Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP Published: November 13, 2014 doi: 10.3791/52043
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1MRC/ARUK Centre for Musculoskeletal Ageing Research, University of Nottingham

Summary

İskelet kası hareket etmek için gerekli olan ve bedenimizin ana protein deposudur. C. elegans içinde kas sağlık ölçüleri tanımlanmıştır. Kas yapısı ve fonksiyonu için Aday değişiklikler lokalize GFP ve katyonik boyalar kullanılarak değerlendirilir.

Abstract

Kas beslenme, egzersiz ve hastalık durumundaki değişikliklerle yanıt dinamik bir dokudur. Yaşı ve kas kitlesi ve işlevi kaybı, önemli bir halk sağlığı yükler bulunmaktadır. Şu anda hastalık ya da yaşla birlikte kas sağlık genetik düzenlenmesi hakkında biraz anlıyorum. Nematod C. elegans, ilgi duyulan biyolojik süreçlerin genomik düzenleme anlamak için belirlenmiş bir modeldir. Bu solucan vücut duvarı kasları yüksek metazoon türlerinin kasları ile homoloji geniş ölçüde görüntüler. C. elegans şeffaf bir organizma olduğu için, mitokondri ve sarkomer GFP yerelleştirme in vivo bu yapıların görülmesini sağlar. Benzer şekilde, hayvanların bir mitokondriyal membran potansiyeli varlığına dayalı birikir katyonik boyalar, beslenme, in vivo mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesini sağlar. Kas protein homeosta Bu yöntemler, hem de değerlendirmesis, kas performansı fonksiyonel önlemlerle alt-hücresel kusurlar arasında anlamlı bir ilişki sağlamak için, hareket deneyler şeklinde, bütün hayvanlar kas fonksiyonunun değerlendirilmesi ile birleştirilir. Böylece, C. elegans kas yapısı ve fonksiyonu üzerine mutasyonlar, gen demonte ve / veya kimyasal bileşiklerin etkisini değerlendirmek için güçlü bir platform sağlar. Son olarak, GFP, katyonik boyalar ve hareket deneyleri gibi değerlendirilir, non-invaziv, kas yapısı ve fonksiyonu prospektif çalışmalar tüm yaşam seyri boyunca yapılabilir ve şu anda bu kolayca başka bir organizmada in vivo araştırılması edilemez.

Introduction

Kas iyi hareket, duruş desteği ve metabolizmasındaki rolü için takdir çok fonksiyonlu bir doku vardır. Sağlıklı kas gelişimi ve bakımı çok sayıda hücresel süreçleri ve bileşenlerinin koordinasyonunu gerektirir. Ya hasar veya hastalık nedeniyle, yanlış düzenlemenin değiştirilmiş kas yapısı ve / veya işlevi ile sonuçlanır oluşabilir. 1,2 kütle ve özellikle kas gücü ve dayanıklılığı 3-5 kas negatif mortalite ile ilişkilidir beri kas fonksiyonunda yaşa bağlı düşüş, batı dünyasında sağlık bütçelerine önemli bir yük sunuyor. Böyle değiştirilmiş mitokondriyal fonksiyon veya sarkomer bozulması gibi bozulan kas fonksiyonu ile ilgili yönleri, ölçüm genel kas gelişimi ve sağlığı destekleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir.

Cı aenorhabditis elegans (C. elegans), mikroskopik bir nematodu bes olduğuonun tüm genom 6 dizilimi ilk çok hücreli organizma, RNAi 7 kullanılarak susturulmuştur genlere sahip ilk ve ilk olarak önerilmiştir, tüm hücre soyu 8 ve nöroanatomi 9 belirlenmiştir. C. elegans için tek metazoon çünkü t bilinir Sydney Brenner 10 tarafından 1974 yılında davranışın genetik kontrolü ve bunun önemi ve sonraki çalışma çalışma için model C. elegans araştırmacılara verilen üç Nobel Ödüllerinin ilk tanındı. C yaklaşık% 35 genler C. elegans kas gelişimi 11 genetik kontrolünü anlamak için kullanılan bir anahtar organizma olmak, insanlarda ortologlara belirledik elegans. Neredeyse C. elegans genom her gen RNAİ'nin 7,12 aşağı çaldı olabilir. Böylece, tam gelişmiş kas genleri aşağı vurma, genetik bileşenleri yeniden katkıdakas sağlığı gulation göreli basitliği 13 ile araştırılabilir.

RNAi, mutantlar ve kimyasal bileşiklerin kullanılması kombine yeteneği C. 16 yaş ve hastalık modellerinde 17 kas yapısı ve fonksiyonu genetik düzenlenmesini 7,14,15 keşfetmek için bir öncü sistem elegans yapar. Kas yapısı ve / veya işlevi üzerine kimyasal bileşiklere gen demonte, mutasyonu ve / veya maruz kalma etkisi çok yönlü olarak yoluyla ölçülebilir. Burada kısaca kas sağlık prospektif çalışmalarda kullanılabilecek çok olan C. elegans kas yapısını ve işlevini değerlendirmek için basit teknikleri anlatıyor.

Yeşil floresan protein geliştirme (GFP) 18 spesifik proteinlerin mevkiinde C. elegans organellerin genel yapısı, her iki görselleştirilmesini mümkün kılmıştır. Burada GFP speci ifade açıklaryöne- lik, gövde duvarı, kas mitokondri içinde, çekirdekler ya da sarkomer bu alt-hücresel yapıların distrofi mevcut olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Yapısı her zaman fonksiyonu için güvenilir bir vekil değil, biz de in vivo katyonik boyaların kullanımı kas içinde bozulmuş mitokondrial membran potansiyelinin değerlendirilmesini sağlar açıklar. Boyalar GFP ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman, bunlar ömrü boyunca geçici bir şekilde mimari ve fonksiyon çalışma izin verir. Son olarak, aynı zamanda bu önlemlerin tüm hareket deneylerin kullanımı ile, bütün hayvanlar kas sağlığında değişiklikler belirlemek için kullanılabilir nasıl kas içinde protein homeostasisi değerlendirilebilir ve açıklar. Gen demonte, mutasyonları ve / veya kimyasal bileşikler ile birlikte bu teknikler, belirli bir gen ya da bileşikler, in vivo koşullarında, kas sağlığı üzerinde olumsuz etkileri ne çalışmak için güçlü bir cephanelik sağlar. C. elegans arasında yapısı, metabolizma ve kas brüt fonksiyonu paralelliklermemeliler C. elegans insanlar dahil yüksek organizmalarda, içinde kas düzenleme anlamak için olağanüstü bir model organizmadır demek.

Protocol

1. suşlar, Kültür ve Mikroskopi

  1. C. elegans Kolu ve korumak suşları daha önce 19 nitelendirdi. Suşları Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) edinilebilir.
    NOT: mitokondri ve çekirdekler lokalize GFP füzyon proteinleri ile bu deneylerde kullanılan suşlar CB5600 (o-8 (e1489) IV,; PMYO-3 :: Mtgfp) ı ccIs4251 (PMYO-3 :: Ngfp-lacZ) idi; Unc-; kontraktil aparat ve PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5) lokalize GFP füzyon proteinleri ile; PJ727 (unc-54 :: lacZ V jls01 (myo-3 :: GFP, rol-6 (su1006))) 54 :: lacZ sitoplazmada lokalize β-galaktosidaz füzyon proteinleri ile) v).
  2. Daha önce diziden RNAi bakterileri kuşaklı RNAi deneyler 13 için tarif ve elde gibi komple RNAi'nin deneyler Marc Vidal ve ark. 12 tarafından inşa ORF-RNAi kütüphane doğrulandı.
  3. Ihtiva eden suşlar Konstrukt <em> ccis 4251, jls01 veya ccis 55 standart teknikler 20 kullanılarak. Sırasıyla, mitokondriyal ağ yapısı, miyozin örgüt veya proteostasis durumunu değerlendirmek için bir yük oluşturmak için bu transgenleri kullanın. Her hayvan isteniyorsa bu alt-hücre bölümlerinde birinde bakarak nerede bir mutant haline suşları çapraz.
  4. PtdIns-3-kinaz inhibitörü kullanmak, LY-294002 (LY) olarak daha önce 21 nitelendirdi. Kısaca, kuru OP50-tohumlu NGM plakalar üzerine 160 uM'lik bir nihai konsantrasyonda LY-294002 ekleyin.
  5. Yaygın olarak, GFP-tabanlı deneyler için bir GFP filtresi ve Cl 2 N 2 O H 32 C 32 ile in vivo membran potansiyelinin değerlendirilmesi için aynı anda, kırmızı, yeşil ve mavi kanalların görüntüleme sağlayan bir üçlü-geçiş filtresi ile bir mikroskop kullanarak tüm görüntüleri yakalayın MitoTracker Kırmızı CMXRos olarak pazarlanan. Görüntü işleme yazılımı görüntü analizi ve şekil hazırlık yapınız.

  1. Önce gerekli 1 gün, asgari bir M9 tampon yapmak - 22.04 mM KH 2 PO 4, 42,27 mM Na 2 HPO 4, 85,56 mMNaCl (nihai konsantrasyonlar), ve otoklav ile sterilize. Bir kez 45 ° C'ye kadar soğutuldu, çökeltme 22 bilmek otoklav sonrası 1 mM'ye MgSO 4 steril ekleyin. M9 50 ml tüpler içinde 4 ° C ve kana soğumaya bırakın.
  2. Deney gününde, L1 larvalarının yüksek sayıda tek 9 cm'lik plakasına 3 mi M9 tampon ekleyin. Bir açıyla plaka ile agar yüzeyine karşı M9 sıvı ve pipetleme aspire art arda plaka yıkanır.
  3. Plakadan L1'in yıkayın ve daha sonra bir pipet kullanarak 10 ml'lik bir test tüpüne M9 aktarın.
  4. Büyük yetişkin ve daha sonra larva hayvanlar test tüpünün dibine düşmesine izin 2.5 dakika bekletin ve daha küçük L1 hayvanlar t yakın kalırM9 tampon op.
  5. Bir pipet kullanarak test tüpünde M9 ilk 500 ul çıkarın. Sonra diseksiyon kapsamında 500 ul OP50 numaralı seribaşı yeni NGM plaka M9 içeren L1 larvaları pipetle.
  6. Tipik olarak, plaka başına ~ 200-300 L1 larva transfer hedefliyoruz. Gerekirse, OP50 besin kaynağı tüketilen önlemek için taze OP50 NGM plakalar üzerine hayvan almak, yetişkinlik günlük plakaları izlemek ve.
    Not: Bu, orijinal plaka üzerinde L1'in sayısına bağlı olarak büyük ölçüde değişiklik gösterir, ancak bu genellikle P1000 pipet kullanarak M9 1-3 düşmesi.
  7. Bireysel hayvanlarda prospektif çalışmalar istenirse hayvanlar yetişkinlik ulaştıktan sonra, seribaşı NGM plakaları ayrı ayrı hayvan almak. Transferi hayvanlar her 24-48 saatte larva hayvanlardan ayırmak için.

3. Hareket Tahliller 19

  1. Deney başlamadan önce, 2 saat, asgari bir M9 bir 50 ml'lik bir şişe çıkarın ve oda sıcaklığına dengelenmeye gelmeye bırakınerature.
  2. Bir mikroskop lamı üzerine 50 ul M9 tampon içine tek bir yetişkin hayvan almak.
  3. Bir sola ve bir sağa viraj, bir inme eşittir 10 sn, sol ve sağa vücut virajlı sayısını.
  4. Bir ortalama alınır ulaşılabilen en az 5 ölçümleri elde edilen toplam vücut strok sayısı tekrarlayın. Dakika başına hareket hızını vermek için altı ile bu rakamları çarpın.
  5. Bir pipet kullanarak, petri geri hayvan aktarın. Bu yöntem, C. elegan s tüm kullanım süreleri boyunca hareketin zamansal ölçüm sağlar.

Şekil 1,
Şekil 1: Hareket deneyleri. Solucanlar tamponu içine toplanmıştır sonra, bir sola doğru (A) ve bir doğru (B) eğilme tam bir hareketini elde etmek üzere birbirine eklenir(Inme).

Mitokondriyal Ağları ve sarkomer 4. Görüntüleme Vücut Duvar Kasında

  1. Not: Aynı protokol, mitokondri ve sarkomer hem görüntüleme için de geçerlidir.
  2. Onlar genç erişkinliğe ulaşması zaman önce (Bölüm 1) tanımlanmış ve 20 ° C'de 48-60 saat süreyle büyüdükçe solucanlar eşitleyin.
  3. Bir mikroskop lamı üzerinde 20 ul M9 tabaklardan alınarak 20 dişli (plaka temsilcisi) seçin.
  4. Bir kapak kayma uygulayın ve 40X büyütmede bir GFP filtre (460-500 nm, mavi ışık uyarma) altında floresan mikroskop kullanılarak görüntüye geçin.

5. MitoTracker Kırmızı CMXRos ile İn Vivo Birikim Testi (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O) kullanarak Potansiyel Membran değerlendirilmesi

  1. CB5600 (Bölüm 1), kasların mitokondri GFP ile etiketlenmiş tüm senkronize ve 20 ° C'de 48-60 saat süreyle NGM içeren OP50 erken yetişkinliğe büyür.
  2. 940,692 uM bir stok çözelti yapmak için Cı 32, H 32, Cl 2N 2 O 50 ug kana ul DMSO 100 ekleyin.
  3. 940,692 mcM stok solüsyonu 1 ul alın ve 4.70 mcM (4,70346 mcM) çalışan bir çözüm oluşturmak için 199 ul M9 içine tekrar süspansiyon. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O ışığa, çünkü kahverengi 1.5 ml tüpler bu hazırlayın.
  4. Çözeltisi (20 ul bölüntüde başına 20 erişkin solucanlar) çalışan 4.70 mcM 20 ul alikotları hazırlayın.
  5. Kahverengi 1.5 ml tüplere 4.70 mcM C 32 H 32 Cl 2 N 2 O 20 ul içine 20 yetişkin hayvan almak. 1 saat boyunca 20 ° C'de inkübe edilir.
  6. 1 saat inkübasyonu takiben, 10 saniye boyunca 2000 xg'de solucanlar, santrifüj içeren kahverengi 1.5 ml tüpler için 1 ml M9 ekleyin ve sonra süpernatant kaldırmak. Kalan 20 μ solucan pelet resuspending ve aktarmadan önce bu yıkama işlemi tekrarlayınl görüntüleme için bir slayta (solucanları içeren).
  7. 40X büyütme aynı anda iki, kırmızı, mavi ve yeşil kanalları görselleştirme sağlayan bir üçlü geçiş filtresi kullanılarak mitokondri görüntüleri çekmek. Üçlü geçişli filtre kullanılarak görüntüleme turuncu gibi görünen mitokondri lokalize C 32 H 32 Cl 2 GFP ile N 2 O co-lokalizasyon gösterir.
  8. Turuncu mitokondri bir görüntü alınmış olması, uzaklaştırılmalı filtreler maksimum ayarlarına ilişkin dalga boyu 540/25 nm ışık kullanılarak 10 sn için hayvan foto-ağartıcıdır. Bu mitokondri içindeki kırmızı çamaşır suyu ve kas mitokondrilerinde ko onaylamak için yalnız mitokondriyal GFP ortaya çıkaracaktır.

C. elegans kas Protein Parçalanabilirliklerinin 6. Değerlendirilmesi

  1. NGM plakalar için senkronize PD55s (veya lacZ transgen ihtiva eden herhangi bir suş) OP50 (Kısım 1) ile tohumlandı. 2 de 48-60 saat boyunca genç yetişkinliğe kadar büyür0 ° C'dir.
  2. Bir mikroskop lamı üzerine 20 ul GKD 2 O içine 20 erişkin solucanlar almak. Denemek ve sadece solucan ve pick ile herhangi bir bakteri almak için dikkatli olun. Kalem mikroskop lamı etiketleyin.
  3. 30 dakika kuru ve hayvanların kütikül çatlak için bir desikatöre yerleştirin. Mühür etrafında yağı ile desikatörde sıkı bir mühür sağlamak.
  4. Kuruma kontrol diseksiyon kapsamı (Şekil 2) altında etkili olmuştur.
  5. 3.5 dakika sonra slayt üzerinde aseton buharlaşmasına izin vermek için 15 dakika boyunca, oda sıcaklığında, bir kağıt havlu üzerine bir mikroskop lamı bırakmak için buz-soğuğu aseton içinde bir mikroskop lamı daldırın. Bu noktada da X-gal ve oksidasyon tampon çözülmesi ve oda sıcaklığına dengelenmesi sağlar.
  6. Nazikçe homojen olmasını sağlamak için oksidasyon tamponu ve vorteks ul ile 100 ul 2 X-gal ekleyin. Bu X-gal / oksidasyon tampon usta karışımıdır.
  7. O her X-gal / oksidasyon tampon ana karışımı 20 ul ekleyin20 solucan orijinaldeki alanı. Ana karışım tamamen tamamen bütün hayvanları kapsar sağlamak için bir diseksiyon kapsamında kontrol edin. Yavaşça hayvanlar kapsamında değildir nerede alanlar üzerinde ana karışımı taşımak için mikroskop lamı eğin.
  8. 20 ° C de 1-2.5 saat süreyle bir nem odasında bir mikroskop lamı yerleştirin. Resim hayvanlar koyu mavi renk kontrol hayvanlarının vücut duvarı kasları içinde mevcuttur. Hayvanlar görüntülü olmalıdır belirlemek için bir diseksiyon kapsamında her 15 dakikada bir kontrol hayvanları değerlendirin.

Şekil 2,
Şekil 2: β-galaktosidaz tahlilleri kullanılarak kas protein yıkımı Değerlendirilmesi. AcZ transgen ihtiva eden (A) 'Hayvanlar, bir mikroskop slayt (B) 20 ul GKD 2 O Petri kaplarından toplanır. Hayvanlar kurutulmuş ve kırık olmak (D) 'de yıkanır. Aseton (E) X-gal / oksidasyon tamponu ana karışımı ilave edilir buharlaşır kez. Kontrol hayvanlarında, mavi renk gelişimi, bir koyu mavi renk hayvanlarda (L) uzunluğu boyunca elde edilene kadar zamanı t = 0 dakika boyunca (F) ile 15 dakikalık aralıklar (FL) değerlendirilir. Solucanlar Görüntüleri FL AE ve 8X de 2.5X büyütme alınır. C, D, F, G ve L yakınlaştırır orijinal büyütme 4X bulunmaktadır.

Representative Results

Hareket Tahliller Hareket Kusurları belirlememize

Hareket düşüş C. mortalite iyi bir belirleyicisidir elegans 16 ile kas sinir sistemi ile ilgili sorunları gösteren oranları azalmıştır. Hareket değişiklikler, hareket deneyleri ile değerlendirildiği gibi, 23, belirli bir gen ya da ilaç tedavisi (Şekiller 3-5) karşı ya da mutant hayvanlarda 13 RNAi neden olabilir. Hareketin bir düşüş kompleks I, III, IV ya da V 24 kodlayan elektron taşıma genlerin aşağı gelişimsel vuruş örneğin aşağıdaki değiştirilmiş gelişmenin sonucu olabilir. Ayrıca, belirli müdahaleler sonrası gelişimsel fizyolojisi üzerinde etkisini araştırmak amacıyla sadece yetişkin C. elegans üzerinde test edilebilir. Örneğin, hayvan kodlayan unc-112, karşı RNAi ile işlemden geçirildi C ihtiva eden integrin lokalize kindlin-1 orthologue eleganskas bağlanma kompleksleri (Şekiller 3 ve 4) ya da gaz-1, elektron taşıma zinciri (Şekil 4) kompleks I bir bileşenini şifrelerken, 48-72 saat sonra-erişkinliğe kadar kontrol karşı hareket ilerleyen bir azalma gösterir. Bu kas fizyolojisi ile ilgili sorunlar göstergesi olabilir. Benzer bir şekilde, 24 ile ilgili bir hareket kaybı - 72 saat PI3K inhibitörü LY-294002 (Şekil 5) ile muamele normal olarak geliştirilmiş, yetişkin tedaviye tepki olarak görülmektedir. İkinci bir RNAi tedavi, mutasyon ya da bir başlangıç ​​müdahaleye karşılık olarak az hareket gösteren hayvanlarda hareketi geri bir ilacın etkisini test etmek de mümkündür. Örneğin, unc- 112 mutantlan dim-1 ila 13 ikinci bir mutasyon mevcudiyetinde zayıflatılmaktadır yabani tip hayvanlara kıyasla hareketinde ölçülebilir bir azalma gösterir. Bu nedenle, hareket deneyleri neuromuscu değiştirmek hem müdahaleleri tespit edebilirsinizlar geliştirme ve / veya fonksiyon yanı sıra geliştirmek ve / veya nöromusküler fonksiyonu geri olanları.

Sarkomer bozulması Değerlendirilmesi

Bir hareket kusur tespit ettikten sonra, bu hareket kusurun nedeni sinir, kas, ya da her ikisi mesafede olan problemler izah edilebilir olup olmadığını belirlemek için genellikle arzu edilir. Sarkomer üretimi ve hareket kuvveti böylece büzülmesini sağlar, kas gibi çok proteinli komplekslerdir. Kontraktil aparat lokalize miyosin GFP füzyon proteinlerini eksprese kullanılarak hayvanlar tarafından, miyosin filamentler ve sarkomer kesintileri ölçüde geliştirilmesi ve / veya yetişkinlikte de, ayrı ayrı hayvanlar nispeten non-invazif ve ileriye doğru görülmektedir. Yabani tip hayvanlar, her vücut duvarı kas içinde çoklu yeşil paralel düz çizgiler (Şekil 3) görünmesini dizilmiş sarkomer gösterilecek. Bu normal dizilerde için bozulma ile nispeten küçük olabilirparalel kalan yerine birleştirmek için görünen dizilmiş sarkomer. T unc-112 RNAi görülebilir Bu fenotip, = 24 saat ya da 48 saat (Şekil 3), memeli kas aktin bağlanma sitelerinin Z-hattı akış karşılaştırılabilir. Benzer şekilde, dizilerin küçük porsiyonlarda çökebilir ya da 48 saat ya da t = 72 saat (Şekil 3) = t unc-112 RNAİ'nin ile tedavi gibi tamamen gibi kaybolabilir. Bir hareket kusuru görüntülemek hayvanların kas içinde sarkomer kusurların varlığı (Şekil 3) hareketi kusur için hesap yeterlidir ancak mutlaka bir müdahaleye tepki olarak kas, sinir ve / veya diğer dokuları ile diğer sorunları ekarte etmez .

Mitokondriyal Ağı Yapısının Değerlendirilmesi

Bir hareket kusur bulunması durumunda sebep veya hareket DE katkıda bulunabilecek diğer kusurlar için kas incelemek bazen arzu edilirfect. Mitokondri hücre enerjisinin büyük bir kısmını sağlar ve kas gelişiminin sağlanması için mevcut enerjiyi azaltır, indirgenmiş ATP karşılığının sonucu olabilir hareketi azalır. Böylece mitokondri yapısı anormallikleri için de incelenebilir. O hızlı mitokondriyal parçalanma neden olur gibi sodyumazid hayvanları uyuşturan için önemli değildir; Bu deneylerde hayvanlar kapak kayma tarafından uygulanan basınç ile hareketsizleştirildi. Vahşi-tip C. elegans içinde vücut duvarı kas, mitokondri organize ağları içinde (Şekil 4) bulunan ve mitokondri bir retikulum 25 olarak var ve fonksiyonu. Mitokondri ağının bozulması ağ (gaz-1 RNAi, Şekil 4B) 26 parçalanması olarak görülmektedir. Parçalanma organize ağlara no görünüş unc-112 RNAİ'nin (Şekil 4B ve C) 13 ile muamele gibi kalır kadar şiddetli hale gelebilir. Wi gibisarkomer yapısında inci aksamalar, bir hareket kusuru görüntülemek hayvanlarda kas mitokondriyal yapısındaki kusurları hareket kusuru açıklamak için yeterli olabilir ama bu mutlaka kas, sinir ve / veya diğer dokuları ile diğer sorunları ekarte etmez. Örneğin, unc-112 mutantlar 13 ve tedavisi unc-112 RNAi (Şekil 3 ve 4) ekranındaki hem bozulur sarkomer ve mitokondriyal yapı bozulur.

In Vivo Mitokondriyal Fonksiyon Değerlendirilmesi

Mitokondriyal membran potansiyeli dolayısıyla, in vivo mitokondriyal membran potansiyeli değerlendirmek amacıyla yeteneğini proton itici gücü oluşturmak ve ATP 27 üretmek için mitokondri kapasitesini belirleyen ATP üretmek için o hayvanın kapasitesini gösterir. Mitokondriyal yapısal bozukluğa veya mitokondriyal fonksiyonel kapasitesini değiştirebilir olmayabilir gibi, desi olabilirayrılamaz değiştirilmiş mitokondriyal yapısını sergilemeye hayvanlarda mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için. Cı 32, H 32 CI2 N2 Ç zar potansiyeli bulunur ve mitokondri 28 (Şekil 4C) leke tüm hücre tiplerinde, ve, mitokondri ve burada birikir. Özellikle kas mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için, bir özel kas mitokondri (Şekil 4C) üzerine bir müdahalenin etkilerini göstermek C 32 H 32 N 2 O Cl 2 ve GFP etiketli kas mitokondri kullanabilirsiniz. Örneğin, unc-112 RNAİ'nin mitokondriyal membran potansiyeli şu tedavi kaybı matrisi girerek H 32 Cl 2 N 2 O C 32 önler. Mitokondri Bu nedenle, çok az gösterirse, mitokondri GFP etiketleme (Şekil 4C) ek olarak mitokondri herhangi bir kırmızı boyama. Foto-ağartıcı ayrıca gözlemlenen doğrulamak için kullanılabilirmitokondri, özellikle kas (Şekil 4C) olanlardır. Düşük bir kapasite belirlenmesi ATP gözlenen hareket kusur için hesap yeterlidir ancak kas, sinir içinde diğer sorunları ekarte etmez üretmek ve / veya diğer dokular için. Azalmış ATP üretim kapasitesi insanlarda 29 ve 30 yaşlanma hastalık durumları ile ilişkili olduğundan olursa olsun, bir müdahaleye tepki olarak böyle bir kusurun tespiti ATP üretim kapasitesini artırmak ve bunların daha sonra olabilir bileşiklerin ve / veya RNAi tedaviler için tarama için bir platform sağlar Daha fazla terapötik potansiyeli araştırılmalıdır.

Protein Parçalanabilirliklerinin Değerlendirilmesi

Bir hareket kusur ve normal sarkomer ve mitokondri varlığında da neden olabilir veya hareket kusur katkıda bulunabilecek diğer kusurlar için kas incelemek için zaman zaman tercih edilir. Protein homeostazı korumak için yeteneği bir imza ne deMal sağlığı, protein sentezi ve / veya protein degradasyonu bir artışa azalma ise 31 yaşlanma ve bir çok hastalıkta 32,33 bir sonucudur. Bu yüzden değiştirilmiş protein homeostaz için bir hareket bozukluğu olan hayvanların kasları incelemek için arzu edilebilir. Bu sitosolik kas protein seviyelerinin değerlendirilmesi yoluyla gerçekleştirilebilir. Transgenik kodlanan proteinlerin, kas özel proteostasis değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. Örneğin, miyozin bir N-terminali kısmına kaynaşık β-galaktosidaz, ihtiva eden hayvan kullanımı, bir miyozin promoterin kontrolü altında sentezlenmiştir ve güçlendirici sitosolik kas protein içeriğinin 19 değerlendirilmesine olanak tanır. Vahşi tip yetişkin mavi leke varlığı aktif bir β-galaktosidaz varlığını ve patolojik sitosolik protein yıkımı yokluğunu gösterir. Tedaviye tepki olarak boyanmasının kaybı patolojik protein yıkımı (Şekil 5 olduğunu ortaya koymaktadır 13,14,19 96 saat sonra erişkin. LY-249002 ile tedavi edilen hayvanlar bir leke kıtlığı ise Örneğin, tedavi edilmemiş vahşi tür hayvanlar, erişkin sonra (Şekil 5), yoğun bir mavi renk 72 saat gösterir. Sarkomer yapı ve mitokondriyal fonksiyon hatası olduğu gibi, ve de patolojik kas protein yıkımı varlığı gözlemlenen hareket kusur hesaplamak için yeterli olan fakat zorunlu kas, sinir, ve / veya diğer dokuları ile diğer sorunları ortadan kaldırmaz.

Şekil 3,
Şekil 3: (A). Unc-112 RNAi t = 72 saat de önemli bir hareket kusuru olur vücut duvarı kas içinde dizilmiş A-band yapısının (B) Değerlendirme. Ağırlık olarakt, kas A-bantlar (wt zoom bakınız) genç yetişkinlik (t = 0 saat) olarak düz çizgiler görünür ve yetişkinlik 72 saat kadar ötesinde büyük ölçüde homojen kalır. unc-112 RNAi küçük alanlarda mimari kaybetmek sarkomer neden olur kas (t = 24 saat), çöktü ve eksik sarkomer (t = 48 saat), kümeleme (t = 72 saat üst panel ve zoom) ve sarkomer doğrusallık (t = 72 saat alt panel ve zoom) kaybı. Ölçek çubukları 25 mcM temsil ve yakınlaştırmalar 2.5X vardır.

Şekil 4,
Şekil 4:. (A) 112-unc veya gaz-1 RNAi bir hareket kusuru neden vücut duvarı kas içinde mitokondriyal yapı (B) Değerlendirme. Kas mitokondri genç yetişkinlik (ağırlık) itibariyle ağ düz çizgiler olarak görünür. Unc-112 RNAi olan hayvanların tedavisi mitochondr sonuçlanırDaha önce 24 saat ve yetişkinlik (yakınlaştırır ve ok) 13 72 saat arasında gözlemlenen ial parçalanma. Aynı şekilde, gibi mitokondriyal ağların parçalanma RNAi gazına karşı -1 sonuçlar daha önce 26 gözlenmiştir. Bunlar 72 saat (zoom ve oka bakınız). Vivo mitokondriyal membran potansiyeli (C) Değerlendirilmesi için yaygın örgütsüzlük t = 24 saat ve ilerleme de mitokondriyal ağında küçük boşluklar olarak mevcuttur. Ayrıca GFP mitokondri lokalize içeren hayvanlarda, N 2 O C 32 H 32 Cl 2 vücut duvarı kas mitokondri içinde birikir ve 72 saat sonrası yetişkinliğe kadar genç yetişkinlik (t = 0 sa) bir üçlü-pass filtre altında turuncu renkte görülür. Kalan mitokondri N 2 O vs ağırlık Cl 2 H 32 C 32 daha az birikimini gösteriyor nerede 72 saatte gösterildiği gibi unc-112 RNAİ'nin tedavisi membran potansiyeli ilerici kaybına neden olur. 10 se için Photobleachingc 540/25 nm ışık beyazlatıcılar MitoTracker gelen kırmızı kullanarak ve kas mitokondri (+ Fotoğraf ağartıcı) lokalize GFP ortaya koymaktadır. Ölçek çubukları 25 um temsil ve 2.5X olan yakınlaştırır.

Şekil 5,
Şekil 5 (A) Tedavi LY-294002 hayvanlarla bir hareket bozukluğu oluşturan bir β-galaktosidaz deneyi kullanılarak protein yıkımı (B) değerlendirmesi.. L1 larvaların ağırlık senkronize Yaş OP50 (ağırlıkça kontrol) veya NGM ile seribaşı NGM aktarmadan önce 20 ° C (t = 0 saat) genç erişkinlik büyüdü 20 ° C'de 24 saat boyunca LY-294002 (PI3K inhibitörü tedavisi) numaralı seribaşı . A'da, yaklaşık 20-30 hayvan t = 0 saatte β-galaktosidaz aktivitesi (mavi) ile, 24 saat, 48 saat ve 72 saat sonra boyanır.

Discussion

Bu yöntemler, bir hareket bozukluğu neden olmak için yeterli olan alt-hücresel bozukluklarının belirlenmesi için hareket macrophysiology gelen kas keşfini sağlar. Kombine edildiğinde bu yöntemler kas ayrıntılı analizini sağlar. Kazanılan içgörü genel fizyoloji, patofizyoloji ve yaşlanma ilgilendirmeyen kas odaklı hipotezler ileri test sağlar.

Hareket Tahliller

Bir hareket kusur Normal konlar bir bozulma gösterir. Bu sinirlerin veya kas özgü olabilir veya çeşitli dokulardan arasında ortak olabilir. Tamamladıktan hareket testlerin en zor aşamaları nüfus ve / veya tedavinin temsilcisi olan solucanlar seçerek ve aynı zamanda deneyci M9 transfer üzerine hayvan zarar vermez garantiliyoruz. Bu hareketin bir temsilcisi ve doğru bir değerlendirme elde etmek için büyük bir örneklem büyüklüğü olması önemlidir. Yüksek kalem tahlil zamanÖrneğin etrant etkileri, sık sık mutantta görülmektedir, on hayvan bir örnek boyutu her hareket on kez değerlendirilen vahşi tip karşı istatistiksel olarak anlamlı fark için yeterlidir. Ancak, hareket deneyleri ve kültür C. elegans kolaylığı basitliği solucanlar yüzlerce hızlı kantitatif sonucu sağlamak amacıyla değerlendirilebilir anlamına gelir. Bir nüfusun yalnızca bir bölümünde mevcut görünür etkilerini tahlil zaman en çok etkilenen hayvanlarda defekt şiddeti yanı sıra etkilenmiş görünüyor nüfusun ne kadarının belirlemek önemlidir. Bu gibi durumlarda, hayvanların daha fazla sayıda etkilenen nüfus kısmı için çok az veri sağlamak üzere değerlendirilmelidir. Sıkça ilaç ve RNAi tedavileri hem nüfusun küçük bir bölümünde şiddetli hareketi kusurları üretecek. Bazı durumlarda Aff oranı artacak tedavisi ve ya da teslimat yöntemi dozunu arttırmakyansıtılmaktadır hayvan ve yürütülmesini doz tepki eğrileri, bir ilaç veya RNAi optimum yoğunluğunu belirlemek faydalı olabilir. Bu hareket, testin ikinci bir sınırlama solucan hareket değerlendirmek için manipüle olmasıdır. Bu nedenle, solucanlar hem uyarılmamış ve sıvı içinde aldı bir ozmotik basınç belli bir dereceye kadar tabi tutulmaktadır. Ozmotik basınç derecesi M9 veya Bu suya karşı tamponu 19 ile sınırlanabilir. Bu sınırlamalardan bazıları ImageJ 35 Piyasada mevcut izleme sistemleri 34 ya da ücretsiz eklentileri kullanarak plakalar üzerinde alışılmış hareketinin ölçülmesi ile hafifler. Bir hayvanın hareket hızını ölçme ömrü boyunca ölçülen ve bu yöntemin non-invaziv kas fonksiyonlarının prospektif ömür boyu çalışmalar için anahtar olabilir fonksiyonu değişiklikleri de dahil olmak üzere genel kas sağlığı ile ilgili önemli bilgiler sağlayabilir.

Kontraktil Aparatı Görüntüleme

<p class = "jove_content"> resim kasılma aparatı yapısı Burada kullanılan solucan suşu vücut duvarı kasları içinde sarkomer lokalize bir miyozin GFP füzyon proteinini ifade PJ727 36 oldu. Bu türün kullanımı, canlı hayvanlarda sarkomer yapısı görselleştirme sağlar. Yukarıda tarif edilen hareket tahliline benzer biçimde, sarkomer yapısını değerlendirmek GFP etiketli sarkomer kullanılmasının önemli bir avantajı, bu yöntem nispeten invazif olmayan ve bu nedenle ileriye ömrü boyunca, ayrı ayrı hayvanlar içinde sarkomer yapısını takip etmek için kullanılabilir olmasıdır. Bu yöntemle büyük zorluk görüntülü solucanlar zor iyi odaklanmış görüntüler elde etmek için yapar, yine hareketli nedenle hayatta ve olmasıdır. Çeşitli yöntemler hareketini azaltmak ve daha basit görüntüleme yapmak için kullanılabilir; Bu anestezi veya basınç, emme ya da yüksek viskoziteli bir çözeltinin kullanımı ile solucanlar ve immobilizasyon felç vardır. Hareketsizleştirme Bu yöntemlerin her biritirme kendisi kas fonksiyonunu değiştirir gibi bir sakıncası vardır. Bu nedenle, bu analiz uygun muamele edilmemiş kontroller dahil etmek çok önemlidir. Ayrıca, seçilen bir hareketsizleştirme yöntemi, üzerinde çalışılmakta olan bir soru için ne kadar yaygın olarak kullanılan bağlı olarak, bağlı hareketsizleştirme yöntemi ile ilgili sorunlara yol sonuçları değildir teyit etmek için hareketsizleştirme en az iki bağımsız yöntemler kullanılması mantıklı bir çözüm olabilir. Burada azaltılmış hareketini başlatmak için solucanın üzerine lamel basit bir baskı kullandık. Lamel yerleştirdikten sonra, lamel altında sıvı buharlaşır ve lamel sonuç genellikle bu kolay görüntüleme sağlayacak kadar az hareket üretmek için 2-5 dakika sürer, solucanlar üzerinde daha fazla baskı üretmeye başlayacak.

Lamel sonunda, co sonra genellikle 10-15 dk aşırı basınca gelen patlamaya solucanlar neden yeterli artacak basıncı girmiştir yakından sonra solucanları izlemek için esastırverslip ek. Ek tampon solucanlar ezilme yaralanmaları önlemek için lamel kenarlarında bir pipet ucu yardımıyla eklenebilir. Eğer istenirse bu, kapak kayma altında hayvanların alınmasını engelleyen, ancak Tırnak cilası, kapak kayma kenarlarını kapatırlar ve buharlaşmasını önlemek için de kullanılabilir. Benzer bir şekilde, çözelti içindeki silikon boncuk kullanımı basınç miktarını solucanlar üzerinde lamel yerleri azaltmaya yardımcı olabilir.

Sadece bir hareket kusuru için değerlendirilmesi gibi, bu etkinin penetransdır dikkate almak önemlidir. % 80-100 hayvanlar nüfus ekranın ≤20% bir etkiliyorsa 21-79% eksik ve düşük NGM plaka üzerinde bir fenotip göstermeyen eğer Penetransı yüksek kabul edilebilir. Çok penetrant etkiler için, daha küçük örneklem büyüklükleri sarkomer kusurları üzerinde önemli nicel veri üretmek için kullanılabilir. Etki ilaca yanıt olarak açık bir hareket bozukluğu ekran hayvan düşük penetrasyonun, seçim vardır durumlardaveya RNAi uygulama en çok etkilenen tedavi hayvanlarda sarkomer kusurları analiz edilmesinde yararlı olabilir. Ancak, hareket ve sub-hücresel yapısına tedavi etkisinin ölçüde aynı olduğunu zorunlu bir durum değildir. Bu nedenle, örneğin, 100 hayvanların geniş bir popülasyonda bu kusurların ölçüde incelemek için arzu edilebilir. Bu, popülasyonda kusur dağılımının anlaşılmasını sağlar. Ayrıca en ağır etkilenen hayvanlarda kusurun derecesini incelemek ve / veya sarkomer kusur ölçüde ve hareket kusuru derecesi arasındaki ilişkiyi incelemek için istenebilir. Potansiyel zorluklar bir yana, bu yöntem sarkomer yapısı değerlendirilirken, diğer yöntemlere göre daha hızlı ve kolaydır. Bu hız ve kolaylığı, ancak, önemli bir sınırlamaya tabi olduğu, GFP füzyon proteinleri içeren sarkomer bozulduğu sarkomer 37 ve bu nedenle değerlendirme ilave daha emek-yoğun yöntemler kullanılarak teyit edilmelidir tamamen normal değildir.Bu yöntemler, 39 lekeleme falloidin polarize ışığın 38 kullanımını, ve dolaylı immünoflüoresans 40 içerir. Bu yöntemler arasında, ancak polarize ışık nispeten invazif olmayan olduğu; Diğer yöntemler tespiti gerektiren ve bu nedenle, ayrı ayrı hayvanlar arasında ileriye dönük çalışmalarda kullanılamaz, bunun yerine, sadece, bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar teyit kesit geçmek için kullanılabilir.

Mitokondriyal Ağları Görüntüleme

Mitokondriyal görüntüleme deneyleri için kullanılan solucan soyu, gövde duvarı kaslarda ve, mitokondri ve çekirdekler lokalize bir GFP β-galaktosidaz füzyon proteini lokalize bir GFP füzyon proteinini tanımlayan CB5600 7 idi. Görüntüleme sarkomer için PJ727 kullanımı ile olduğu gibi, bu soyun kullanımı canlı hayvanlarda mitokondriyal ağ yapısı görselleştirme sağlar. Bu nedenle, bu suş örneğin, indirgenmiş mitocho oluşabilir, dinamik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilirndrial füzyon ve / veya artan mitokondriyal füzyon 41. Ayrıca görüntüleme sarkomer gibi, bu yöntemle büyük zorluk görüntülü solucanlar zor iyi odaklanmış görüntüler almak için yapma, hala canlı ve hareketli olmasıdır. Yukarıda daha detaylı olarak tartışıldığı gibi çeşitli yöntemler, hareketini azaltmak için kullanılabileceği halde, mitokondri indirgenmiş hareketinin endüklenmesi müdahaleler için özellikle hassas bir görünür. Örneğin, en yaygın mitokondriyal solunum zinciri anestezikler hedef bileşenleri kullanılır ve bu nedenle, normal mitokondriyal yapı ve fonksiyonu çalışmalarında dikkatle kullanılmalıdır edilir. En paralitik ajanlar daha az sinyal nöromüsküler kavşak ve kas fonksiyonel denervasyon geçmesine neden Benzer şekilde, çoğu paralitik ajanlar mitokondriyal parçalanma uyarmak için normal mitokondriyal yapısı ve fonksiyonu çalışmaları dikkatle yeterlidir kullanılmalıdır. Bu çalışmada deneyler hayvan hareketsiz kılınması için baskı istihdamhemen görüntü hayvanlara gerekli olsa ler ama diğerleri başarıyla levamizolün 42 kullandık.

Son olarak, örneğin, B. subtilis için kültür çeşitli bakteryel kirletici maddeler arasında, mitokondriyal parçalanma uyarabilir; bu nedenle analizinde uygun muamele edilmemiş kontroller dahil etmek çok önemlidir. Çok penetrant etkiler için, daha küçük örneklem büyüklükleri mitokondriyal ağ kusurları üzerinde önemli nicel veri üretmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, mitokondriyal ağ küçük kusurlar yaygınlığı nedeniyle, bu hayvan az sayıda sarkomer yapısının değerlendirmesi için gereken iki kat fazla olması muhtemeldir. Etkisi düşük bir penetrasyonun sahip olduğu durumlarda, açık bir şekilde ilaç veya RNAi tedaviye yanıt olarak bir hareket bozukluğu gösteren hayvanların seçimi çoğu tedavi etkilenen hayvanların mitokondriyal kusurları analiz edilmesinde yararlı olabilir. Ancak yukarıda belirtildiği gibi, bu durum zorunlu değildirhareket ve sub-hücresel yapısına tedavi etkisinin ölçüde aynıdır. Bu nedenle, örneğin, 150-200 hayvanları, hem de en ağır enfekte olmuş hayvanların, bozulma derecesi ve kapsamı ile birlikte bozulma ölçüde varlığını veya yokluğunu geniş bir popülasyonda bu kusurların ölçüde incelemek için istenebilecektir hareket kusuru. Floresan etiketli mitokondri başka suşlar da CB5600 elde edilen sonuçları teyid etmek için kullanılabilir, ancak, farklı floresan proteinlerin kullanımı mitokondri taban ağ etkileyebilir. Örneğin, mitokondri görselleştirmek için bir tomm-20 TTT füzyon proteinin kullanımı ile mitokondriyal lokalize GFP 17 kullanımına karşı taban mitokondriyal parçalanma artmasına neden görünmektedir. Bu tür bağışıklık ve elektron mikroskopi gibi diğer yöntemler mitokondriyal yapısını değerlendirmek için kullanılabilecek olmakla birlikte, bir katılaştırma basamağı gerektirir çünkü onlar mitokondriyal dinamikleri in vivo değerlendirme izin vermezd. Gibi mitokondriyal lokalize boyaların kullanılması gibi başka yöntemler tespit olmadan da kullanılabilir ve bu nedenle, aynı zamanda mitokondriyal lokalize GFP kullanım yerine kullanılabilir. Bir sonraki bölümde tartışıldığı gibi, bu tür boyaların kullanımı, aynı zamanda in vivo olarak mitokondriyal fonksiyonun ham değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.

C. elegans In Vivo Mitokondriyal Membran Potansiyelini Değerlendirme

Boyaların çeşitli etiketleme mitokondri 28 için kullanılabilir. Bu boyalar, canlı C. elegans içinde mitokondriyal ağ yapısı görselleştirmek için alternatif bir yöntem sağlar. Onlar mitokondriyal membran potansiyeli dayalı mitokondri içinde birikir, çünkü bu boyaların çoğu aynı zamanda in vivo mitokondriyal işlevsellik ham değerlendirmesini sağlar. Yoluyla yutulur Burada biz kullandık C 32 H 32 Cl 2 N 2 OBazı ek nedeniyle% 0.5 DMSO içinde çözülerek elde geçirgenliği üst deri yoluyla solucan girerek sindirim sistemi. Hücrenin C 32 H 32 Cl 2 N 2 O içine girmesinin ardından oksitlenmiş ve amino asitler (örn metiyonin ve sistein) sülfür içeren bağlar mitokondri tarafından tecrit edilir. Bu boya-peptid komplekslerinin oluşumu, H 32 CI2 N2 O kez 28 etiketli mitokondri kalır Cı 32 anlamına gelir. Mitokondriyal boya maddelerinin kullanılması ile önemli bir zorluk ve hayvanın tüm mitokondri etiket olmasıdır. Bu nedenle CB5600, kas mitokondriyal ağ yapısı değerlendirilmesi için, yukarıda tarif edilen aynı suşunda etiketleme gerçekleştirdik. Kırmızı mitokondriyal boya, kas mitokondrilerinde, GFP ifade solucanlar bir yük ve üç geçişli bir filtre kullanarak, görüntü olan mitokondri O bularak kas sadece mitokondri nispeten basittirkırmızı boya ve GFP etiketli mitokondri ko tarafından aralığı. Boya fotoğraf ağartılmış yüksek yoğunluklu floresan ışığı altında saniye içinde olduğundan bu ko yaklaşımı yapılmasında en zor adım görüntüleme olduğunu. Bu etki deneyi görüntü hazır oluncaya kadar düşük güç floresan tutulması ve daha sonra buna göre floresans yoğunluğu ayarlanarak sınırlanabilir. Bir boya maddelerinin kullanılması ile tecrübe sonra başka bir yaklaşımı, doğru doku görüntü yalnızca mitokondrilerde Z-bacalara konfokal mikroskopi kullanmaktır; kas mitokondriyal şebekeler diğer dokulara kıyasla oldukça farklıdır. Ne yazık ki, mitokondri 28 terk C 32 yetersizlik, H 32 CI2 N2 O sarkomer ve mitokondriyal görüntüleme teknikleri, yukarıda tartışılan farklı olarak, ileriye yönelik olarak, H, 32 derecede 32 sürece, zamanla mitokondriyal fonksiyonun kaybı takip kullanılamaz anlamına gelir CI2 N2 OHayvan popülasyonlarının ayrı ayrı zaman noktalarında ilave edilir. Bu sınırlama gibi 43 potansiyel membranın yıkılmasından sonra mitokondri terk ediyor JC-10 gibi boyalar kullanılarak aşılabilir. Mitokondri, aynı zamanda C ile izole edilebilir sonraki biyokimyasal analizler için elegans 30. Bu ekstre, akış sitometrisi kullanılarak lipofilik katiyonik boya alımı veya bir fluoresan plaka okuyucusu 44 oranını nicelleştirilmesiyle mitokondriyal membran potansiyelinin ölçümü sağlar. Bozulmuş mitokondriyal membran potansiyelinin kurulmuş olması, proton degrade kaybı hassas bioluminometric lusiferaz tabanlı bir metot kullanılarak 45 ATP üretimi kaybı anlamına olmadığını belirlemek de mümkündür.

C. Protein Parçalanabilme değerlendirilmesi elegans

Kas protein parçalanmasını değerlendirmek için burada kullanılan solucan türü, bir kas belirli bir β içeren PD55 olduyetişkinlik ulaştı ve sonraki 72-96 saat 19 sitosolde stabil kaldığı kadar galaktosidaz olduğunu sürekli gelişimi boyunca sentezlenir. Yetişkinlik döneminde β-galaktosidaz kaybı müdahale sitosolik protein degradasyonunu 19 artmıştır tetiklendi gösterir ise Bu durumda, gelişme sırasında β-galaktosidaz seviyeleri ölçümü ağırlıklı miyozin yükselticiden sentezi üzerindeki müdahalelerin etkisini gösterir. Β-galaktosidaz aktivitesini belirlemede önemli safhalı ve etkili bir kurumaya sağlamaktır. Etkin hayvanlar kurutulması için başarısızlık hayvanların vücut duvarı kasları X-gal alt-tabaka ve bu nedenle zayıf mavi rengin zayıf sağlanması ile sonuçlanır. Desikatörde üzerindeki mühür kontrol edilmeli ve örnek ilerlemeyi değerlendirmek üzere kuruma boyunca 5-10 dk aralıklarla kontrol edilmelidir iyi kuruma sağlamak için (yani, 20 ul numune 10 dakika ve kalan 20 dakika içinde kurutulmuş olmalıdır) kapsamlı kurumaya sağlamaktır. Β-galaktosidaz deneyi bir aktivite deneyi, bu nedenle, uygun bir kontrol kaçınılmazdır. Buna ek olarak, bu bozunma meydana ispat olmayan kontrol etmek için bir işlem koşulu, göreceli olarak yetişkin azaltılmış lekeleme sağlar; bunun yerine tedaviye tepki olarak enzimatik aktivitesi azalma gösterir. Bozulmayı teyit etmek için, daha fazla emek-yoğun Western Blot analizi β-galaktosıdaz 13 karşı tamamlandı ve bu sayılan solucanlar küçük popülasyonlarında miktar protein parçalanmasını sağlar edilmelidir. Western Blot bant yoğunlukları ImageJ 46 kullanılarak belirlenebilir. Bu yöntemin diğer bir sınırlama transjenik proteinlerin kullanımı bozulmasının fizyolojik hedefleri olarak ve proteomik ve / veya hedeflenen hipotez tahrik western blotları 13 kullanılması gerekmektedir Bu tür yanıtlar için bilgi olmamasıdır. Son olarak, bu çalışmalarda transgenik protein sentezi gibi erken yetişkinlik 19 kapanıyor C kas protein sentezinde değişiklikler incelemek isteyen zaman, diğer yöntemler kullanılması gerektiği kas elegans; Örneğin, buradaki dengeli veya radyoaktif izotop yöntemleri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O) Invitrogen M-7512 Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential
DMSO Thermo Scientific 67-63-5
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Na2HPO4 BDH 301584L
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
MgSO4 Sigma M-7506
Microscopy Slides Starfrost K220
Microscopy Cover Slips VW2 International 631-0124
1.5 ml Eppendorph Tubes Fisher Scientific FB74031
Dessicator Nalgene D2672
Nikon Microscope Nikon H600L Nikon H600L microscope with proprietary software
Nikon Camera Nikon DS-Fi1 Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera 
Zeiss Microscope Zeiss Ax10 Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter
Plates 9 cm Starstedt 82-1473
Plates 6 cm Gosselin BP53-01
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich 14459-95-1 
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Na3PO4 Sigma-Aldrich 7601-54-9
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside Sigma-Aldrich 7240-90-6 
N,N-dimethylformamide Sigma-Aldrich 68-12-2 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wannamethee, S. G., Shaper, A. G., Lennon, L., Whincup, P. H. Decreased muscle mass and increased central adiposity are independently related to mortality in older men. The American Journal of Clinical Nutrition. 86, 1339-1346 (2007).
  2. Marquis, K., et al. Midthigh Muscle Cross-Sectional Area Is a Better Predictor of Mortality than Body Mass Index in Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166, 809-813 (2002).
  3. Metter, E. J., Talbot, L. auraA., Schrager, M., Conwit, R. Skeletal Muscle Strength as a Predictor of All-Cause Mortality in Healthy Men. Journal of Gerontology: Biological Sciences. 57, 359-365 (2002).
  4. Hairi, N. N., et al. Loss of Muscle Strength, Mass (Sarcopenia), and Quality (Specific Force) and Its Relationship with Functional Limitation and Physical Disability: The Concord Health and Ageing in Men Project. JAGS. 58, 2055-2062 (2010).
  5. FitzGerald, S. J., et al. Muscular Fitness and All-Cause Mortality: Prospective Observations. Journal of Physical Activity and Health. 1, 7-18 (2004).
  6. Consortium, C. eS. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  7. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854-854 (1998).
  8. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode. Caenorhabditis elegans Dev Biol. 56, 110-156 (1977).
  9. White, J. The Anatomy. In The nematode C. elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1988).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  11. Moerman, D. G., Williams, B. D. Sarcomere assembly in C. elegans muscle. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
  12. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
  13. Etheridge, T., et al. Calpains Mediate Integrin Attachment Complex Maintenance of Adult Muscle in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 8, 1002471 (2012).
  14. Shephard, F., Adenle, A. A., Jacobson, L. A., Szewczyk, N. J. Identification and Functional Clustering of Genes Regulating Muscle Protein Degradation from amongst the Known C. elegans Muscle Mutants. PLoS ONE. 6, e24686 (2011).
  15. Lehmann, S., Bass, J. J., Szewczyk, N. J. Knockdown of the C. elegans Kinome identifies Kinases required for normal protein Homeostasis, Mitochondrial network structure, and Sarcomere structure in muscle. Cell Communication & Signaling. 11, (2013).
  16. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing. C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  17. Munoz-Lobato, F., et al. Protective role of DNJ-27/ERdj5 in Caenorhabditis elegans models of human neurodegenerative diseases. Antioxid Redox Signal. 5, 5 (2013).
  18. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  19. Zdinak, L. A., et al. Transgene-coded chimeric proteins as reporters of intracellular proteolysis: starvation-induced catabolism of a lacZ fusion protein in muscle cells of Caenorhabditis elegans. J Cell Biochem. 67, 143-153 (1997).
  20. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J Vis Exp. 18, e833 (2008).
  21. Szewczyk, N. J., Peterson, B. K., Barmada, S. J., Parkinson, L. P., Jacobson, L. A. Opposed growth factor signals control protein degradation in muscles of Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 26, 935-943 (2007).
  22. Stiernagle, T. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2006).
  23. Gaud, A., et al. Prednisone reduces muscle degeneration in dystrophin-deficient Caenorhabditis elegans. Neuromuscular Disorders. 14, 365-370 (2004).
  24. Dillin, A., et al. Rates of Behavior and Aging Specified by Mitochondrial Function During Development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
  25. Bakeeva, L., Chentsov, Y., Skulachev, V. Mitochondrial framework (reticulum mitochondriale) in rat diaphragm muscle. Biochimica et Biophysica Acta. 501, 349-369 (1978).
  26. Ichishita, R., et al. An RNAi screen for mitochondrial proteins required to maintain the morphology of the organelle in Caenorhabditis elegans. J Biochem. 143, 449-454 (2008).
  27. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  28. Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harb Protoc. 1, 990-992 (2011).
  29. Seo, A. Y., et al. New insights into the role of mitochondria in aging: mitochondrial dynamics and more. J Cell Sci. 123, 2533-2542 (2010).
  30. Brys, K., Castelein, N., Matthijssens, F., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Disruption of insulin signalling preserves bioenergetic competence of mitochondria in ageing Caenorhabditis elegans. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
  31. Dorrens, J., Rennie, M. J. Effects of ageing and human whole body and muscle protein turnover. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 13, 26-33 (2003).
  32. Rennie, M. J., et al. Depressed protein synthesis is the dominant characteristic of muscle wasting and cachexia. Clinical Physiology. 3, 387-398 (1983).
  33. Mitch, W. E., Goldberg, A. L. Mechanisms of muscle wasting. The role of the ubiquitin-proteasome pathway. N Engl J Med. 335, 1897-1905 (1996).
  34. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2012).
  35. Kawano, T., et al. An imbalancing act: gap junctions reduce the backward motor circuit activity to bias C. elegans for forward locomotion. Neuron. 72, 572-586 (2011).
  36. Fostel, J. L., Benner Coste, L., Jacobson, L. A. Degradation of transgene-coded and endogenous proteins in the muscles of Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312, 173-177 (2003).
  37. Meissner, B., et al. An integrated strategy to study muscle development and myofilament structure in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5, (2009).
  38. Rogalski, T. M., Gilbert, M. M., Devenport, D., Norman, K. R., Moerman, D. G. DIM-1, a novel immunoglobulin superfamily protein in Caenorhabditis elegans, is necessary for maintaining bodywall muscle integrity. Genetics. 163, 905-915 (2003).
  39. Gieseler, K., Grisoni, K., Segalat, L. Genetic suppression of phenotypes arising from mutations in dystrophin-related genes in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1092-1097 (2000).
  40. Wilson, K. J., Qadota, H., Benian, G. M. Immunofluorescent localization of proteins in Caenorhabditis elegans muscle. Methods Mol Biol. 798, 171-181 (2012).
  41. Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 79-99 (2006).
  42. Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death Dis. 9, 513 (2014).
  43. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
  44. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
  45. Wibom, R., Hagenfeldt, L., von Döbeln, U. Measurement of ATP production and respiratory chain enzyme activities in mitochondria isolated from small muscle biopsy samples. Analytical Biochemistry. 311, 139-151 (2002).
  46. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30, 1845-1855 (2009).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 93 Fizyoloji, Kas mitokondri sarkomer yaşlanma
Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP<em&gt; ° C. elegans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaffney, C. J., Bass, J. J.,… More

Gaffney, C. J., Bass, J. J., Barratt, T. F., Szewczyk, N. J. Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans. J. Vis. Exp. (93), e52043, doi:10.3791/52043 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter