Abstract
For at studere human akut lungeskade og pneumoni, er det vigtigt at udvikle dyremodeller for at efterligne forskellige patologiske træk ved denne sygdom. Her har vi udviklet en mus lungeskade model ved intratracheal injektion af bakterier Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa eller PA). Ved hjælp af denne model, var vi i stand til at vise lunge betændelse i den tidlige fase af skade. Desuden blev alveolær epitelbarriere utæthed observeret ved analyse af bronkoalveolær lavage (BAL); og alveolær celledød blev observeret ved Tunel assay under anvendelse af væv fremstillet fra beskadigede lunger. Ved en senere fase efter skade, observerede vi celleproliferation kræves til reparation proces. Skaden blev løst for 7 dage fra indledningen af P. aeruginosa injektion. Denne model efterligner den sekventielle løbet af lungeinflammation, skade og reparation under lungebetændelse. Dette er klinisk relevant dyremodel er velegnet til at studere patologi, mekanisme reparation, following akut lungeskade, og kan også anvendes til at teste potentielle terapeutiske midler for denne sygdom.
Introduction
Lungerne udsættes for miljømæssige patogener og er modtagelige for betændelse og skade 1-3. Under patologiske tilstande, såsom lungebetændelse eller Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS), patogener samt inflammatoriske faktorer frigivet af leukocytter fremkalde skade og død alveolarceller 1-3. Det er vigtigt at udvikle dyremodeller af akut lungeskade at lette undersøgelsen af patologien af skade samt mekanisme for reparation.
I øjeblikket bruger de fleste hyperoxi og bleomycin induceret mus lungeskader modeller 4. Men mekanismerne i hyperoxi forvoldt skade er ikke det samme som de fleste almindelige lungeskader, der opstår under lungebetændelse eller ARDS 5. Bleomycin induceret akut skade er sjælden i en klinisk sammenhæng 4. Her rapporterer vi en mus lungeskade model ved hjælp af intratrakeal injektion af P. aeruginosa 6,7. Denne model er klinisk relevant, og efterligner processes der sker efter lungebetændelse 8.
Som et opportunistisk, nosokomiel patogen af immunsvækkede personer, P. aeruginosa inficerer typisk pulmonal tarmkanalen, urinvejene, forbrændinger, sår og forårsager også andre blodprodukter infektioner 6. Bakterierne frigiver virulensfaktor exotoxin A, formere sig og udløse immune 6 svar. Intra-trachael administration af P. aeruginosa afspejler situationen i menneskers udsættelse for de bakterier, der forårsager lungebetændelse og patologien vil sandsynligvis være forskellig fra den for nylig rapporteret influenzavirus H1N1-induceret lungeskade model 9. Da P. aeruginosa er et opportunistisk patogen, er det relativt sikre at håndtere i forhold til nogle af de mere virulente patogener. Her anvendte vi intratracheal injektion at administrere bakterierne, fordi vi observeret, at denne metode indføres flere bakterier i den distale region alveolerne i lungerne i sammenligning mednogle andre procedurer, såsom anvendelse af et kateter via munden.
Sammenlignet med andre akutte modeller lungeskader, P. aeruginosa model beskrevet her er egnet til at studere lungebeskadigelse fremkaldt af bakterier og af overdreven inflammation. I modsætning til andre dyremodeller, der bruger P. aeruginosa at inducere sepsis 10,11, her bruger vi intratracheal injektion af disse bakterier til at inducere lokaliseret akut lungeskade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dyreforsøg blev godkendt af Animal Care udvalget og institutionelle biosikkerhed udvalg fra University of Illinois i Chicago.
BEMÆRK: Alle procedurer, der involverer pseudomonas bør udføres med biosikkerhed niveau 2 (BSL2) praksis, som omfatter, men er ikke begrænset til: maske, øjenbeskyttelse, kjole eller buksedragt, og dobbelt handsker. Arbejde i certificeret biosikkerhed kabinet. Forkæl instrumenter i kontakt med bakterier med blegemiddel eller chlordioxid desinfektionsmiddel. Brug en forseglet kasse til transport prøver.
1. P. aeruginosa Kultur og vækst
- Store P. aeruginosa PA103 som en bakteriel lager i et skruelåg kryoglas ved -80 ° C.
- Placer hætteglasset på en rist i en kasse med 70% ethanol fugtet papirhåndklæder og tage til biosikkerhed niveau 2 (BSL2) laboratorium.
- Streak bakterierne onto fåreblodagarplader og vokse ved 37 ° C i ~ 15 timer i en inkubator. I en BSL2 hætte, skrabe bakterier fra plade med bakterier loop og resuspender i 5 ml PBS.
- Opbevar lager ved 4 ° C i op til 3 måneder. Imidlertid bestemme titeren hver 2 uger.
- Serielt fortynde bakterier i PBS (sædvanligvis fra 1:10 4 til 1:10 7) og pladen ud kendt fortynding på fåreblodagarplader.
- Pladerne inkuberes i ~ 15 timer. Tæl kolonier og beregne Colony Forming Unit (CFU) til at bestemme bakterier koncentration.
- Resuspender passende koncentrationer (~ 5 x 10 3 CFU / pl) i 0,5 ml PBS i 1,5 ml sterile med skruelåg kryoglas. Forsegl kryohætteglas og placere dem i en cryovial rack på desinficerende lastet papirhåndklæder i en snap låg kasse.
- Transport boksen til BSL2 dyr facilitet. Når der, åbne boksen i BSL2 kabinet.
2. P. aeruginosa Instillation
- Udfør overlevelse kirurgi aseptisk (sterile handsker, sterile instrumenterog aseptisk teknik). Brug en steril afdækningsstykke til at give en arbejdsgruppe overflade for sterile (autoklaveret) kirurgiske instrumenter. Sterilisere instrumenter ved at bruge en varm perle sterilisator mellem hver luftrør instillation procedure.
- Mus vejes før bedøvelse. Bedøver mus med ketamin (100 mg / kg), xylazin (5 mg / kg), i 0,1-0,2 ml PBS intraperitonealt (ip). Bestemme effektiviteten af bedøvelsesmidlet af ikke-lydhørhed over tå knivspids. Brug en dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
- Begrænse mus på en kirurgisk bord i BSL2 kabinet.
- Identificer området til fældet. Barbere dette område og forberede huden ved hjælp af skiftevis alkohol og povidoniod svaberprøver 3 gange.
- Behandle snitområdet med lokalbedøvelse (lidokain), da dette anæstesi er tilstrækkelig for en mindre kirurgi, såsom en hudindskæring at få adgang til trachea.
- Lave et lille snit (ca. 5 mm) ved midterlinjen af halsen, og bruge stump forceps til forsigtigt at bevæge musklen for adgang til trachea. Blotlægge trachea ved kirurgisk dissektion.
- Tegn bakterier opløsning i en 1 ml engangssprøjte med 27 G kanyle. For hver mus, administrere 20-30 pi af bakterier på passende koncentration (op til 10 5 CFU hver mus).
- Stik nålen ind i luftrøret. Injicere opløsningen langsomt ind i luftrør.
- Sikre, at dyret gisper, hvilket indikerer normalt, at løsningen er nået ind i lungen.
- Lukke såret med sterile suturer (6-0 monofilament) under aseptiske forhold.
- Anvende 0,1 mg / kg buprenorphin ved subkutan injektion som post-op analgesi til at styre post-operative smerter.
- Sørg for, at den tid, der kræves fra den første bedøvelsesmiddel induktion incision lukning er mindre end 15 min.
- Efter injektion, aflever sprøjter og kanyler i en egnet til smittefarlige skarpe genstande container.
- Behandl de kirurgiske instrumenter med chlordioxid baserede Disinfectant i 15 minutter, skylles og vende tilbage til laboratoriet til sterilisering og genbrug efter behov.
- Hus musene enkeltvis i rene bure på varmt miljø.
- Kontroller på dyr hvert 30. minut, indtil det genvinder bevidsthed og begynder at bevæge sig; og senere ved 12 timers intervaller i de første 3 dage efter kirurgi.
- Holde musene i dyrets BSL2 anlægget hele forsøget. Sikre, at kun væv i forseglet kasse forlader dyret BSL2 facilitet. Hvis mus udtrykker nogen af de døende adfærd (defineret som åndedrætsbesvær, sløvhed, manglende ambulate reaktion på blid stimulation) på ethvert tidspunkt i undersøgelsen aflive musene ved CO 2 inhalation fra en flaske kilde efterfulgt af cervikal dislokation.
- Aflive den eksperimentelle emne ved afblødning under bedøvelse.
- Saml lungevæv fra aflivede mus. Udføre disse procedurer i en BSL2 hætte. Hvis det er nødvendigt, overfører prøven ved hjælp af forseglede rør placeret i et racK på desinficerende lastet papirhåndklæder i en snap låg boks til videre proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Startende 24-72 timer efter P. aeruginosa injektion blev forøget cellularitet observeret i lunge- sektioner (Figur 1A-D). Lungen begyndte at stige fra 96 timer efter skaden (figur 1E). 7 dage efter P. aeruginosa, blev den normale alveoler morfologi stort set genoprettet (figur 1F). Tunnel farvning ved hjælp af lunge sektioner fremstilles ved 24 timer efter P. aeruginosa viste celledød i alveoli celler (Figur 1G-I). For at undersøge reparationsprocessen i denne skade model, blev BrdU injiceret i mus ved 3 dage efter P. aeruginosa. Lunger blev isoleret ved 5 timer efter BrdU injektion og forarbejdet til BrdU-antistof-farvning. Som vist i figur 1J og K, signifikant øget antal celler indarbejdet BrdU i 72 timer efter P. aeruginosa administration indikerer hyperproliferation.
At studere ændringen i barrieren prmeability og inflammation efter skade, bronchoalveolær lavage (BAL) væske blev opsamlet på forskellige tidspunkter efter P. aeruginosa injektion. Proteinkoncentrationen i BAL blev signifikant forøget ved 48 timer efter P. aeruginosa injektion (figur 2A), hvilket indikerer epitelbarriere utæthed. Celletallene i BAL steg også markant i 48 timer efter P. aeruginosa injektion (figur 2B), hvilket antyder en inflammatorisk reaktion. 4 - 5 dage efter P. aeruginosa injektion, både BAL proteinniveauet og celleantal begyndte at falde tyder gendannelse (figur 2A, B). Endvidere blev lunge lysat opsamlet på forskellige punkter poste P. aeruginosa administration og niveauet af makrofag-inflammatorisk protein 2 (MIP2), et cytokin, der er involveret i neutrofil tiltrækning 12 blev målt ved ELISA. I overensstemmelse med resultaterne af de BAL analyse, MIP2 niveau væsentligt increa sed 48 timer efter P. aeruginosa injektion og vendte tilbage til basisniveau på 96 timer efter P. aeruginosa injektion (figur 2C). Desuden blev celler fra BAL fast på objektglas og udsat for hæmatologi-farvning. Uden P. aeruginosa, var der kun et lille antal af monocytter i BAL væske (figur 2D). Derimod stor mængde af neutrofiler var til stede i BAL isoleret 48 timer efter P. aeruginosa injektion (figur 2E). Ved 96 timer efter P. aeruginosa injektion cellesammensætningen af BAL tilbage til kontrolniveau (figur 2F). For at opsummere, resulterer i figur 2 viste en akut neutrofil inflammatorisk respons sammen med øget alveolerne barriere permeabilitet og stigning i cytokinkoncentrationer, som alle er kendetegnende for akut lungeskade 13. I alle eksperimenter blev det injektion af anvendt saltvand som kontrol.
ve_content "> En del af de data, herunder H og E farvning BrdU mærkning TUNEL assay, BAL analyse og MIP2 niveau måling, der tidligere blev udgivet 7. I denne artikel, vi studerede rolle FoxM1, en transskription faktor, i reparation af alveolær skade under anvendelse af P. aeruginosa lungeskade model her 7 beskrevet.
Figur 1. Histologi, celledød og proliferation i P. aeruginosa medieret mus lungeskade model. (AF) Lung isolation, sektionering og H / E-farvning blev udført ved hjælp af ikke-P. aeruginosa-injiceret (non-PA) kontrol lungerne (A) samt lungerne ved 24 timer (B), 48 timer (C), 72 timer (D), 96 timer (E), 7 dage (F) stilling P. aeruginosa iFremragning (post-PA). (GI) Lung sektioner blev fremstillet ud fra kontrol lungerne (G) og 24 timer post-P. aeruginosa injicerede lungerne (H, I) og fortsæt TUNEL assay til påvisning af celledød. Lung sektioner blev farvet for lunge epitelcelle markør Sp-C (blå), T1α (rød) til at vise morfologi og også farvet for TUNEL (grøn). Pile i (H) indikerer TUNEL-positive celler. (J, K) BrdU blev injiceret i ikke P. aeruginosa injicerede mus (J), og 72 timer efter P. aeruginosa injicerede mus (K) ved IP blev lunger forberedt på 5 timer efter BrdU injektion og forarbejdet til antistoffarvning mod BrdU (grøn farvning). Scale bar = 60 pm for AF, 50 um for G og H, 20 um for mig, og 100 um for J og K. Dette tal er blevet ændret fra Liu
Figur 2. Alveolær barriere permeabilitet og inflammation efter i P. aeruginosa induceret lungeskade. (A, B) BAL blev opsamlet fra kontrol- og P. aeruginosa behandlede lunger. (A) Protein koncentration i BAL steg i 48 timer efter P. aeruginosa injektion og faldt på 96 timer, 5 dage efter P. aeruginosa injektion. (B) Totalt celleantal i BAL steget med 48 timer efter P. aeruginosa injektion (B) og returneres kontrolniveau på 96 timer efter P. aeruginosa injektion. (C) MIP-2-niveauer blev målt osING lunge lysater isoleret fra kontrol mus samt mus på 48 timer og 96 timer efter P. aeruginosa injektion. Data blev præsenteret på middelværdi ± SE, n ≥ 3. (DF) Celler fra BAL blev centrifugeret og fikseret på objektglas og underkastet HEMA3 farvning. Et lille antal monocytter var til stede i BAL af kontrolmus (D). Store mængder af neutrofiler var til stede i BAL isoleret 48 timer efter P. aeruginosa injektion (E). Ved 96 timer efter P. aeruginosa injektion, der var et lille antal monocytter i BAL (F). Scale bar = 10 um, disse resultater er repræsentative for mindst 5 uafhængige forsøg. Dette tal er blevet ændret fra Liu et al. 7. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pseudomonas mus lungeskade model, som vi beskriver her efterligner hele processen med inflammation, lungeskader, reparation og opløsning, der forekomme efter akut lungeskade eller lungebetændelse. Det har unikke fordele sammenligning med flere andre beskadigelsesmodeller i, at det er klinisk relevant og relativt sikker og nem at håndtere.
Den kritiske trin i proceduren er, at injektion af bakterier løsning skal være meget langsom. Hvis injektion er for hurtig, vil sandsynligvis dø ved choker musene. Efter en vellykket injektion, musene viser som regel flere dybe ånder og gisp, som vil hjælpe bakterierne kommer partikler i lungen.
Stammen brugte vi var PA103 6. En af de kritiske punkter i denne model er, at titeren af P. aeruginosa skal tæt kontrolleret. Parti P. aeruginosa fra anden kilde kunne vise forskellige grader af betændelse og skader, selv nåranvendes på samme CFU. Det anbefales derfor, at hver ny batch af bakterier skal testes for deres sygdomsfremkaldende virkninger (såsom inflammation, cell proliferation, etc.), og dermed justere antallet af CFU skal anvendes. Hvis uoverensstemmelse af resultaterne sker ved hjælp af kølede bakterier lager, kan man anvende frisk lager opnået ved dyrkning af bakterier fra en frisk plade for hvert forsøg. Derudover kan vækstfase bakterier og valg af medier også have en indflydelse på effekten på værtens respons. Derfor bør der udvises forsigtighed for at sikre, at bakterielle vaccinationer forekommer under den samme fase af den bakterielle vækst cyklus.
Der kan være en forskel i reaktionen på P. aeruginosa ved forskellige stammer af mus. Stammen brugte vi var en blanding af C57BL / 6 og FVB / N. Den passende P. aeruginosa titer bør bestemmes for forskellige mus stammer.
En faktor til at overveje for denne model erat beskadigelse af bakterier ikke er begrænset til én celletype. For eksempel, epithelial, endothelial, fibroblaster kunne alle er blevet beskadiget. Derfor er denne model ikke velegnet til at undersøge virkningerne af celletype-specifik lungeskader. Bakterierne forårsage lunge celledød ved at stimulere inflammatoriske reaktioner samt ved at udskille toksiner i væv 6. Levende bakterier er normalt fjernet fra lungen inden 48 timer efter skaden 7,14. En høj koncentration af døde bakterier kan også forårsage skader ved at inducere inflammatoriske reaktioner 15.
Mekanismerne i lungeskader og reparation vil sandsynligvis være forskellig respons på forskellige typer af lungeskade. Derfor er det vigtigt at sammenligne flere beskadigelsesmodeller. P. aeruginosa model beskrevet her er en god tilføjelse til de andre modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine | pharmaceutical grade | ||
| 27 G needle | Fisher | 1482648 | |
| syringe | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| scissors | Fine Science tools | ||
| forceps | Fine Science tools | ||
| suture | Fisher | 19-037-526 | |
| Eye gauge, glove, gown | |||
| Biosafety Cabinet | |||
| chlorine dioxide based disinfectant | Clidox | ||
| sheep blood agar plates | Medex supply | HL-1160 |
References
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Shimabukuro, D. W., Sawa, T., Gropper, M. A. Injury and repair in lung and airways. Crit Care Med. 31 (8), 524-531 (2003).
- Wansleeben, C., Barkauskas, C. E., Rock, J. R., Hogan, B. L. Stem cells of the adult lung: Their development and role in homeostasis, regeneration, and disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 131-148 (2013).
- Singleton, P. A., et al. Dynamin 2 and c-abl are novel regulators of hyperoxia-mediated nadph oxidase activation and reactive oxygen species production in caveolin-enriched microdomains of the endothelium. J Biol Chem. 284, 34964-34975 (2009).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J. W., Prince, A. S. Pathogen-host interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1209-1223 (2005).
- Liu, Y., et al. Foxm1 mediates the progenitor function of type ii epithelial cells in repairing alveolar injury induced by pseudomonas aeruginosa. J Exp Med. 208, 1473-1484 (2011).
- Kurahashi, K., et al. Pathogenesis of septic shock in pseudomonas aeruginosa pneumonia. J Clin Invest. 104, 743-750 (1999).
- Kumar, P. A., et al. Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following h1n1 influenza infection. Cell. 147, 525-538 (2011).
- Delano, M. J., et al. Sepsis induces early alterations in innate immunity that impact mortality to secondary infection. J Immunology. 186, 195-202 (2011).
- Lange, M., et al. A murine model of sepsis following smoke inhalation injury. Biochem Biophys Res Commun. 391 (3), 1555-1560 (2010).
- Kobayashi, Y. The role of chemokines in neutrophil biology. Front Biosci. 13, 2400-2407 (2008).
- Matute-Bello, G., et al. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L379-L399 (2008).
- Sadikot, R. T., et al. Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa. J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).
- Pinto, I. L., et al. Development of an experimental model of neutrophilic pulmonary response induction in mice. J Pneumologia. 29, 213-214 (2003).
