation mitochondriale rapide; dans ces expériences, les animaux ont été immobilisées par la pression appliquée par la lamelle couvre-objet. Dans de type sauvage de C. elegans corps paroi musculaire, les mitochondries sont contenues dans des réseaux organisés (Figure 4) et les mitochondries exister et de fonctionner comme un réticulum 25. Perturbation du réseau des mitochondries présente comme la fragmentation du réseau (gaz-1 ARNi, figure 4B) 26. La fragmentation peut devenir suffisamment grave qu'aucun semblant de réseaux organisés reste comme un traitement avec unc-112 ARNi (figure 4B et C) 13. Comme wie perturbations dans la structure du sarcomère, des défauts dans la structure musculaire mitochondriale chez les animaux qui présentent un défaut de mouvement peuvent être suffisants pour expliquer le défaut de mouvement, mais cela ne règle pas nécessairement d'autres problèmes avec les muscles, les nerfs, et / ou d'autres tissus. Par exemple, UNC 112 mutants 13 et traitement à l'UNC-112 ARNi (figures 3 et 4) affichage deux sarcomères perturbé et perturbé la structure mitochondriale.

Évaluation de la fonction mitochondriale in vivo

Le potentiel de la membrane mitochondriale détermine la capacité des mitochondries pour créer une force motrice protonique et de générer de l'ATP 27, donc la possibilité d'évaluer le potentiel de la membrane mitochondriale in vivo indique que la capacité de l'animal à produire de l'ATP. Comme perturbations structurelles mitochondriales peuvent ou ne peuvent pas modifier la capacité fonctionnelle des mitochondries, il peut être desirable pour évaluer la fonction mitochondriale chez les animaux présentant la structure mitochondriale modifiée. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O accumule dans les mitochondries, de tous les types de cellules, où un potentiel de la membrane est présent et colore les mitochondries 28 (figure 4C). Pour évaluer plus précisément la fonction mitochondriale dans le muscle, on peut utiliser C 32 H 32 Cl 2 N 2 O et GFP étiqueté mitochondries à démontrer les effets d'une intervention spécifique sur mitochondries (figure 4C). Par exemple, la perte du potentiel de membrane mitochondriale traitement suivant avec unc-112 empêche l'ARNi C 32 H 32 Cl 2 N 2 O de pénétrer dans la matrice. Les mitochondries montrent donc peu ou pas de coloration rouge de la mitochondrie, en plus du marquage des mitochondries de la GFP (Figure 4C). Photo-blanchiment peut également être utilisé pour confirmer que le observéles mitochondries sont ceux spécifiquement dans le muscle (figure 4C). Identification d'une réduction de la capacité à produire de l'ATP est suffisant pour rendre compte d'un défaut de mouvement observé mais ne préjuge pas d'autres problèmes dans les muscles, les nerfs, et / ou d'autres tissus. Indépendamment, de la réduction des capacités de production de l'ATP est associée à des états pathologiques chez l'homme 29 et vieillissement 30, l'identification d'un tel défaut de réponse à une intervention fournit une plate-forme pour le criblage de composés et / ou des traitements ARNi qui améliorent la capacité de production d'ATP et ceux-ci peuvent alors être davantage explorées pour un potentiel thérapeutique.

L'évaluation de la dégradation des protéines

En présence d'un défaut de mouvement et sarcomères et des mitochondries normales, il est parfois souhaitable d'examiner muscle pour les autres défauts qui peuvent causer ou contribuer au défaut de mouvement. La capacité de maintenir l'homéostasie protéique est une signature de nisanté mal, alors qu'une réduction de la synthèse des protéines et / ou une augmentation de la dégradation des protéines est une conséquence du vieillissement 31 et de multiples états pathologiques 32,33. Par conséquent, il peut être souhaitable d'examiner muscles des animaux avec un défaut de déplacement de l'homéostasie de la protéine modifiée. Ceci peut être réalisé par l'intermédiaire de l'évaluation des niveaux de protéines musculaires cytosoliques. L'utilisation de protéines codées par voie transgénique évaluation de muscle spécifique permet protéostasie. Par exemple, l'utilisation des animaux contenant des β-galactosidase, fusionné à une portion N-terminale de la myosine, qui est synthétisée sous le contrôle d'un promoteur de la myosine et l'amplificateur évaluation de muscle cytosolique teneur en protéine de 19 le permet. La présence de taches bleu chez les adultes de type sauvage démontre la présence de β-galactosidase active et l'absence de dégradation pathologique de la protéine cytosolique. Une perte de coloration en réponse à un traitement suggère la dégradation des protéines se produit pathologique (Figure 5 13,14,19. Par exemple, non traités les animaux de type sauvage montrent une intense coloration bleue 72 ​​heures après l'âge adulte, alors que LY-249002 animaux traités présentent un manque de tache (Figure 5). Comme des défauts dans la structure du sarcomère et la fonction mitochondriale, la présence de pathologique dégradation des protéines musculaires est suffisante pour prendre en compte un défaut de mouvement observé mais ne règle pas nécessairement d'autres problèmes avec les muscles, les nerfs, et / ou d'autres tissus.

Figure 3
Figure 3: (A) unc-112 RNAi provoque un défaut de mouvement significatif à t = 72 h (B) l'évaluation de la structure vêtu A-bande dans la paroi du corps musculaire.. Dans wt, A-bandes dans le muscle apparaissent en lignes droites à l'âge adulte (t = 0 h) et restent en grande partie uniforme jusqu'à au-delà de 72 heures de l'âge adulte (voir zoom en poids). unc-112 RNAi provoque les sarcomères à perdre l'architecture dans de petites zones de le muscle (t = 24 h), effondré et sarcomères manquantes (t = 48 h), l'agrégation (panneau supérieur t = 72 h et zoom) et la perte de la linéarité de sarcomères (panneau inférieur t = 72 h et zoom). Barres d'échelle représentent 25 pm et zooms sont 2.5X.

Figure 4
Figure 4: (A) unc-112 ou gaz-1 RNAi provoque un défaut de mouvement (B) l'évaluation de la structure mitochondriale dans la paroi du corps musculaire.. Les mitochondries dans le muscle semble lignes droites comme en réseau à l'âge adulte (poids). Traitement des animaux avec unc-112 RNAi entraîne mitochondrfragmentation ial comme précédemment observée entre 24 h et 72 h de l'âge adulte (zooms et flèche) 13. De même, l'ARNi contre gaz -1 résultats dans la fragmentation des réseaux mitochondriaux comme précédemment observé 26. Ils sont présents sous forme de petites lacunes dans le réseau mitochondrial à t = 24 h et le progrès de la désorganisation généralisée à 72 h (voir zoom et flèche). (C) Évaluation du potentiel de membrane mitochondriale in vivo. Chez les animaux contenant également GFP localisée à la mitochondrie, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O accumule dans les mitochondries des muscles de la paroi du corps et apparaît en orange sous un filtre passe triple de l'âge adulte (t = 0 h) jusqu'à 72 heures après l'âge adulte. Le traitement par unc-112 RNAi entraîne une perte progressive du potentiel de membrane comme indiqué à 72 heures où les mitochondries restantes montrent moins d'accumulation de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O vs poids. Photobleaching pour 10 SEc à l'aide des agents de blanchiment 540/25 nm de lumière rouge de la MitoTracker et révèle la GFP localisée à mitochondries (+ de blanchiment photo). Barres d'échelle représentent 25 um et zoome sont 2.5X.

Figure 5
Figure 5: (a) le traitement avec LY-294002 animaux induit un défaut de mouvement (B) l'évaluation de la dégradation des protéines en utilisant un test β-galactosidase.. Âge synchronisée poids larves L1 sont cultivées à l'âge adulte à 20 ° C (t = 0 h) avant le transfert à NGM ensemencé avec OP50 (contrôle de poids) ou NGM ensemencé avec LY-294002 (traitement inhibiteur de PI3K) pendant 24 heures à 20 ° C . En A, environ 20-30 animaux sont colorés pour l'activité β-galactosidase (bleu) à t = 0 h et après 24 h, 48 h et 72 h.

Discussion

Ces méthodes permettent l'exploration du muscle à partir de la macro-physiologie de mouvement pour identifier les défauts sous-cellulaires qui sont suffisantes pour provoquer un défaut de mouvement. Lorsqu'il est combiné ces méthodes permettent une analyse détaillée de muscle. L'idée acquise permet en outre de tester des hypothèses orienté muscles qui se rapportent à la physiologie générale, la physiopathologie et le vieillissement.

Mouvement Essais

A défaut de mouvement indique une perturbation de la fonction neuromusculaire normale. Ce peut être spécifique à des nerfs ou des muscles ou il peut être commun entre plusieurs tissus. Les étapes les plus difficiles de l'achèvement des essais de mouvement sélectionnent vers qui sont représentatifs de la population et / ou le traitement, et veillant à ce que l'expérimentateur ne blesse pas l'animal au moment du transfert à M9. Il est important d'avoir une grande taille de l'échantillon pour obtenir une évaluation précise et représentative de mouvement. Lorsque le dosage hautement styloeffets etrant, par exemple comme fréquemment observés chez les mutants, une taille de dix animaux de chaque échantillon évalué pour le mouvement dix fois est suffisant pour trouver des différences statistiquement significatives par rapport à de type sauvage. Cependant, la simplicité des tests de mouvement et de facilité de mise en culture de C. elegans signifie que des centaines de vers peuvent être rapidement évaluées afin de garantir des résultats quantitativement robustes. Lorsque les effets qui apparaissent présente dans seulement une partie d'une population de dosage, il est important de déterminer quelle proportion de la population semble être affectée ainsi que la gravité de l'anomalie chez les animaux les plus touchés. Dans de telles situations grand nombre d'animaux devraient être évalués afin de fournir les données minimales pour la proportion de la population touchée. Foire à la fois drogue et traitements ARNi se produire de graves anomalies de mouvement dans une petite proportion de la population. Dans certains cas, l'augmentation de la dose du traitement et ou la méthode d'administration va augmenter la proportion d'afféchies animaux et des courbes de réponse de dose en cours d'exécution peut être utile pour déterminer la concentration optimale d'un médicament ou d'ARNi. Une deuxième limite de cet essai de mouvement est que les vers sont manipulés pour évaluer le mouvement. Ainsi, les vers sont à la fois stimulés et soumis à un certain degré de stress osmotique quand ramassé en liquide. Le degré de stress osmotique peut être limitée en utilisant M9 ou BU tampon 19 par opposition à l'eau. Certaines de ces limitations sont atténués par la mesure de mouvement habituel sur des plaques en utilisant des systèmes de suivi disponibles dans le commerce 34 ou plug-ins gratuits pour ImageJ 35. Mesurer le taux d'un animal de mouvement peut fournir des informations importantes concernant la santé musculaire globale, y compris les changements dans la fonction qui peut être mesurée tout au long de la durée de vie et la non-invasif de cette méthode est la clé pour les études long de la vie potentiels de la fonction musculaire.

Imagerie de l'appareil contractile

<p class = "jove_content"> La souche utilisée ici à vis sans fin à structure d'appareil de prise de contractile était PJ727 36 qui exprime une protéine de fusion GFP de la myosine qui est localisé à l'intérieur de sarcomères les muscles de la paroi du corps. L'utilisation de cette souche permet la visualisation de la structure du sarcomère chez les animaux vivants. Comme pour le dosage de mouvement décrit ci-dessus, un avantage important de l'utilisation de GFP étiqueté sarcomères pour évaluer la structure du sarcomère est que la méthode est relativement non invasive et peut donc être utilisé pour suivre la structure du sarcomère prospective dans chaque animal tout au long de la durée de vie. La plus grande difficulté de cette méthode est que les vers qui imagées sont encore en vie et en mouvement donc, ce qui rend difficile d'obtenir des images bien ciblées. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour réduire le mouvement et faire l'imagerie simple; agit notamment anesthésier ou paralyser les vers et immobilisation par pression, aspiration, ou l'utilisation d'une solution de haute viscosité. Chacune de ces méthodes de immobilization présente l'inconvénient qu'il peut lui-même modifier la fonction neuromusculaire. Par conséquent, il est essentiel d'inclure des témoins non traités appropriés dans l'analyse. Il peut également être prudent d'utiliser au moins deux méthodes indépendantes d'immobilisation pour confirmer les résultats ne sont pas dus à des problèmes avec la méthode d'immobilisation, selon la façon dont largement utilisé la méthode d'immobilisation choisi est de la question à l'étude. Ici, nous avons utilisé une simple pression de la lamelle sur le ver à induire mouvement réduite. Après avoir placé la lamelle, le liquide sous la lamelle sera s'évaporer et la lamelle sera donc commencer à produire plus de pression sur les vers, généralement cela prend 2-5 min à produire suffisamment de mouvement réduit pour permettre l'imagerie facile.

Il est essentiel de surveiller étroitement les vers après la lamelle a été présenté comme la pression finira par augmenter suffisamment pour que les vers d'éclater de pression excessive, généralement 10-15 min après coOutre verslip. Tampon supplémentaire peut être introduite à l'aide d'une pipette sur les bords de la lamelle pour éviter l'écrasement des blessures aux vers. Vernis à ongles peut être utilisé pour sceller les bords de la lamelle et éviter l'évaporation, bien que cela empêche la récupération des animaux sous la lamelle, si désiré. De même, l'utilisation de billes de silicone dans la solution peut aider à réduire la quantité de pression les places de lamelle sur les vers.

Tout comme avec l'évaluation d'un défaut de mouvement, il est important de considérer la pénétrance d'effet. Pénétrance peut être considéré comme élevé si 80-100% des animaux présentent un phénotype sur la plaque NGM, partielle si 21-79% et faible si ≤20% de l'affichage de la population un effet. Pour les effets très pénétrants, des échantillons plus petits peuvent être utilisés pour produire des données quantitatives importantes sur les anomalies du sarcomère. Dans les cas où l'effet a une pénétrance faible, la sélection des animaux qui affiche un défaut de mouvement clair en réponse à la drogueou un traitement ARNi peut être utile dans le dosage des défauts de sarcomères chez les animaux les plus affectés par le traitement. Cependant, ce ne sont pas nécessairement le cas où la mesure de l'effet du traitement sur la circulation et de la structure sous-cellulaire est le même. Ainsi, il peut être souhaitable d'examiner l'étendue de défauts présents dans une population importante, par exemple 100 animaux. Cela permet à la compréhension de la répartition des défauts dans l'ensemble d'une population. Il peut également être souhaitable d'examiner l'étendue de la lésion chez les animaux les plus sévèrement affectées et / ou d'examiner la corrélation entre la mesure du défaut de sarcomères et l'étendue des défauts de mouvement. Les difficultés potentielles de côté, cette méthode est plus rapide et plus facile que d'autres méthodes d'évaluation de la structure du sarcomère. Cette rapidité et la facilité est, cependant, soumise à une limitation clé, sarcomères contenant des protéines de fusion GFP ne sont pas tout à fait normal 37 et donc l'évaluation de sarcomères perturbé devrait être confirmée à l'aide des méthodes de main-d'œuvre supplémentaires.Ces méthodes comprennent l'utilisation de la lumière polarisée 38, 39 phalloidin coloration, et immunofluorescence indirecte 40. Parmi ces méthodes, seule la lumière polarisée est relativement non invasive; les autres méthodes nécessitent fixation et ne peuvent donc pas être utilisés dans des études prospectives d'animaux individuels, plutôt qu'ils ne peuvent être utilisés pour confirmer, traverser en section, les résultats de ces études.

Imagerie de mitochondriales Réseaux

La souche à vis sans fin utilisé pour les expériences d'imagerie mitochondriales est CB5600 7 qui exprime une protéine de fusion GFP localisée à la mitochondrie et une GFP β-galactosidase protéine de fusion localisé au noyau, à la fois dans les muscles de la paroi du corps. Comme dans le cas de l'utilisation de sarcomères PJ727 d'imagerie, l'utilisation de cette souche permet la visualisation de la structure de réseau mitochondrial dans les animaux vivants. Ainsi, cette souche peut être utilisée pour évaluer les changements dynamiques qui se produisent, par exemple, réduit mitochofusion ndrial et / ou une augmentation de la fission mitochondriale 41. Aussi pour sarcomères d'imagerie, la plus grande difficulté de cette méthode est que les vers imagées sont encore en vie et en mouvement, ce qui rend difficile d'obtenir des images bien ciblées. Bien que plusieurs méthodes, comme on le verra plus en détail ci-dessus, peuvent être employés pour réduire les mouvements, les mitochondries apparaissent particulièrement sensibles aux interventions qui induisent une circulation réduite. Par exemple, le plus couramment utilisé composants anesthésiques cibles de la chaîne respiratoire mitochondriale et sont doit donc être utilisé avec prudence dans les études de la structure mitochondriale et la fonction normales. De même, la plupart des agents paralytiques doivent être utilisés avec prudence dans les études de la structure mitochondriale et la fonction normales, comme la plupart des agents paralytiques causent moins de signal de passer à travers la jonction neuromusculaire et dénervation fonctionnelle du muscle est suffisante pour induire la fragmentation mitochondriale. Les expériences de cette étude employées pression pour immobiliser l'animals, mais d'autres ont utilisé avec succès le lévamisole 42, bien qu'il soit essentiel à l'image des animaux immédiatement.

Enfin, divers contaminants bactériens dans les cultures, par exemple B. subtilis, peuvent induire la fragmentation mitochondriale; par conséquent, il est essentiel d'inclure des témoins non traités appropriés dans l'analyse. Pour les effets très pénétrants, des échantillons plus petits peuvent être utilisés pour produire des données quantitatives importantes sur les anomalies du réseau mitochondrial. Toutefois, en raison de la prévalence des anomalies mineures du réseau mitochondrial, ce petit nombre d'animaux est susceptible d'être deux fois le nombre nécessaire pour l'évaluation de la structure du sarcomère. Dans les cas où l'effet a une faible pénétrance, la sélection d'animaux présentant clairement un défaut de mouvement en réponse à la drogue ou traitement ARNi peut être utile dans le dosage de défauts mitochondriaux chez les animaux les plus touchés par le traitement. Cependant, comme mentionné ci-dessus, ne sont pas forcément le cas où lemesure de l'effet du traitement sur la circulation et de la structure sous-cellulaire est le même. Ainsi, il peut être souhaitable d'examiner l'étendue de défauts présents dans une population importante, par exemple de 150 à 200 animaux, ainsi que l'ampleur de la perturbation dans les animaux les plus sévèrement affectées, et la présence ou l'absence de mesure de la perturbation de mesure avec défaut de mouvement. D'autres souches avec les mitochondries marquées par fluorescence peuvent être utilisés pour confirmer les résultats obtenus dans CB5600, cependant, l'utilisation de différentes protéines fluorescentes peuvent influencer le réseau de base de la mitochondrie. Par exemple, l'utilisation d'une protéine DP-20 TOMM de fusion de visualiser les mitochondries semble entraîner une augmentation de la fragmentation des mitochondries de référence par rapport à l'utilisation de GFP localisée 17 mitochondries. Bien que d'autres méthodes telles que l'immunofluorescence et microscopie électronique peuvent être utilisées pour évaluer la structure mitochondriale, ils ne permettent pas l'évaluation in vivo de la dynamique mitochondriales à cause d'une étape de fixation est exigentd. D'autres procédés tels que l'utilisation de colorants mitochondries localisées peuvent être utilisés sans fixation et par conséquent peuvent également être utilisés à la place de l'utilisation de GFP localisée mitochondries. Tel que discuté dans la section suivante, l'utilisation de ces colorants permet également une évaluation grossière de la fonction vivo dans mitochondriale.

Évaluation du potentiel de membrane mitochondriale in vivo chez C. elegans

Une variété de colorants sont disponibles pour le marquage des mitochondries 28. Ces colorants donnent un autre mode de visualisation structure de réseau mitochondrial chez C. elegans vivants. Beaucoup de ces colorants permettent également l'évaluation de la fonctionnalité brut mitochondrial in vivo, car ils accumulent dans les mitochondries sur la base du potentiel de la membrane mitochondriale. Ici nous avons utilisé C 32 H 32 Cl 2 N 2 O qui est ingérée parle tube digestif, avec en outre une certaine entrée de la vis sans fin par l'intermédiaire de la cuticule du fait de la perméabilisation offerte par dissolution dans 0,5% de DMSO. Après l'entrée dans la cellule C 32 H 32 Cl 2 N 2 O est oxydé et séquestrée par les mitochondries où il se lie soufre contenant des acides aminés (par exemple, la méthionine et la cystéine). La formation de ces complexes colorant-peptide signifie C 32 H 32 Cl 2 N 2 O demeure dans les mitochondries marquées 28 fois. Un problème fondamental que pose l'utilisation de colorants mitochondriales est qu'ils vont étiqueter tous les mitochondries chez l'animal. Nous avons donc effectué étiquetage CB5600, la même souche décrite ci-dessus pour évaluer la structure du réseau mitochondrial musculaire. En utilisant un colorant rouge mitochondriale, d'une souche de vers exprimant la GFP dans les mitochondries du muscle, et un filtre passe triple, il est relativement simple de l'image uniquement des mitochondries dans le muscle de la recherche des mitochondries qui sont ogamme de colocalisation de colorant rouge et mitochondries GFP marqués. L'étape la plus difficile dans l'exécution de cette approche de co-localisation est l'imagerie parce que le colorant est photo-blanchi en quelques secondes sous haute intensité de la lumière fluorescente. Cet effet peut être limitée par le maintien de fluorescence à faible puissance jusqu'à ce que l'expérimentateur est prêt à l'image, puis en ajustant l'intensité de fluorescence en conséquence. Une fois que l'on a connu avec l'utilisation de colorants autre approche est d'utiliser la microscopie confocale à Z piles à l'image seulement mitochondries dans le tissu droit; les réseaux mitochondriales dans les muscles sont tout à fait distinctes par rapport à d'autres tissus. Malheureusement, l'incapacité de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O à partir des mitochondries 28 signifie que, contrairement aux techniques de sarcomères et imagerie mitochondrial discuté ci-dessus, il ne peut pas être utilisé pour suivre de manière prospective la perte de la fonction mitochondriale dans le temps, sauf si C 32 H 32 Cl 2 N 2 Oest ajouté à des points de temps discrets pour séparer les populations animales. Cette limitation peut être surmontée en utilisant des colorants tels que JC-10 qui le font sortir de la mitochondrie par l'affaissement du potentiel de 43 membrane. Les mitochondries peut également être isolé à partir de C. elegans 30 pour les analyses biochimiques suivantes. Cette extraction permet de quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale par la quantification de la vitesse d'absorption de colorant cationique lipophile en utilisant la cytométrie de flux ou d'un lecteur de plaque fluorescente 44. Après avoir établi un potentiel de membrane mitochondriale altérée, il est également possible de déterminer si la perte de gradient de protons se traduit par une perte de la production d'ATP en utilisant un procédé à base de luciférase-bioluminometric sensible 45.

Évaluation de la dégradation des protéines dans C. elegans

La souche de vis sans fin utilisé ici pour évaluer la dégradation des protéines musculaires est PD55, qui contient un β spécifique de musclela ß-galactosidase qui est synthétisé en continu au cours du développement jusqu'à l'âge adulte est atteint et qui reste stable dans le cytosol pour la prochaine 72 à 96 h 19. Ainsi, la mesure des niveaux de β-galactosidase pendant le développement indique principalement l'impact des interventions sur la synthèse à partir du promoteur de la myosine alors que la perte de la β-galactosidase à l'âge adulte indique une intervention a provoqué une dégradation accrue des protéines cytosoliques 19. L'étape clé dans l'évaluation de l'activité β-galactosidase est d'assurer la dessication efficace. Le défaut de dessécher efficacement les animaux en résulte une mauvaise disposition du substrat X-gal et donc pauvres couleur bleue dans les muscles tégument des animaux. Pour assurer une bonne dessiccation le sceau sur le dessiccateur doit être vérifié et l'échantillon doit être vérifiée à intervalles de 5-10 min tout au long de dessiccation pour évaluer les progrès (ie, l'échantillon de 20 pi aurait séché à 10 min et 20 min le resteest de veiller à la dessiccation complète). Le test β-galactosidase est un dosage de l'activité donc un contrôle approprié est essentiel. En outre, une diminution de la coloration des adultes dans un état de traitement par rapport au témoin ne prouve pas que la dégradation se produit; il indique plutôt diminution de l'activité enzymatique en réponse au traitement. Pour confirmer la dégradation, plus analyse par transfert Western de main-d'œuvre doit être faite contre β-galactosidase 13, ce qui permet la dégradation des protéines de quantification dans les petites populations de vers comptés. Blot densités de bande occidentaux peuvent être quantifiés en utilisant ImageJ 46. Une autre limitation de cette méthode est que l'utilisation de protéines transgéniques ne communique pas à des cibles physiologiques de dégradation et de ces réponses hypothèse conduit des transferts Western protéomiques et / ou ciblées doivent être utilisés 13. Enfin, comme la synthèse de la protéine transgénique utilisé dans ces études est coupée au début de l'âge adulte 19 C. elegans pleinement développé muscle; par exemple, les méthodes d'isotopes stables ou radioactifs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) Invitrogen M-7512 Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential
DMSO Thermo Scientific 67-63-5
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Na2HPO4 BDH 301584L
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
MgSO4 Sigma M-7506
Microscopy Slides Starfrost K220
Microscopy Cover Slips VW2 International 631-0124
1.5 ml Eppendorph Tubes Fisher Scientific FB74031
Dessicator Nalgene D2672
Nikon Microscope Nikon H600L Nikon H600L microscope with proprietary software
Nikon Camera Nikon DS-Fi1 Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera 
Zeiss Microscope Zeiss Ax10 Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter
Plates 9 cm Starstedt 82-1473
Plates 6 cm Gosselin BP53-01
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich 14459-95-1 
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Na3PO4 Sigma-Aldrich 7601-54-9
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside Sigma-Aldrich 7240-90-6 
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 68-12-2 

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Biologie du développement Numéro 93 physiologie, Les muscles les mitochondries les sarcomères le vieillissement
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Gaffney, C. J., Bass, J. J., Barratt, T. F., Szewczyk, N. J. Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans. J. Vis. Exp. (93), e52043, doi:10.3791/52043 (2014).

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