Abstract
על מנת ללמוד פציעת אדם חריפה ריאות ודלקת ריאות, זה חשוב לפתח מודלים של בעלי חיים כדי לחקות את התכונות פתולוגיים שונות של מחלה זו. כאן יש לנו פיתחנו מודל פציעת ריאות עכבר על ידי הזרקה תוך קנה הנשימה של חיידקי Pseudomonas aeruginosa (פ aeruginosa או הרשות הפלסטינית). שימוש במודל זה, שהיינו מסוגל להראות דלקת ריאות בשלב המוקדם של פציעה. בנוסף, דליפות מחסום האפיתל נֹאדִי נצפו על ידי ניתוח שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL); והמוות של תאי נֹאדִי נצפה על ידי assay Tunel באמצעות רקמה הוכנה מריאות נפגעו. בשלב מאוחר בעקבות פציעה, שצפינו התפשטות תאים הנדרשת לתהליך התיקון. הפציעה הוחלט 7 ימים מהייזום של פ הזרקת aeruginosa. מודל זה מחקה כמובן רציף של דלקת ריאות, פגיעה ותיקון בדלקת ריאות. מודל חיה רלוונטי מבחינה קלינית זה מתאים ללימוד פתולוגיה, מנגנון של תיקון, וollowing פציעת ריאות חריפה, והוא יכול גם לשמש לבדיקת סוכנים טיפוליים פוטנציאליים למחלה זו.
Introduction
ריאות נחשפות לפתוגנים סביבתיים ורגישות לדלקת והפגיעה 1-3. במהלך מצבים פתולוגיים כגון דלקת ריאות או מצוקה נשימתית מבוגר תסמונת (ARDS), פתוגנים כמו גם גורמים דלקתיים שפורסמו על ידי כדוריות דם לבנות לגרום לפציעה ולמוות של תאי שומן 1-3. חשוב לפתח מודלים של בעלי חיים לפגיעה ריאות חריפות כדי להקל על המחקר של הפתולוגיה של פגיעה, כמו גם מנגנון של תיקון.
נכון לעכשיו, רוב האנשים משתמשים במודלי פציעת ריאות hyperoxia ועכבר מושרה בליאומיצין 4. עם זאת, המנגנונים של hyperoxia גרמו לפציעה היא לא אותו הדבר כמו רוב פציעות ריאות שכיחות המתרחשות במהלך דלקת ריאות או ARDS 5. פציעה אקוטית נגרמת בליאומיצין היא נדירה בהקשר קליני 4. כאן אנו מדווחים מודל פציעת ריאות עכבר באמצעות זריקה תוך קנה הנשימה של פ aeruginosa 6,7. מודל זה הוא רלוונטי מבחינה קלינית, ומחקה את processes שיקרה בעקבות דלקת ריאות 8.
כפתוגן אופורטוניסטי, nosocomial של אנשים מדוכאי חיסון, פ aeruginosa בדרך כלל מדביק את מערכת הריאות, בדרכי שתן, כוויות, פצעים, וגם גורם לזיהומים בדם אחרים 6. החיידקים לשחרר exotoxin גורם ארסיות, להתרבות ולגרום לתגובה חיסונית 6. ממשל Intra-trachael של פ aeruginosa משקף את המצב בחשיפה של בני אדם לחיידק שגורם לדלקת ריאות ופתולוגיה עשויה להיות שונה מהמודל שדיווח לאחרונה H1N1 וירוס שפעת הריאות הנגרמות פציעת 9. מאז פ aeruginosa הוא פתוגן אופורטוניסטי, זה בטוח יחסית לטיפול, בהשוואה לחלק מגורמי המחלה האלימה יותר. כאן השתמשנו בהזרקה תוך קנה הנשימה לנהל את החיידקים כי אנחנו ציינו כי שיטה זו הציגה יותר חיידקים לאזור alveoli הדיסטלי של הריאה בהשוואה לכמה נהלים אחרים כגון שימוש בצנתר דרך פה.
בהשוואה לדגמי פציעת ריאות חריפות אחרים, פ מודל aeruginosa שתואר כאן הוא מתאים ללימוד פציעת ריאות הנגרמת על ידי חיידקים ועל ידי דלקת מופרזת. בניגוד למודלים של בעלי חיים אחרים המשתמשים בפ aeruginosa לגרום אלח דם 10,11, כאן אנו משתמשים בהזרקה תוך-קנה הנשימה של חיידקים אלה לגרום לפגיעת ריאות חריפה מקומית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים בבעלי החיים אושרו בועדת הטיפול בבעלי חיים וועדות בטיחות הביולוגית המוסדית של אוניברסיטת אילינוי בשיקגו.
הערה: כל הנהלים הקשורים Pseudomonas יש לבצע עם רמת הבטיחות הביולוגית 2 שיטות (BSL2), אשר כוללות, אך לא מוגבלות ל: מסכה, משקפי מגן, שמלה או חליפת הגוף, וכפפות כפולות. לעבוד בקבינט בטיחות ביולוגי מוסמך. פנק את המכשירים במגע עם חיידקים עם חומר חיטוי מבוסס אקונומיקה או כלור דו-חמצני. השתמש בקופסה אטומה עבור דגימות תחבורה.
1. פ aeruginosa תרבות וצמיחה
- החנות פ aeruginosa PA103 כמו מנית חיידקים בכובע בורג cryovial ב -80 מעלות צלזיוס.
- מניחים את הצנצנת במעמד בקופסא עם מגבות נייר רטוב אתנול 70% ולקחת למעבדה רמת בטיחות הביולוגית 2 (BSL2).
- פס החיידקים על גבי צלחות אגר דם כבשים ולגדול ב 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 15 שעות באינקובטור. בברדס BSL2, לשרוט את החיידקים מצלחת עם לולאת חיידקים וגלול ב 5 מיליליטר PBS.
- אחסן את המניה ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. עם זאת, לקבוע את כייל כל 2 שבועות.
- סדרתי לדלל את החיידקים בPBS (בדרך כלל מ1:10 4 ל1:10 7) וצלחת את הדילול הידוע על צלחות אגר דם כבשים.
- דגירה הצלחות במשך ~ 15 שעות. רוזן מושבות ולחשב מושבה יחידה להרכיב (CFU) כדי לקבוע את ריכוז חיידקים.
- Resuspend הריכוזים המתאימים (~ 5 x 10 3 CFU / μl) ב0.5 מיליליטר PBS ב 1.5 מיליליטר cryovials כובע בורג סטרילי. חותם את cryovials ולמקם אותם במעמד cryovial על מגבות נייר עמוסות חומר חיטוי בקופסא מכסה הצמד.
- להעביר את התיבה למתקן בעלי החיים BSL2. ברגע שיש, לפתוח את התיבה בממשלת BSL2.
2. פ aeruginosa החדרה
- בצע סביבה נקיה מחיידקי ניתוח הישרדות (כפפות סטריליות, כלים סטריליים, וטכניקות ספטית). השתמש בוילון סטרילי כדי לספק משטח עבודה עבור מכשירי ניתוח סטרילי (autoclaved). לעקר מכשירים באמצעות מעקר חרוז חם בין כל הליך החדרה לקנה הנשימה.
- לשקול עכברים לפני הרדמה. הרדימי עכברים עם קטמין (100 מ"ג / קילוגרם), xylazine (5 מ"ג / קילוגרם), ב0.1-0.2 מיליליטר PBS intraperitoneally (IP). לקביעת היעילות של ההרדמה על ידי אי-היענות לקמצוץ הבוהן. השתמש במשחת וטרינר על עיניים למניעת יובש בהרדמה.
- לרסן את העכברים על לוח כירורגית בקבינט BSL2.
- זהה את האזור לחתוך כלפי מטה. לגלח אזור זה ולהכין את העור באמצעות לסירוגין מטליות יוד אלכוהול וpovidone 3 פעמים.
- פנק את אזור החתך עם הרדמה מקומית (לידוקאין) והרדמה זו, די בניתוח קטן כמו חתך בעור כדי לגשת לקנה הנשימה.
- לעשות חתך קטן (5 מ"מ בערך) על קו האמצע של הצוואר, ולהשתמש F הבוטהorceps להזיז בעדינות את השרירים לגישה לקנה הנשימה. לחשוף את קנה הנשימה על ידי נתיחה כירורגית.
- לצייר פתרון חיידקים לתוך מזרק חד פעמי 1 מיליליטר עם 27 מחט G. עבור כל עכבר, לנהל 20-30 μl של חיידקים בריכוז המתאים (עד 10 5 CFU כל עכבר).
- הכנס מחט לתוך קנה הנשימה. הזרק פתרון לאט לתוך קנה הנשימה.
- ודא שההתנשפויות של בעלי החיים, אשר בדרך כלל מצביעה על הפתרון שהגיעו לריאות.
- סגור את הפצע עם תפרים סטריליים (6-0 monofilament) בתנאי ספטית.
- השתמש 0.1 מ"ג / קילוגרם עצירות על ידי הזרקה תת עורית כשיכוך כאבים לאחר הניתוח לטיפול בכאב לאחר ניתוח.
- ודא שהזמן הנדרש מאינדוקצית הרדמה ראשונית לחתך סגר הוא פחות מ -15 דקות.
- לאחר הזרקה, להיפטר ממזרקים ומחטים במכל חד Biohazard מתאים.
- פנק את מכשירי ניתוח עם דסק"ש מבוסס כלור דו-חמצניnfectant במשך 15 דקות, לשטוף ולחזור למעבדה לעיקור ולעשות שימוש חוזר במידת צורך.
- בית העכברים ביחידים בכלובים נקיים בסביבה חמה.
- בדקו על בעלי החיים בכל 30 דקות עד שהוא חוזר להכרה ומתחיל לנוע; ולאחר מכן במרווחים של 12 שעות לניתוח שלאחר 3 ימים הראשון.
- שמור על העכברים במתקן BSL2 בעלי החיים לאורך כל הניסוי. ודא שהרקמה היחידה הכלולה בקופסא אטומה עוזבת את מתקן BSL2 בעלי החיים. אם העכברים לבטא כל אחת מההתנהגויות גוססות (שהוגדר כמצוקה נשימתית, עייפות, אי ambulate בתגובה לגירוי עדין) בכל נקודה במחקר, להרדים את העכברים על ידי ה- CO 2 שאיפה ממקור בבקבוקים ואחריו נקע בצוואר הרחם.
- להרדים את נושא הניסיון על ידי exsanguination תחת הרדמה.
- לאסוף רקמת ריאה מעכברים מורדמים. לבצע הליכים אלה בברדס BSL2. במידת הצורך, להעביר את המדגם באמצעות צינורות אטומים ממוקמים בRACk על מגבות נייר עמוסות חומר חיטוי בקופסא מכסה הצמד לתהליך נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
החל מ 24 - לאחר שעות 72 P. הזרקת aeruginosa, תאי מוגבר נצפה בחלקי ריאה (איור 1 א-ד). הריאות החלו להתאושש מהודעת 96 שעות פציעה (איור 1E). בשעת 7 ימים הודעה P. aeruginosa, מורפולוגיה alveoli נורמלית שוחזרה במידה רבה (איור 1F). חלקי ריאה באמצעות מכתים מנהרה שהוכנו בהודעת שעה 24 P. aeruginosa הראה מוות של תאים בתאי alveoli (איור 1G-I). על מנת ללמוד את תהליך התיקון במודל פגיעה זו, BrdU הוזרק לעכברים בגיל 3 ימים לאחר פ aeruginosa. ריאות היו מבודדות בהזרקה שלאחר BrdU 5 שעות ומעובד למכתים נוגדן BrdU. כפי שניתן לראות באיור 1J וK, גדל באופן משמעותי מספרם של התאים המאוגדת BrdU בעמדת שעות 72 P. ממשל aeruginosa מצביע פרוליפרציה מוגברת.
כדי לחקור את השינוי במחסום לפציעת meability ופוסט דלקת, שטיפה ברונכואלוואולרית נוזל (BAL) נאספה בנקודות זמן שונות לפרסם P. הזרקת aeruginosa. ריכוז החלבון בBAL היה גדל באופן משמעותי בעמדת שעות 48 P. הזרקת aeruginosa (איור 2 א), המצביעה על דליפות מחסום האפיתל. המספרים הסלולריים בBAL גם גדלו באופן משמעותי בעמדת שעות 48 P. הזרקת aeruginosa (איור 2), המצביעה על תגובה דלקתית. ב 4 - 5 ימים שלאחר פ הזרקת aeruginosa, הן ברמת חלבון BAL ומספר התא התחילו להקטין התאוששות טוענת (איור 2 א, ב '). יתר על כן, lysate ריאות נאסף בנקודות שונות שלאחר פ ממשל aeruginosa והרמה של מקרופאג החלבון דלקתי 2 (MIP2), ציטוקינים מעורבים במשיכה של נויטרופילים 12, נמדדו על ידי ELISA. עולה בקנה אחד עם תוצאות ניתוח BAL, רמת MIP2 increa באופן משמעותי sed בעמדת שעות 48 P. ההזרקה וaeruginosa חזר לרמה בסיסית בעמדת שעות 96 P. הזרקת aeruginosa (איור 2 ג). יתר על כן, תאים מBAL היו קבועים על שקופיות זכוכית ונתונים לצביעת המטולוגיה. ללא פ aeruginosa, היה רק מספר קטן של מונוציטים בנוזל BAL (איור 2 ד). בניגוד לכך, כמות גדולה של נויטרופילים נכחו בBAL מבודד בעמדת שעות 48 P. הזרקת aeruginosa (2E איור). בדואר שעות 96 P. הזרקת aeruginosa, הרכב התא של BAL חזר לרמת השליטה (איור 2F). לסיכום, תוצאות באיור 2 מצביעות על תגובה דלקתית חריפה neutrophilic יחד עם חדירות מוגברות alveoli מחסום ועלייה בריכוזי ציטוקין, שהם כולם סימני ההיכר של פציעת ריאות חריפה 13. בכל הניסויים, זה הזרקה של תמיסת מלח שימשה כבקרה.
ve_content "> חלק מהנתונים, כולל H וצביעת E, תיוג BrdU, assay TUNEL, ניתוח BAL ומדידת רמת MIP2, פורסם בעבר 7. במאמר זה, שחקרנו את התפקיד של FoxM1, גורם שעתוק, בתיקון פציעה נֹאדִי באמצעות מודל פציעת ריאות פ aeruginosa המתואר כאן 7.
איור 1. היסטולוגיה, מוות של תאים והתרבות בפ מודל פציעת ריאות עכבר תיווך aeruginosa. בידוד (AF) ריאות, חתך וצביעת H / E בוצעה באמצעות פ אינו הזריק-aeruginosa (לא PA) ריאות שליטה (), כמו גם ריאות ב 24 שעות (ב '), 48 שעות, 72 שעות (ד) (ג), 96 שעות (E), 7 ימים (F) פוסט פ aeruginosa בjection (פוסט-PA). (GI) סעיפי ריאות הוכנו מריאות שליטה (G) ו- 24 שעות שלאחר פ aeruginosa הוזרק לריאות (H, I) ולהמשיך לassay TUNEL לזהות מוות של תאים. חלקי ריאות היו מוכתמים עבור סמן תא אפיתל הריאה Sp-C (כחול), T1α (אדום) כדי להראות מורפולוגיה וגם מוכתמים עבור TUNEL (ירוק). חיצים ב( H) מצביעים על תאים חיוביים TUNEL. (J, K) BrdU הוזרק בפ אינו aeruginosa הוזרק עכברים (J) ופוסט שעות 72 P. aeruginosa הוזרק עכברים (K) על ידי ה- IP, ריאות הוכנו בהזרקה שלאחר BrdU 5 שעות ומעובד למכתים נוגדן נגד BrdU (כתמים ירוקים). בר סולם = 60 מיקרומטר לAF, 50 מיקרומטר עבור G ו- H, 20 מיקרומטר לי, ו 100 מיקרומטר לJ ו- K. נתון זה שונה מיו
איור 2. חדירות מחסום נֹאדִי והדלקת הבאות בפ aeruginosa מושרה פציעת ריאות. (A, B) BAL נאסף מהשליטה ופ aeruginosa טופל ריאות. () ריכוז חלבון בBAL עלה בפוסט שעות 48 P. הזרקת aeruginosa וירד ב 96 שעות, 5 ימים הודעה P. מספרים סלולריים סה"כ aeruginosa הזרקה. (ב) בBAL עלו בפוסט שעות 48 P. הזרקת aeruginosa (B) ורמת שליטת retuned בעמדת שעות 96 P. הזרקת aeruginosa. (ג) 2 MIP רמות נמדדוlysates ריאות ing מבודד מעכברי שליטה, כמו גם עכברים ב 48 שעות ו 96 פוסט שעות פ הזרקת aeruginosa. הנתונים הוצגו בממוצע ± SE, n ≥ 3. (DF) תאים מBAL היו centrifuged וקבוע על שקופיות זכוכית ונתונים לצביעת HEMA3. מספר קטן של מונוציטים נכחו בBAL של עכברי שליטה (ד '). כמות גדולה של נויטרופילים נכחו בBAL מבודד בעמדת שעות 48 P. הזרקת aeruginosa (E). בדואר שעות 96 P. הזרקת aeruginosa, היו מספר קטן של מונוציטים בBAL (F). בר סולם = 10 מיקרומטר, תוצאות אלה הן נציג של לפחות 5 ניסויים בלתי תלויים. נתון זה שונה מהאח ליו אל. 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל פציעת ריאות עכבר Pseudomonas שאנחנו מתארים כאן מחקה את כל התהליך של דלקת, פציעת ריאות, תיקון, ורזולוציה המתרחש בעקבות פציעת ריאות חריפה או דלקת ריאות. יש לו יתרונות ייחודיים השוואה עם מספר מודלים פציעה אחרים בכך שהוא קליני רלוונטי ובטוח יחסית וקל לטפל.
השלב הקריטי בהליך הוא שההזרקה של תמיסת חיידקים צריך להיות איטיים מאוד. אם הזריקה היא מהירה מדי, העכברים עלולים למות בחנק. לאחר זריקה מוצלחת, העכברים בדרך כלל להראות כמה נשימות עמוקות ונשימה, אשר תסייע לחיידקי חלקיקים להיכנס לריאות.
המתח השתמשנו היה PA103 6. אחת הנקודות הקריטיות של המודל הזה הוא שכייל של פ aeruginosa צריך להיות מבוקר היטב. אצווה של פ aeruginosa ממקור אחר יכול להראות דרגות שונות של דלקת ונזק גם כאשרשימוש באותו CFU. לכן, מומלץ כי כל קבוצה חדשה של חיידקים שנבדקה השפעות סיבתי (כגון דלקת, שגשוג תאים, וכו '), ובהתאם לכך להתאים את מספר CFU לשימוש. אם חוסר עקביות של תוצאות מתרחשת באמצעות מניות חיידקים בקירור, ניתן להשתמש במלאי טרי מתקבל על ידי חיידקים גדלו מצלחת טרי עבור כל ניסוי. בנוסף, שלב הצמיחה של החיידקים והבחירה של תקשורת יכול גם להיות השפעה על ההשפעה על תגובת המארח. לכן, יש להקפיד על מנת להבטיח כי חיסונים חיידקים להתרחש במהלך אותו השלב של מחזור צמיחת החיידקים.
אולי יש הבדל בתגובה לפ aeruginosa על ידי זנים שונים של עכברים. המתח השתמשנו היה תערובת של C57BL / 6 וFVB / N. פ המתאים כייל aeruginosa יש לקבוע עבור זני עכברים שונים.
גורם אחד לשקול עבור דגם זה הואשפגיעתו של החיידק אינה מוגבלת לסוג תא אחד. לדוגמא, אפיתל, אנדותל, פיברובלסטים יכולים כל נפגעו. לכן, מודל זה אינו מתאים לכדי לחקור את ההשפעות של פציעות ריאות ספציפיות תאים מסוג. החיידקים גורמים למוות של תאי ריאה על ידי גירוי תגובות דלקתיות, כמו גם על ידי הפרשת רעלים לרקמות 6. חיידקים חיים בדרך כלל נעלמים מהריאות בתוך לאחר פציעה 48 שעות 7,14. ריכוז גבוה של חיידקים מתים יכול גם לגרום נזק על ידי גרימת תגובות דלקתיות 15.
המנגנונים של פגיעת ריאות ותיקון צפויים להיות שונה בתגובה לסוגים שונים של פציעת ריאות. לכן, חשוב להשוות את מספר דגמי פציעה. פ מודל aeruginosa שתואר כאן הוא תוספת נחמדה לדגמים האחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine | pharmaceutical grade | ||
| 27 G needle | Fisher | 1482648 | |
| syringe | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| scissors | Fine Science tools | ||
| forceps | Fine Science tools | ||
| suture | Fisher | 19-037-526 | |
| Eye gauge, glove, gown | |||
| Biosafety Cabinet | |||
| chlorine dioxide based disinfectant | Clidox | ||
| sheep blood agar plates | Medex supply | HL-1160 |
References
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Shimabukuro, D. W., Sawa, T., Gropper, M. A. Injury and repair in lung and airways. Crit Care Med. 31 (8), 524-531 (2003).
- Wansleeben, C., Barkauskas, C. E., Rock, J. R., Hogan, B. L. Stem cells of the adult lung: Their development and role in homeostasis, regeneration, and disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 131-148 (2013).
- Singleton, P. A., et al. Dynamin 2 and c-abl are novel regulators of hyperoxia-mediated nadph oxidase activation and reactive oxygen species production in caveolin-enriched microdomains of the endothelium. J Biol Chem. 284, 34964-34975 (2009).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J. W., Prince, A. S. Pathogen-host interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1209-1223 (2005).
- Liu, Y., et al. Foxm1 mediates the progenitor function of type ii epithelial cells in repairing alveolar injury induced by pseudomonas aeruginosa. J Exp Med. 208, 1473-1484 (2011).
- Kurahashi, K., et al. Pathogenesis of septic shock in pseudomonas aeruginosa pneumonia. J Clin Invest. 104, 743-750 (1999).
- Kumar, P. A., et al. Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following h1n1 influenza infection. Cell. 147, 525-538 (2011).
- Delano, M. J., et al. Sepsis induces early alterations in innate immunity that impact mortality to secondary infection. J Immunology. 186, 195-202 (2011).
- Lange, M., et al. A murine model of sepsis following smoke inhalation injury. Biochem Biophys Res Commun. 391 (3), 1555-1560 (2010).
- Kobayashi, Y. The role of chemokines in neutrophil biology. Front Biosci. 13, 2400-2407 (2008).
- Matute-Bello, G., et al. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L379-L399 (2008).
- Sadikot, R. T., et al. Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa. J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).
- Pinto, I. L., et al. Development of an experimental model of neutrophilic pulmonary response induction in mice. J Pneumologia. 29, 213-214 (2003).
