Summary
골격 근육은 운동을 위해 필수적이며, 몸의 주요 단백질 저장소입니다. C. elegans의 내 근육 건강 측정이 설명되어 있습니다. 근육의 구조와 기능에 대한 전향 적 변화는 지역화 된 GFP 및 양이온 성 염료를 사용하여 평가됩니다.
Abstract
근육 영양, 운동, 질병 상태의 변화에 반응하는 역동적 인 조직이다. 질병과 나이와 근육 질량과 기능의 손실은 중요한 공중 보건의 부담입니다. 우리는 현재 질병이나 나이와 근육 건강의 유전 적 규제에 대한 약간의 이해. 선충 C. elegans의 관심 생물학적 과정의 게놈 규제를 이해하기위한 설립 된 모델이다. 이 웜의 몸 벽 근육은 더 높은 후생 동물 종의 근육과 동성의 큰 정도를 표시합니다. C. elegans의 투명 유기체이기 때문에, 미토콘드리아 및 sarcomeres에 GFP의 현지화는 생체 내에서 이러한 구조를 육안으로 확인 할 수 있습니다. 마찬가지로, 동물 미토콘드리아 막 전위의 존재를 기반으로 축적 양이온 성 염료를 공급, 생체 내에서 미토콘드리아 기능의 평가를 할 수 있습니다. 근육 단백질 homeosta 이러한 방법뿐만 아니라, 평가SIS, 근육의 성능 측정 기능을 가진 서브 셀룰러 결함의 상관을 허용하도록, 움직임 분석의 형태로, 전체 동물의 근육 기능의 평가와 결합된다. 따라서, C. elegans의 근육의 구조와 기능에 따라 돌연변이, 유전자 녹다운 및 / 또는 화학 물질의 영향을 평가하는 강력한 플랫폼을 제공한다. 마지막으로, GFP, 양이온 성 염료, 및 운동 분석으로 평가된다 비 침습적, 근육의 구조와 기능의 전향 적 연구가 전 생애 과정에 걸쳐 실시 될 수 있으며, 현재이 쉽게 다른 생물체에서 생체 내에서 조사 할 수 없습니다.
Introduction
근육이 잘 운동, 자세 지원 및 신진 대사의 역할에 대한 평가 다기능 조직이다. 건강한 근육의 개발 및 유지 보수는 여러 세포 프로세스 및 구성 요소의 조정을 필요로한다. 어느 쪽의 손상 또는 질병을 통해, 조절 장애는 변경된 근육의 구조 및 / 또는 기능의 결과로 발생할 수 있습니다. 1, 2 질량과 특히 근력과 지구력 3-5 근육에 부정적인 사망률과 상관 관계가 있기 때문에 근육 기능에서 나이 관련 감소, 서구 세계의 보건 의료 예산에 상당한 부담을 제공한다. 이러한 변경된 미토콘드리아 기능 또는 근절 중단으로 악화 근육 기능에 관련된 측면의 측정은 전반적인 근육 발달과 건강을 뒷받침 메커니즘 큰 이해를 허용 할 수있다.
C의 aenorhabditis 간스 (C. elegans의)는 미세한 선충 BES입니다그것의 전체 게놈 6 염기 서열을 가지고있는 최초의 다세포 유기체, RNAi의 7 사용하여 침묵 유전자를 가지고 첫 번째, 먼저 제안 된 전체 세포 계보 (8)과 신경 해부학 (9) 결정. C. elegans의가 할 수있는 유일한 후생 동물 이었기 때문에 t 알려진 시드니 브레너 (10)에 의해 1974 년 행동의 유전 적 제어 및이의 중요성과 후속 작업의 연구를위한 모델은 C. elegans의 연구자에게 수여 세 노벨상의 첫 번째로 인식되었다. C의 약 35 %는 유전자가 C. elegans의 근육 개발 (11)의 유전 적 제어를 이해하는 데 사용되는 키 유기체 인으로, 인간의 orthologues을 확인했다 엘레 간스. 거의 C. elegans의 게놈에있는 모든 유전자의 RNAi 7,12을 무너 뜨렸다 할 수 있습니다. 따라서, 완전히 개발 근육에 유전자를 쓰러 뜨린하여, 유전 적 구성 요소는 다시에 기여근육 건강의 gulation은 상대적으로 단순 (13)을 조사 할 수 있습니다.
RNAi를, 돌연변이, 화학 화합물을 사용하는 결합 능력은 C.가 16 세와 질병 모델 (17) 근육의 구조와 기능의 유전 적 규제 7,14,15 탐험을위한 최고의 시스템을 엘레 간스 있습니다. 근육 구조 및 / 또는 기능에 따라 화학적 화합물 유전자 녹다운, 돌연변이 및 / 또는 노광의 영향은 여러 양태를 통해 측정 할 수있다. 여기에서 우리는 간단히 근육 건강의 전향 적 연구에 사용할 수있는 많은 것이 C. elegans의 근육의 구조와 기능을 평가하기위한 간단한 방법을 설명합니다.
녹색 형광 단백질의 개발 (GFP) (18)는 특정 단백질의 지역 및 선충의 세포 소기관의 일반적인 구조 모두의 시각화를 가능하게했다. 여기에서 우리는 GFP가 정시를 표현하는 방법을 설명fically 몸체 벽 근육 내 미토콘드리아, 핵, 또는 sarcomeres 이러한 서브 셀룰러 구조 이영양증이 존재 하는지를 결정하기 위해 사용될 수있다. 구조는 항상 함수에 대한 신뢰할 수있는 대리 아니므로, 우리는 또한 생체 내에서 양이온 성 염료의 사용은 근육 내 손상 미토콘드리아 막 전위의 평가를 허용하는 방법에 대해 설명합니다. 염료는 GFP와 병용하는 경우, 그들은 수명에 걸쳐 시간적 방식으로 아키텍처 및 기능의 조사를 허용한다. 마지막으로, 우리는 또한 이러한 조치 모두 이동 분석법의 사용을 통해 전체 동물의 근육 건강 변화의 상관 관계를 사용하는 방법을 근육 내 단백질 항상성 평가 방법을 설명하고있다. 유전자 최저, 돌연변이, 및 / 또는 화학 물질과 결합 된이 기술은 특정 유전자 또는 화합물이 생체 내에서 근육의 건강에 미치는 영향을 연구하기위한 강력한 무기를 제공합니다. C. elegans의 사이 구조, 신진 대사와 근육의 총 함수의 평행선포유 동물은 C. elegans의는 인간을 포함한 고등 생물, 근육의 조절을 이해하는 뛰어난 모델 생물이다 의미한다.
Protocol
1. 균주, 문화, 및 현미경
- C. 엘레 간스의 취급 및 유지 관리 균주는 이전에 (19)을 설명했다. 균주는 Caenorhabditis 엘레 유전학 센터 (CGC)에서 사용할 수 있습니다.
참고 : 미토콘드리아 및 핵에 지역화 된 GFP 융합 단백질로이 실험에 사용 된 균주는 CB5600 (그-8 (e1489) IV; Pmyo-3 :: Mtgfp) I ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-의 lacZ)을했다; unc-, 수축 장치 및 PD55 (ccIs55 (SUP-7 (ST5)로 지역화 GFP 융합 단백질로, PJ727 (UNC-54 :: lacZ의 V jls01 (묘-3 :: GFP, ROL-6 (su1006))) 54 :: lacZ의 세포질에 지역화 β 갈 락토시다 제의 융합 단백질)와 V). - 이전 순서에서의 RNAi 박테리아 다세대의 RNAi 실험 (13)에 대한 설명과 취득으로 전체의 RNAi 실험은 마크 비달 등. (12)에 의해 건설 ORF-RNAi의 라이브러리를 확인했습니다.
- 포함하는 균주를 구축 <EM> CCIS 4251, jls01 또는 CCIS (55)는 표준 기술 (20)를 사용. 각각 미토콘드리아 네트워크 구조, 조직 또는 미오신 proteostasis의 상태를 평가하기 위해 균주를 생성하기 위해 이러한 유전자를 사용한다. 모든 동물이 요구되는 이러한 이하 세포질 구획의 하나보고 어디 돌연변이에 균주를 교차.
- PtdIns-3 키나아제 억제제를 사용 LY-294002 (LY)는 앞서 21 일 설명했다. 간단히, 건조 OP50 시드 NGM 플레이트의 상단에 160 μM의 최종 농도 LY-294002을 추가합니다.
- 일반적으로, GFP 기반 실험 GFP 필터 및 Cl2를 N 2 O H 32 C 32 생체 막 전위에서 평가하는 동시에, 적색, 녹색 및 청색 채널들의 이미징을 가능하게하는 트리플 통과 필터와 현미경을 사용하여 모든 이미지를 캡처 MitoTracker 레드 CMXRos으로 판매. 화상 처리 소프트웨어 이미지 분석도 준비를 수행.
- 전에 필요한 일일의 최소, M9 버퍼를 만들 - 22.04 mM의 KH 2 PO 4, 42.27 mM의 나 2 HPO 4, 85.56 mM의 염화나트륨 (최종 농도) 및 고압 증기 멸균 소독. 일단 45 ° C로 냉각, 강수 (22)을 방지하기 위해 고압 증기 멸균 한 후 1 mm로 황산 멸균 추가합니다. M9은 50 ㎖ 튜브에 4 ° C와 나누어지는에서 식 힙니다.
- 실험 날에, L1 유충 높은 숫자 단일 9cm 판에 3 ㎖ M9 버퍼를 추가한다. 각도에서 개최 된 플레이트와 한천의 표면에 대한 M9 액체와 피펫을 흡입에 의해 반복적으로 접시를 씻으십시오.
- 판에서 L1 년대를 세척 한 후 피펫을 사용하여 10 ml의 테스트 튜브에 M9를 전송합니다.
- 큰 성인 이상 애벌레 단계 동물 테스트 튜브의 바닥으로 떨어질 수 있도록 2.5 분 동안두고 작은 L1 동물 t 근처에 남아M9 버퍼의 영업 이익.
- 피펫을 사용하여 시험관에 M9의 500 μl를 제거합니다. 그 다음 해부 범위에 500 μL OP50 파종 새로운 NGM 플레이트에 M9 포함 L1 유충을 피펫.
- 일반적으로, 플레이트 당 ~ 200-300 L1 유충을 전송하는 것을 목표로하고 있습니다. 필요한 경우, OP50 음식 소스가 소비되는 것을 방지하기 위해 신선한 OP50 NGM 플레이트에 동물을 선택, 성인이 매일 판을 모니터링하고.
NOTE :이 원판에 L1 년대의 수에 따라 크게 다르지만, 이것은 일반적 P1000 피펫을 사용 M9 1~3 방울이다. - 개별 동물에 대한 전향 적 연구가 필요한 경우는 동물이 성인이되면, 시드 NGM 플레이트를 분리하는 각각의 동물을 선택합니다. 전송 동물마다 24 ~ 48 시간은 애벌레 동물에서 분리합니다.
3. 운동 분석 실험 (19)
- 실험을 시작하기 전에 2 시간의 최소, M9의 50 mL를 제거하고 실내 온도에 평형 수erature.
- 현미경 슬라이드에 50 μL M9 버퍼에 하나의 성인 동물을 선택합니다.
- 하나 좌측으로 하나 우측으로 굴곡 한 스트로크와 동일한 10 초에 왼쪽과 오른쪽으로 몸의 굴곡의 수를 계산합니다.
- 평균을 확보 할 수있는 적어도 5 측정 총 수득 본체 스트로크의 카운트를 반복한다. 분당 이동 속도를 제공하는 여섯에 의해이 수치를 곱하십시오.
- 피펫을 사용하여 배양 접시에 다시 동물을 전송합니다. 이 방법은 C.의 elegan (S)에 전체 수명에 걸쳐 운동 시간 측정을 가능하게한다.
그림 1 : 운동 분석. 웜이 버퍼에 포착되면, 한 좌측 (A) 및 하나의 우측 방향 (B)은 하나의 완전한 굴곡 운동을 수득 가산되어(스트로크).
미토콘드리아 네트워크 및 Sarcomeres 4. 이미징 바디 벽 근육에
- 참고 : 동일한 프로토콜은 미토콘드리아와 sarcomeres 모두의 영상에 적용됩니다.
- 그들은 젊은 성인에 도달 할 때 이전에 (1 절)을 설명하고 20 ° C에서 48-60 시간 동안 성장 벌레를 동기화 할 수 있습니다.
- 현미경 슬라이드에 20 μL M9에 플레이트에서 20 웜 (접시 대표)를 선택합니다.
- 커버 슬립을 적용하고 40 배 배율에서 GFP 필터 (460-500 nm의, 푸른 빛 여기)에서 형광 현미경을 사용하여 이미지로 이동합니다.
5. MitoTracker 레드 CMXRos와 생체 내 축적 분석 (C 32 H 32 CL 2 N 2 O)를 사용하여 잠재적 인 멤브레인 평가
- CB5600 (1 절), 근육의 미토콘드리아에서 GFP로 표지 모든 동기화, 20 ° C에서 48-60 시간 동안 NGM 포함 OP50에서 성인 초기에 성장한다.
- 940.692 μM의 원액을 만들기 위해 C (32) H (32) CL 2 N 2 O의 50 μg의 나누어지는에 μL DMSO (100)를 추가합니다.
- 940.692 μM 원액의 1 μl를 타고 4.70 μM (4.70346 μM)의 작업 솔루션을 만들기 위해 199 μL M9에 재현 탁. C (32) H (32) CL 2 N 2 O는 감광 때문에 갈색 1.5 ml의 튜브에이를 준비합니다.
- 용액 (20 μL 나누어지는 당 20 성인 웜) 작업 4.70 μM의 20 μL 분주을 준비합니다.
- 갈색 1.5 ml의 튜브에 4.70 μM의 C (32) H (32) CL 2 N 2 O 20 μL에 20 성인 동물을 선택합니다. 1 시간 동안 20 ° C에서 품어.
- 1 시간 배양 한 후, 10 초 동안 2,000 XG에서 웜, 원심 분리기를 포함하는 갈색 1.5 ml의 튜브에 1 ㎖의 M9를 추가 한 다음 상층 액을 제거합니다. 나머지 20 μ를 웜 펠렛을 재현 탁하고 전송하기 전에이 세척 단계를 반복난 이미징을위한 슬라이드 (웜을 포함).
- 40X 배율이 동시에 빨강, 파랑, 녹색 채널의 시각화를 할 수있는 트리플 패스 필터를 이용하여 미토콘드리아의 이미지를 가져 가라. 트리플 패스 필터를 사용하여 영상은 오렌지로 나타나는 미토콘드리아로 지역화 C 32 H 32 (CL)이 GFP와 N 2 O의 공동 현지화를 보여줍니다.
- 오렌지 미토콘드리아의 이미지를 촬영하는 데, 모두 제거 필터를 최대 설정에 파장 25분의 540 나노 미터의 빛을 사용하여 10 초 동안 동물을 사진 표백. 이 미토콘드리아의 Red 표백제 및 근육의 미토콘드리아의 colocalization을 확인하기 위해 혼자 미토콘드리아 GFP를 발표 할 예정이다.
C. elegans의 근육 단백질 분해 6. 평가
- NGM 플레이트에에 동기화 PD55s (또는의 lacZ 유전자가 포함 된 변형) OP50 (1 절)과 시드. 2에서 48-60 시간 동안 젊은 성인에 성장0 ° C.
- 현미경 슬라이드에 20 μL DDH 2 O로 20 성인 벌레를 선택합니다. 시도 만 웜 선택하지 박테리아를 선택하는주의하십시오. 연필의 현미경 슬라이드 레이블.
- 30 분 건조 및 동물의 표피를 해독하는 데시 케이 터에 놓습니다. 실 주위에 그리스를 사용하여 데시 케이 터에 단단히 밀착되어 있는지 확인합니다.
- 탈수를 확인하는 것은 해부 범위 (그림 2)에서 효과적이었다.
- 3.5 분 후, 슬라이드 아세톤이 증발 할 수 있도록 15 분 동안 실온에서 종이 수건 현미경 슬라이드를 남겨 얼음처럼 차가운 아세톤 현미경 슬라이드를 담근다. 이 시점에서 X-gal을 산화 버퍼를 해동하고, 실온으로 평형화 허용한다.
- 부드럽게이 균질하기 위해 산화 버퍼와 소용돌이 μL 100 개의 2 μL X-GAL를 추가합니다. 이것은 X-gal을 / 산화 버퍼 마스터 믹스이다.
- O 각 X-GAL / 산화 버퍼 마스터 믹스 20 μl를 추가20 벌레의 riginal 지역. 마스터 믹스가 완전히 완전히 모든 동물을 커버하기 위해 해부 범위에서 검사합니다. 조심스럽게 동물에 적용되지 않는 경우 지역에 걸쳐 마스터 믹스를 이동하는 현미경 슬라이드를 기울이십시오.
- 20 ° C에서 1-2.5 시간 동안 습도 챔버에서 현미경 슬라이드를 놓습니다. 이미지 동물 진한 청색 대조 동물의 체벽 근육에 존재한다. 동물을 이미지화해야 할 때를 결정하기 위해 해부 범위에 매 15 분 대조군을 평가.
도 2 : β 갈 락토시다 제 어 세이를 이용하여 근육 단백질 분해의 평가. 의 lacZ 유전자를 포함하는 (A) 동물은 현미경 슬라이드 (B)에 20 μL DDH 2 O에 페트리 접시에서 선택됩니다. 동물 건조 된하고 골절이 될
Representative Results
운동 분석은 운동 결함을 정량화하기
이동 감소는 C. 사망률의 좋은 예측 인자 엘레 16과는 신경근 시스템에 문제를 나타내는 속도를 감소시켰다. 운동의 변화, 운동 분석에 의해 평가로, (23), 특정 유전자 또는 약물 치료 (그림 3-5)에 대해 또는 돌연변이 동물 (13)에서의 RNAi에서 발생할 수 있습니다. 운동의 쇠퇴는 복잡한 I, III, IV 또는 V (24)를 암호화하는 전자 수송 유전자의 아래로 발달 노크 다음과 같은 예를 들어 변경된 개발에서 발생할 수 있습니다. 또한, 특정 개입 후 생리 발달에 미치는 영향을 조사하기 위하여 만 성인 C. elegans를 테스트 할 수있다. 예를 들어, 동물 인코딩 UNC-112, 대한 RNAi의 처리 C를 포함하는 인테그린에 지역화 Kindlin-1의 orthologue 엘레 간스근육 부착 복합체 (도 3 및도 4), 또는 가스-1, 전자 수송 체인 (도 4)의 복합체 I의 성분을 부호화, 48-72 시간 후 - 성인기로부터의 제어 대 운동 점진적인 감소를 표시. 이 근육 생리학 문제를 나타낼 수있다. 마찬가지로, 24에서 운동의 손실 - 72 시간은 PI3K 억제제 LY-294002 (그림 5) 치료와 일반적으로 개발 성인의 치료에 대한 반응에서 관찰된다. 그것은 제 RNAi의 처리, 돌연변이, 또는 초기 개입에 응답하여 감소 된 운동을 표시하는 동물에서의 움직임을 복원에 약물의 효과를 시험하는 것도 가능하다. 예를 들어, 112 unc- 돌연변이 희미 한 13 번째 돌연변이의 존재 감쇠 야생형 동물에 비해 운동 정량 감소를 표시. 따라서, 이동 분석은 neuromuscu을 변경 모두 개입을 식별 할 수 있습니다LAR 개발 및 / 또는 기능뿐만 아니라 개선 및 / 또는 신경 근육 기능을 회복 것.
근절의 중단의 평가
움직임 결함을 식별하는 데, 이는 이동 결함의 원인이 신경, 근육, 또는 양자 모두 내에서 문제로 설명 될 수 있는지 결정하는 것이 바람직하다. Sarcomeres는 생성과 이동을 강제 따라서 수축을 허용하고 근육 내의 다중 단백질 복합체이다. 수축 장치에 국부적 미오신 GFP 융합 단백질을 발현하는 동물을 이용하여, 미오신 필라멘트 sarcomeres 중단의 범위는 개발 및 / 또는 성인기를 통해 개별 동물에서 비교적 비 침습적으로 전향하고 관찰 할 수있다. 야생 형 동물은 각각의 신체 벽 근육 내에서 여러 녹색 평행 한 직선 (그림 3) 표시 배열 된 sarcomeres를 표시합니다. 이러한 일반 배열과 중단은 상대적으로 작은 수 있습니다병렬로 남아있는 것이 아니라 병합 나타나는 배열 sarcomeres. t에서 UNC-112의 RNAi으로 보이는이 표현형은 = 24 시간 또는 48 시간 (그림 3), 포유류의 근육 액틴 결합 부위의 Z 온라인 스트리밍 비교입니다. 마찬가지로, 배열의 작은 부분은 축소 할 수 있습니다 또는 48 시간 또는 T = 72 시간 (그림 3) = t에서 UNC-112의 RNAi 치료로 완전히 같은 사라질 수 있습니다. 움직임 결함을 표시 동물의 근육 내 근절 결함의 존재 (도 3) 이동 결함을 설명하기에 충분하지만, 반드시 중재에 응답하여 근육, 신경, 및 / 또는 다른 조직과 다른 문제를 배제하지 않는다 .
미토콘드리아 네트워크 구조의 평가
움직임 결함의 존재에 그것은 유발하거나 이동 데에 기여할 수있는 다른 결함 근육을 조사 때때로 바람직에는 영향을. 미토콘드리아는 세포 에너지의 대부분을 제공하고 근육 수축 가능한 에너지를 감소, 감소 된 ATP 조항의 결과 일 수 운동 하락. 따라서, 미토콘드리아의 구조는 이상을 검사 할 수있다. 그것은 빠른 미토콘드리아 조각화를 유도로 소듐 아 지드와 함께 동물을 마취시키다하지 않는 것이 중요하다; 이들 실험 동물은 커버 슬립에 의해 가해진 압력에 의해 고정화 하였다. 야생형 C. elegans의 내 몸 벽 근육, 미토콘드리아는 조직 네트워크 내에서 (그림 4)를 포함하고 미토콘드리아는 세망 (25)로 존재하고 기능. 미토콘드리아의 네트워크가 중단 네트워크 (가스-1 RNAi의 그림 4B) (26)의 분열로 제공합니다. 분열은 조직 네트워크의 어떤 외관은 UNC-112의 RNAi (그림 4B 및 C) (13)와 치료 등 남아있을만큼 심각한 될 수 있습니다. 위스콘신으로근절 구조 번째 중단은 움직임 결함을 표시 동물에서 근육 미토콘드리아 구조의 결함은 움직임 결함을 설명하기에 충분할 수 있지만, 이것은 반드시 근육, 신경, 및 / 또는 다른 조직과 다른 문제를 배제하지 않는다. 예를 들어, UNC-112 (13) 및 돌연변이 처리 UNC-112의 RNAi (도 3 및 4) 디스플레이가 모두 파괴 sarcomeres와 미토콘드리아 구조를 파괴.
생체 내에서 미토콘드리아 기능의 평가
미토콘드리아 막 전위는, 따라서, 생체 내 미토콘드리아 막 전위를 평가하는 기능을 양성자 원동력을 생성하고 (27) ATP 생성하는 미토콘드리아의 능력을 결정하는 ATP를 생산하는 동물의 능력을 나타낸다. 미토콘드리아 구조 차질 또는 미토콘드리아 기능 용량을 변경하지 않을 수 있습니다, 그것은 DESI 수 있습니다에 대해 유사한이 변경 미토콘드리아 구조를 표시하는 동물의 미토콘드리아 기능을 평가한다. C 32 H 32 CL 2 N 2 O는 막 전위가 존재하고 미토콘드리아 (28) (도 4C)을 얼룩 모든 유형의 세포의 미토콘드리아에 축적한다. 특히 근육의 미토콘드리아 기능을 평가하기 위해, 하나는 특히 근육의 미토콘드리아 (그림 4C)에 따라 개입의 효과를 설명하기 위해 C 32 H 32 N 2 O CL 2 GFP 표시 근육의 미토콘드리아를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, UNC-112의 RNAi와 미토콘드리아 막 전위 다음 처리 손실 매트릭스 들어가는 H 32 Cl2를 N 2 O C (32)을 방지한다. 미토콘드리아 따라서, 작은 보여줌 미토콘드리아 GFP 표지 (도 4C) 이외에 미토콘드리아 임의 레드 염색. 포토 표백도 관찰 확인하는데 사용될 수있다미토콘드리아는 특히 근육 (도 4C)의 것들이다. 감소 된 용량의 식별은 ATP가 관찰 운동 결함을 설명하기에 충분하지만, 근육, 신경 내의 다른 문제를 배제하지 않고 생산 및 / 또는 다른 조직한다. 감소 된 ATP 생산 능력은 인간 29 30 노화 질환 상태와 연관 될 때와 관계없이, 간섭에 응답하여 이러한 결함의 식별은 ATP 생산 능력을 향상시키고이 후 수도 화합물 및 / 또는 RNAi의 치료제 스크리닝 용 플랫폼을 제공 더 치료 가능성에 대한 탐구.
단백질 분해의 평가
움직임 결함 및 일반 sarcomeres과 미토콘드리아의 존재에서 그것은 유발하거나 이동 결함에 기여할 수있는 다른 결함 근육을 조사 때로는 바람직하다. 단백질 항상성을 유지하는 능력의 서명도 아니고진법 건강, 단백질 합성 및 / 또는 단백질 분해의 증가가 감소하는 반면 31 노화 여러 질환 상태 (32, 33)의 결과이다. 그러므로 변형 된 단백질에 대한 항상성 운동 결함과 동물의 근육을 조사하는 것이 바람직 할 수있다. 이것은 근육 세포질 단백질 수준의 평가를 통해 달성 될 수있다. 형질 전환되어 인코딩 된 단백질의 사용은 근육 특정 proteostasis의 평가를 할 수 있습니다. 예컨대, 미오신의 N 말단 부분에 융합 된 β 갈 락토시다 제를 함유하는 동물의 사용은, 그는 미오신 프로모터의 제어하에 합성 인핸서는 세포질 근육 단백질 함량 (19)의 평가를 허용한다. 야생형 성인 블루 염색의 존재는 β 갈 락토시다 제 활성의 존재 및 병리학 세포질 단백질 분해의 부재를 보여준다. 치료에 대한 반응에 염색의 손실은 병리학 적 단백질 분해 (그림 5 발생 제안 13,14,19 96 시간 포스트 성인. LY-249002 처리 동물 얼룩의 부족을 표시하는 반면 예를 들어, 처리되지 않은 야생형 동물, 성년 후 (그림 5) 강렬한 푸른 얼룩 72 시간을 표시합니다. 근절 구조 및 미토콘드리아 기능에 결함과 마찬가지로, 병리학 근육 단백질 분해의 존재는 관찰 된 운동 결함에 대한 계정에 충분하지만, 반드시 근육, 신경, 및 / 또는 다른 조직과 다른 문제를 배제하지 않는다.
도 3 :. (A) UNC-112의 RNAi는 t = 72 시간에서 상당한 운동 결함 발생 체벽 근육 내 배열 A-밴드 구조의 (B) 평가. 승t, 근육 A-밴드 (중량 줌 참조) 젊은 성인 (t = 0 시간)에서와 같은 직선을 표시하고 성인의 72 시간 이상까지 크게 균일 남아있다. UNC-112의 RNAi는 작은 영역에서 아키텍처를 잃고 sarcomeres 발생 근육 (t = 24 시간)의 붕괴 및 누락 sarcomeres (t = 48 시간), 응집 (t = 72 시간의 상단 패널과 줌) 및 sarcomeres의 선형성 (t = 72 시간 바닥 패널과 줌)의 손실. 스케일 바는 25 μm의를 나타내고 줌은 2.5 배이다.
도 4 :. (A)가 112 또는 UNC 가스 하나의 RNAi는 움직임 결함 발생 체벽 근육 내 미토콘드리아 구조 (B) 평가. 근육의 미토콘드리아는 젊은 성인 (중량)에서 네트워크로 연결된 직선으로 나타납니다. UNC-112의 RNAi 동물의 치료는 mitochondr 결과이전에 24 시간 및 성인 (줌과 화살표) (13)의 72 시간 사이에 관찰 원점이라 조각. 마찬가지로, 같은 미토콘드리아 네트워크의 분열에 RNAi의 가스에 대하여 -1 결과는 이전에 (26)을 관찰했다. 이들은 72 시간 (줌과 화살표 참조). 생체 내에서 미토콘드리아 막 전위의 (C) 평가에서 광범위하게 해체에 t = 24 시간 진행에 미토콘드리아 네트워크의 작은 틈으로 존재한다. 또한 GFP가 미토콘드리아로 지역화 포함 동물, N 2 O C (32) H (32) CL 2는 몸 벽 근육의 미토콘드리아에서 누적 72 시간 포스트 성인이 될 때까지 젊은 성인 (t = 0 시간)에서 트리플 패스 필터에서 오렌지를 나타납니다. 나머지 미토콘드리아는 N 2 O 대 중량 CL 2 H (32) C (32)의 적은 축적을 보일 것 72 시간에서와 같이 UNC-112의 RNAi 치료는 막 전위의 진보적 인 손실이 발생합니다. 10 SE에 대한 광표백C 25분의 540 nm의 빛 표백제에게 MitoTracker에서 빨간색을 사용하고 근육의 미토콘드리아 (+ 사진 표백제)로 지역화 GFP를 보여준다. 스케일 바는 25 μm의 대표와 2.5 배이다 확대합니다.
그림 5 : (A) 치료 LY-294002 동물은 이동 결함을 유도하는 β - 갈 락토시다 아제 분석을 사용하여 단백질 분해의 (B) 평가를.. L1 유충 중량 동기화 나이 OP50 (중량 제어) 또는 NGM과 시드 NGM에 전송하기 전에 20 ° C (t = 0 시간)에서 청년기로 성장 20 ° C에서 24 시간 동안 LY-294002 (PI3K 억제제 치료)와 함께 시드된다 . 에서 약 20 ~ 30 동물은 t = 0 시간에서 β - 갈 락토시다 제 활성 (파란색)과 24 시간, 48 시간, 72 시간 후 염색한다.
Discussion
이러한 방법은 이동 결함을 야기하기에 충분한 세포 내 결함을 식별하는 운동의 macrophysiology에서 근육의 탐사를 할 수 있습니다. 결합하면이 방법은 근육의 상세한 분석을 할 수 있습니다. 얻은 통찰력은 일반 생리학, 병태 생리 및 노화와 관련된 근육 지향 가설의 추가 시험을 할 수 있습니다.
운동 분석 실험
이동 결함 정상적인 신경 근육 기능의 중단을 나타냅니다. 이 신경 또는 근육에 한정 될 수 있습니다 또는 여러 조직 사이에 공통 될 수있다. 완료 이동 분석법 가장 어려운 스테이지는 인구 및 / 또는 치료를 대표하는 웜을 선택하고, 또한 실험자 M9에 양도시 동물을 손상하지 않는 것을 보장한다. 이 운동의 대표 정확한 평가를 얻기 큰 샘플 크기를 갖는 것이 중요하다. 높은 펜을 시금 때예컨대 etrant 효과, 자주 돌연변이 볼 10 동물의 표본의 크기가 각각 이동에 대해 열 번 평가 야생형에 비해 통계적으로 유의 한 차이를 발견하기에 충분하다. 그러나, 이동 분석법 및 배양 C. elegans의 용이성 단순 웜 수백 빠르고 강력한 정량적 결과를 보장하기 위해 평가 될 수 있다는 것을 의미한다. 인구의 일부에 존재하는 효과를 나타 시금 때 가장 영향을받은 동물에서의 결함의 정도뿐만 아니라 영향을받는 것으로 보인다 인구의 어떤 비율을 결정하는 것이 중요하다. 이러한 상황에서는 더 많은 수의 동물이 영향 인구의 비율에 대한 최소한의 데이터를 제공하기 위해 평가되어야한다. 자주 약물 및 RNAi의 치료 모두 인구의 작은 비율에 심한 운동 결함을 생성 할 것이다. 어떤 경우 AFF의 비율을 증가 또는 치료 및 제공 방법의 증량반사 된 동물 및 주행 투여 량 반응 곡선은 약물 또는 RNAi의 최적 농도를 결정하는데 유용 할 수있다. 이 운동 분석의 두 번째 한계는 웜이 이동을 평가하기 위해 조작된다는 것이다. 따라서, 웜은 모두 자극과 액체로 획득시 삼투 스트레스를 어느 정도 실시한다. 삼투압 스트레스 정도 M9 또는 BU 물 반대로 버퍼 (19)를 사용하여 제한 될 수있다. 이러한 제한 중 일부는 ImageJ에 35 상업적으로 이용 가능한 추적 시스템 (34) 또는 무료 플러그 인을 사용하여 판에 습관적인 움직임을 측정하여 완화된다. 동물의 이동 속도를 측정하는 것은 수명 전반에 걸쳐 측정이 방법의 비 침습성이 근육 기능의 미래의 평생 연구를위한 중요하다 할 수 있습니다 기능의 변화를 포함하여 전체 근육의 건강에 관한 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다.
수축 장치의 영상
<페이지 클래스 = "jove_content"> 화상 수축성 장치 구조 여기서 사용 웜 균주 체벽 근육 내 sarcomeres에 지역화 미오신 GFP 융합 단백질을 발현 PJ727 36이었다. 이 균주의 사용은 살아있는 동물의 근절 구조의 시각화를 가능하게한다. 상기 움직임 분석과 유사하게, 근절 구조를 평가하기 위해 GFP 표지 sarcomeres 사용의 주요 이점은,이 방법은 상대적으로 비 침습적이며, 따라서 전향 수명에 걸쳐 개개 동물에서 근절 구조를 수행하는데 사용될 수 있다는 것이다. 이 방법의 가장 큰 어려움은 이미지화되는 웜이 어려운 잘 초점을 맞춘 이미지를 얻을 수있게하는, 여전히 이동 그러므로 살아 있다는 것입니다. 여러 가지 방법은 이동을 줄이고 간단하게 이미지화하기 위해 이용 될 수있다; 이들은 마취 또는 압력, 흡입, 또는 고점도 용액의 사용을 통해 웜 고정화 마비 포함한다. immobiliz의 각 방법ATION는 자체가 신경 근육 기능을 변화시킬 수 있다는 단점이있다. 따라서, 분석에 적절한 미처리 컨트롤을 포함하는 것이 필수적이다. 그것은 또한 선택된 고정화 방법은 연구중인 문제가 얼마나 많이 사용 따라 의한 고정화 방법에 문제가없는 결과를 확인하기 위해 고정화의 적어도 두 개의 독립적 인 방법을 이용하는 것이 현명 할 수있다. 여기에서 우리는 감소 된 움직임을 유도하는 웜에 커버 슬립에서 간단한 압력을 사용했다. 커버 슬립을 배치 한 후, 커버 슬립 밑의 액체가 증발 및 커버 슬립 결과적 전형적이 쉽게 이미징 할 수만큼 감소 된 운동을 생성하기 위해 2-5 분 소요 웜하면 더욱 압력을 생성하기 시작할 것이다.커버 슬립 결국, 공동 후에 일반적으로 10 ~ 15 분 과도한 압력에서 파열 벌레를 일으킬 정도 증가 압력으로 소개 된 밀접 후에는 벌레를 모니터링하는 것이 필수적입니다verslip 또한. 추가적인 버퍼가 웜에 압박 손상을 방지하기 위해 커버 슬립의 가장자리 주위 피펫 팁의 도움으로 도입 될 수있다. 원한다면이, 커버 슬립 아래에서 동물의 검색을 방지하더라도 네일 바니쉬, 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 증발을 방지하는데 사용될 수있다. 마찬가지로, 용액 내의 실리콘 비드의 사용은 압력의 양 웜에 커버 슬립 장소를 줄일 수있다.
다만 이동 결함 평가와 마찬가지로, 그 효과의 투과도를 고려하는 것이 중요하다. 80-100% 동물 인구 디스플레이의 ≤20 % 영향을 미치는 경우 21~79% 경우 부분과 낮은, NGM 플레이트에 표현형을 표시하는 경우 투과도가 높은 고려 될 수있다. 고 침투 효과를 들어,보다 작은 샘플 크기는 근절 결함에 상당한 정량 데이터를 생성하는데 사용될 수있다. 효과가 약물에 반응 명확한 운동 결함을 표시 동물의 낮은 투과도, 선택이 경우또는 RNAi의 치료는 대부분의 처리에 의해 영향을받은 동물에서 근절 결함을 분석하기에 유용 할 수있다. 그러나, 이동 및 세포 내 구조에 대한 치료 효과의 정도가 동일하다는 것을 반드시 그렇지 않다. 따라서, 예를 들면, 100 동물 큰 모집단에서 본 결함의 정도를 검사하는 것이 바람직 할 수있다. 이것은 인구 전체에 결함의 분포의 이해를 가능하게한다. 그것은 또한 가장 심각한 영향 동물에서 결함의 정도를 검사 및 / 또는 근절 결함의 범위와 운동 결함의 정도 사이의 상관성을 조사하는 것이 바람직 할 수있다. 잠재적 인 어려움 제외하고,이 방법은 근절 구조를 평가하는 다른 방법보다 빠르고 쉽습니다. 이 속도와 용이성, 그러나, 키 제한이 적용됩니다, GFP 융합 단백질을 포함 sarcomeres은 중단 sarcomeres의 37 따라서 평가가 추가로 더 노동 집약적 인 방법을 사용하여 확인해야 완전히 정상이 아닙니다.이러한 방법은 (39) 염색 팔로이 딘 편광 (38)의 사용, 간접 면역 형광 (40)를 포함한다. 이러한 방법 만 편광은 상대적으로 비 침습적이다; 다른 방법은 고정을 필요로하며, 따라서 개별 동물의 전향 적 연구에서 사용될 수 없으며, 오히려 단지, 이러한 연구의 결과를 확인해 단면적으로 교차하도록 사용될 수있다.
미토콘드리아 네트워크의 영상
미토콘드리아 촬상 실험에 사용 웜 균주 체벽 근육에서 모두 미토콘드리아 및 핵에 국부적 GFP β - 갈 락토시다 아제 융합 단백질로 지역화 GFP 융합 단백질을 발현 CB5600 7이었다. 영상 sarcomeres에 대한 PJ727의 사용과 마찬가지로,이 균주의 사용은 살아있는 동물의 미토콘드리아 네트워크 구조의 시각화를 가능하게한다. 따라서, 본 균주는, 예를 저감 mitocho 대해 발생할 동적 변화를 평가하기 위해 사용될 수있다ndrial 융합 및 / 또는 증가 된 미토콘드리아의 분열 (41). 또한 영상 sarcomeres에 관해서는,이 방법에 가장 큰 어려움은 이미지화되는 웜이 어려운 잘 초점을 맞춘 이미지를 얻을 수있게 살아 움직이는 점이다. 위에서 더 상세히 논의되는 바와 같이 여러 방법이, 움직임을 줄이기 위해 채용 될 수 있지만, 감소 된 미토콘드리아 운동을 유도 개입 특히 민감 나타난다. 예를 들어, 가장 일반적으로 미토콘드리아 호흡 사슬의 마취제 대상 성분을 사용하고, 따라서 정상적인 미토콘드리아 구조와 기능 연구에주의하여 사용되어야한다. 대부분의 마비 에이전트가 적은 신호가 신경 근육 접합부 및 근육의 기능 탈 신경을 통과하게 비슷하게, 대부분의 마비 에이전트는 미토콘드리아의 분열을 유도, 정상 미토콘드리아의 구조와 기능의 연구에주의하여 충분한되어 사용되어야한다. 이 연구에서 실험 동물을 고정하는 압력을 이용즉시 이미지 동물에 필수적이지만 S 있지만, 다른 사람은 성공적으로의 levamisole (42)을 사용했다.
마지막으로, 예를 들어 B. subtilis에 대한 세균 배양의 각종 오염 물질, 미토콘드리아 조각화를 유도 할 수있다; 그러므로이 분석에 적절한 미처리 컨트롤을 포함하는 것이 필수적이다. 고 침투 효과를 들어,보다 작은 샘플 크기는 미토콘드리아 네트워크 결함에 상당한 정량 데이터를 생성하는데 사용될 수있다. 그러나, 미토콘드리아 네트워크의 사소한 결함의 보급으로 인해, 동물이 소수 근절 구조의 평가에 필요한 두 숫자가 될 가능성이있다. 효과가 낮은 투과도를 갖는 경우, 명확 약물 또는 RNAi의 처리에 응답하여 이동 결함을 표시하는 동물의 선택은 대부분의 처리에 의해 영향을받은 동물에서 미토콘드리아 결함을 분석하기에 유용 할 수있다. 그러나, 전술 한 바와 같이,이 경우 필요하지 않은 것세포 내 이동과 구조에 대한 치료 효과의 정도는 동일하다. 따라서, 예를 들면, 150-200 동물뿐만 아니라, 가장 심각한 영향 동물 장애의 범위 및 정도와 중단 정도의 유무를 큰 모집단에서 본 결함의 정도를 검사하는 것이 바람직 할 수있다 이동 결함. 형광 표지 된 미토콘드리아와 다른 균주 CB5600에서 얻어진 결과를 확인하는데 사용될 수 있지만, 상이한 형광 단백질의 사용은 미토콘드리아의 기준 네트워크에 영향을 미칠 수있다. 예를 들어, 미토콘드리아를 시각화 TOMM RFP-20 융합 단백질의 사용은 미토콘드리아 지역화 GFP (17)의 사용에 비해 기준선 미토콘드리아 단편화 약해질 것으로 보인다. 이러한 면역 전자 현미경과 같은 다른 방법이 미토콘드리아 구조를 평가하는데 사용할 수 있지만 고정 단계가 필요하기 때문에, 그들은 미토콘드리아 역학의 생체 내 평가를 허용하지 않는다D. 이러한 미토콘드리아 지역화 염료의 사용과 같은 다른 방법으로 고정하지 않고 사용할 수 있으며, 따라서도 미토콘드리아 국부 GFP의 사용 대신에 사용될 수있다. 다음 섹션에서 논의 된 바와 같이, 염료의 사용은 또한 생체 내 미토콘드리아 기능의 조 질의 평가를 허용한다.
C. elegans의 생체 내에서 미토콘드리아 막 전위 평가
염료의 다양한 라벨 미토콘드리아 (28)를 사용할 수 있습니다. 이 염료는 라이브 C. elegans의에서 미토콘드리아 네트워크 구조를 시각화하는 다른 방법을 제공합니다. 그들은 미토콘드리아 막 전위에 따라 미토콘드리아에 축적하기 때문에 이러한 염료의 대부분은 생체 내에서 미토콘드리아 기능의 원유 평가를 할 수 있습니다. 을 통해 섭취 여기에 우리가 사용하고 C (32) H (32) CL 2 N 2 O약간의 추가로 인해 0.5 % DMSO에 용해에 의해 제공되는 투과성으로의 표피를 통해 웜을 입력과 소화 기관,. 셀 C (32) H (32) CL 2 N 2 O에 항목을 수행하면 산화하고 아미노산 (예를 들어, 메티오닌과 시스테인)를 포함하는 황을 결합하는 미토콘드리아에 의해 압수됩니다. 이러한 염료 펩타이드 복합체의 형성은 H (32) CL 2 N 2 O는 한 번 28 레이블 미토콘드리아에 남아 C (32)을 의미한다. 미토콘드리아 염료의 사용과 주요 어려움들은 동물의 모든 미토콘드리아 레이블 것이다. 그러므로 우리는 CB5600, 근육의 미토콘드리아 네트워크 구조를 평가하기위한 전술 한 바와 같은 변형에 라벨링을 수행했습니다. 붉은 염료 미토콘드리아, 근육 미토콘드리아에서 GFP 발현 벌레의 변형 및 삼중 대역 통과 필터를 사용함으로써, 이미지에 미토콘드리아 O를 찾는 의해 근육에서만 미토콘드리아 비교적 간단빨간색 염료 및 GFP 표시 미토콘드리아의 colocalization을하여 범위. 염료 사진 표백 강도 높은 형광등 아래 초 내에 있기 때문에이 colocalization을 접근 방식을 수행하는데 가장 어려운 단계는 영상이다. 이 효과는 실험자가 이미지 준비 될 때까지 저전력에서 형광을 유지하고 그에 따라 형광 강도를 조정함으로써 제한 될 수있다. 하나는 염료의 사용 경험이 일단 다른 방법은 바로 조직 이미지 만 미토콘드리아 Z-스택 초점 현미경을 이용하는 것이다; 근육의 미토콘드리아 네트워크는 다른 조직에 비해 확실히 구별된다. 불행히도, 미토콘드리아 28 떠날 C (32)의 무능력 H 32 Cl2를 N 2 O는 근절 및 미토콘드리아 이미징 기술은 상술 한 바와 달리 전향 H 32 C 32 않는 경시 미토콘드리아 기능의 손실을 수행하는 데 사용될 수없는 것을 의미 CL 2 N 2 O동물 집단을 분리 이산 시점에서 첨가된다. 이 제한은 예컨대 43 전위 막의 붕괴시 미토콘드리아 떠나게 JC-10과 같은 염료를 사용함으로써 극복 될 수있다. 미토콘드리아는 C.로부터 분리 될 수있다 이후 생화학 적 분석에 대한 간스 (30). 이러한 추출은 유동 세포 계측법 이용한 친 유성 양이온 성 염료 흡수 또는 형광 플레이트 리더 (44)의 비율을 정량함으로써 미토콘드리아 막전위의 정량을 허용한다. 손상된 미토콘드리아 막 전위를 확립하는 데, 이는 양성자 구배의 손실에 민감한 bioluminometric 루시페라아제 기반 방법 (45)을 사용하여 ATP 생산의 손실로 변환 여부를 결정하는 것도 가능하다.
C.에 단백질 분해 평가 엘레
근육 단백질 분해를 평가하기 위해 여기에 사용되는 웜 균주 근육 특정 β가 포함 PD55이었다성인기에 도달하고, 다음 72-96 시간 19 번 세포질에서 안정적으로 유지되는 때까지 갈 락토시다 그 연속적 과정을 거쳐 합성된다. 성인기 β 갈 락토시다 제의 손실이 개입 세포질 단백질 분해를 증가 (19)의 트리거를 나타내는 반면에 따라서 개발 단계 β 갈 락토시다 수준의 측정은 주로 미오신 프로모터 합성에 개입의 영향을 나타낸다. β - 갈 락토시다 제 활성을 평가하는 중요한 단계는 효과적인 탈수를 보장하는 것입니다. 효과적으로 동물을 건조하는 실패는 동물의 몸 벽 근육의 X-GAL 기판 때문에 가난한 블루 컬러의 가난한 규정을 초래한다. 데시 케이 터에 시일이 선택되어야하며 샘플 진행을 평가하기 위해 건조에 걸쳐 50-10 분 간격으로 점검해야 좋은 탈수을 보장하기 위해 (즉, 20 ㎕의 샘플을 10 분 및 나머지 20 분 이내에 건조해야) 종합 탈수를 보장하는 것입니다. β 갈 락토시다 제 분석은 활성 분석 따라서 적절한 제어가 필수적이다. 또한, 열화가 발생 증명하지 않는 제어하는 처리 조건에 대하여 성인의 얼룩을 감소; 오히려 치료에 대한 반응에서 감소 된 효소 활성을 나타낸다. 저하를 확인하기 위해 더 많은 노동 집약적 인 웨스턴 블롯 분석은 β-갈 락토시다 제 (13)에 대해 완료하고이 계산 웜의 작은 인구에 정량의 단백질 분해를 허용해야합니다. 웨스턴 블롯 밴드 밀도는 ImageJ에 (46)를 사용하여 정량화 할 수있다. 이 방법의 또 다른 한계는 유전자 변형 단백질의 사용이 성능 저하의 생리적 타겟으로하고 단백질 체학 및 / 또는 대상 가설 중심의 서양 말 (13)를 고용해야 같은 답변을 통보하지 않습니다. 마지막으로,이 연구에 사용 된 유전자 변형 단백질의 합성 등 성인 초기 19 차단 C. 근육 단백질 합성의 변화를 조사하고자 할 때, 다른 방법이 이용되어야 근육 엘레 간스; 예를 들면, 안정 동위 원소 또는 방사성 방법.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) | Invitrogen | M-7512 | Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential |
| DMSO | Thermo Scientific | 67-63-5 | |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Na2HPO4 | BDH | 301584L | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| MgSO4 | Sigma | M-7506 | |
| Microscopy Slides | Starfrost | K220 | |
| Microscopy Cover Slips | VW2 International | 631-0124 | |
| 1.5 ml Eppendorph Tubes | Fisher Scientific | FB74031 | |
| Dessicator | Nalgene | D2672 | |
| Nikon Microscope | Nikon | H600L | Nikon H600L microscope with proprietary software |
| Nikon Camera | Nikon | DS-Fi1 | Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera |
| Zeiss Microscope | Zeiss | Ax10 | Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter |
| Plates 9 cm | Starstedt | 82-1473 | |
| Plates 6 cm | Gosselin | BP53-01 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Na3PO4 | Sigma-Aldrich | 7601-54-9 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside | Sigma-Aldrich | 7240-90-6 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 68-12-2 |
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