Abstract
ヒト急性肺損傷及び肺炎を研究するためには、この疾患の多様な病理学的特徴を模倣する動物モデルを開発することが重要である。ここでは、細菌、緑膿菌 （ 緑膿菌またはPA）の気管内注射によるマウス肺損傷モデルを開発した。このモデルを用いて、損傷の初期段階での肺の炎症を示すことができた。また、肺胞の上皮バリア漏出が気管支肺胞洗浄（BAL）を分析することによって観察された。肺胞細胞死が負傷肺から調製した組織を用いたTUNELアッセイにより観察した。損傷後の後期では、我々は、修復プロセスに必要な細胞の増殖を観察した。損傷は7日、P開始から解決した緑膿菌注入 。このモデルは、肺炎の間、肺の炎症、損傷および修復の順次コースを模倣。この臨床的に関連する動物モデルは、fは、修復のメカニズムを病理を研究するのに適している急性肺損傷をollowing、また、この疾患の潜在的治療剤を試験するために用いることができる。
Introduction
肺は、環境病原体に暴露し、炎症および損傷1-3の影響を受けやすいされている。そのような肺炎または成人呼吸窮迫症候群（ARDS）のような病理学的状態の間、白血球により放出され、病原体だけでなく、炎症性因子は肺胞細胞1-3の傷害や死を誘導する。これは、傷害の病理の研究、ならびに修復のメカニズムを容易にするために、急性肺損傷の動物モデルを開発することが重要である。
現在、ほとんどの人は高酸素性ブレオマイシン誘発マウス肺損傷モデル4を使用しています。しかし、高酸素のメカニズムは、傷害が肺炎またはARDS 5中に発生する最も一般的な肺損傷と同じではありませんが原因。ブレオマイシン誘発性急性損傷は、臨床コンテキスト4はまれである。ここでは、Pの気管内注射を用いてマウスの肺損傷モデルを報告緑膿菌 6,7。このモデルは、臨床的に関連であり、pを模倣肺炎8下記起こるrocesses。
免疫無防備状態の個体の日和見、院内病原体、Pとして緑膿菌は通常、肺の気道、尿路、火傷、傷に感染し、また他の血液感染症6が発生します 。細菌は病原性因子毒素Aをリリース、6免疫応答を乗算し、トリガします。 P.のイントラtrachael政権緑膿菌、肺炎を引き起こす細菌にヒトへの暴露の状況を反映しており、病理学は、最近報告されたインフルエンザウイルスH1N1誘発性肺傷害モデル9とは異なる可能性が高い。 P.以来緑膿菌は、より病原性の病原体の一部に比べて取り扱いが比較的安全であり、日和見病原体である。私たちはこの方法はと比較して、肺の遠位肺胞領域へより多くの細菌を導入することが観察されるためここでは、細菌を投与するために気管内注入を使用そのような口を介してカテーテルを使用するなど、いくつかの他の手順。
他の急性肺損傷のモデルと比較して、P.ここで説明緑膿菌モデルは、細菌によって、過剰な炎症によって誘発される肺損傷を研究するのに適している。 P.を使用する他の動物モデルとは異なり緑膿菌は、ここでは、ローカライズされた急性肺損傷を誘導するために、これらの細菌の気管内注入を使用して、敗血症10,11を誘導した。
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Protocol
動物実験は、イリノイ大学シカゴ校の動物ケア委員会と制度バイオセーフティ委員会によって承認された。
注：マスク、目の保護、ガウンやジャンプスーツ、ダブル手袋：シュードモナスを含むすべての手順は、バイオセーフティレベル2（BSL2）が含まれるが、これらに限定されない慣行、で行われるべきである。認定された安全キャビネットで働いています。漂白剤や消毒剤をベース二酸化塩素との細菌に接触して楽器を扱う。輸送サンプルに対して密封されたボックスを使用します。
1. P.緑膿菌文化と成長
- ストアP. -80℃で凍結バイアルスクリューキャップの細菌株として緑膿菌 PA103。
- 70％エタノール湿らせたペーパータオルでボックス内のラックにバイアルを置き、バイオセーフティレベル2（BSL2）の研究室に連れて行く。
- ストリークヒツジ血液寒天プレート上に細菌やインキュベーターで15時間〜37℃で生育する。 BSL2フードでは、5ミリリットルPBSに細菌ループおよび再懸濁したプレートからの細菌を傷つける。
- 最大3ヶ月間、4℃での在庫を保管してください。しかし、2週間ごとに力価を決定。
- シリアルに（通常は1：10 4〜1時10分〜7）をPBS中の細菌を希釈し、羊血液寒天プレート上の既知の希釈をプレートアウト。
- 〜15時間プレートをインキュベートします。コロニーをカウントし、細菌濃度を決定するために、コロニー形成単位（CFU）を計算する。
- 適切な濃度を再懸濁（〜5×10 3 CFU /μl）を1.5ミリリットルの滅菌スクリューキャップのクライオバイアル中で0.5mlのPBSで。クリオバイアルを密封し、スナップのふたボックス内の消毒ラディンペーパータオル上クライオバイアルラックに配置します。
- BSL2動物施設にあるボックスを輸送。かつてそこに、BSL2キャビネットにボックスを開きます。
2. P.緑膿菌点眼
- 無菌的に生存手術を行う（滅菌手袋、滅菌楽器、および無菌技術）。滅菌（オートクレーブ処理）手術器具のために働いて表面を提供するために滅菌ドレープを使用してください。各気管点滴注入手順の間にホットビーズ滅菌器を使って楽器を殺菌。
- 麻酔の前にマウスの重量を量る。腹腔内に0.2mlのPBS（腹腔内 ） -ケタミン0.1におけるた（100mg / kg）を、キシラジン（5mg / kg）でマウスを麻酔。つま先のピンチに対する非応答性によって麻酔薬の有効性を判断する。麻酔下での乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
- BSL2キャビネットに外科ボードにマウスを拘束。
- カットダウンのための領域を識別します。この領域を剃ると3回アルコールとポビドンヨード綿棒を交互に使用して皮膚を準備します。
- この麻酔は、そのような気管にアクセスするための皮膚切開などの小手術のために十分であるように局所麻酔薬（リドカイン）で切開領域を扱う。
- 首の正中線で小切開（約5mm）を行い、鈍Fを使用優しく気管へのアクセスのために筋肉を動かすためorceps。外科的切開により気管を公開します。
- 27 Gの針を1ミリリットル使い捨て注射器への菌液を描画します。各マウスについて、適切な濃度（10 5 CFUまでの各マウス）での細菌の20〜30μlの管理。
- 気管内に針を挿入します。気管にゆっくりとソリューションを注入する。
- 通常、その解決策を示している動物のあえぎが、肺に達していることを確認してください。
- 無菌条件下で無菌縫合糸（6-0モノフィラメント）で傷口を閉じます。
- 術後疼痛を制御するため術後鎮痛としては0.1mg / kgを皮下注射によりブプレノルフィンを使用してください。
- 切開の閉鎖に初期麻酔導入から所要時間が15分未満であることを確認してください。
- 注入後、適切なバイオハザードシャープコンテナに注射器や針の処分。
- DISIベースの二酸化塩素と手術器具を扱うnfectant 15分間、すすぎ、殺菌のために実験室に戻り、必要に応じて再利用します。
- ハウス暖かい環境できれいなケージで単独でのマウス。
- それは意識を取り戻し、動き出すまで、動物に30分ごとにチェックします。以降の最初の3日間、手術後12時間の間隔で。
- 実験を通して、動物のBSL2施設でマウスを保管してください。密封されたボックスに含まれている唯一の組織が動物BSL2施設を残していることを確認してください。マウスが瀕死行動のいずれかを表現した場合の研究中の任意の時点で（呼吸困難、嗜眠、穏やかな刺激に応答して歩き回るの失敗として定義される）、頸椎脱臼に続くボトル源からCO 2吸入によりマウスを安楽死させる。
- 麻酔下で放血によって実験対象を安楽死させる。
- 安楽死させたマウスからの肺組織を収集します。 BSL2フード内でこれらの手順を実行します。必要に応じて、RACに配置された密封されたチューブを使用してサンプルを転送さらにプロセスのスナップ蓋ボックス内の消毒ラディンペーパータオル上Kである。
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Representative Results
72時間後、P - 24から出発緑膿菌インジェクション 、細胞性の増加は、（ 図1A-D）肺切片において観察された。肺は、96時間後に損傷（ 図1E）から回復し始めた。 7日目にPを投稿する緑膿菌 、正常な肺胞の形態は大部分が（ 図1F）を回復した。 24時間後、P。で調製肺切片を用いたトンネル染色緑膿菌は、肺胞細胞（ 図1G-I）における細胞死を示した。この傷害モデルにおける修復過程を研究するために、BrdUをP.ポスト3日目にマウスに注射した緑膿菌 。肺は、5時間後のBrdU注入で分離およびBrdU抗体染色のために処理した。 図1J及びKに示されるように、有意に72時間後にPでBrdUを取り込んだ細胞の数を増加させ過剰増殖を示す緑膿菌の管理。
バリアあたりの変化を研究するために、磁率および炎症後損傷、気管支肺胞洗浄（BAL）液はP.ポスト異なる時点で採取した緑膿菌注入 。 BAL中のタンパク質濃度は有意に48時間後に増加したP.上皮バリアの漏出を示す緑膿菌注射（ 図2A）。 BAL中の細胞数はまた、48時間後に有意に増加したP.炎症反応を示唆している緑膿菌注射（ 図2B）。 P.ポスト5日- 4時緑膿菌注入 、BALタンパク質レベルと細胞数の両方が回復（ 図2A、B）を示唆して減少し始めた。さらに、肺溶解物は、P。ポスト異なる点で採取した緑膿菌の管理およびマクロファージ炎症性タンパク質2（MIP2）のレベル、好中球の魅力12に関与するサイトカインは、ELISAによって測定した。 BAL分析の結果と一致して、MIP2レベルが有意にincrea 48時間後にPでのsed 緑膿菌注入と96時間後にPで基底レベルに戻った緑膿菌注射（ 図2C）。さらに、BALからの細胞をスライドガラス上に固定し、血液学的染色を行った。 P.なし緑膿菌は、BAL液（ 図2D）における単球の数が少ないがあった。対照的に、好中球の大量のBAL中に存在した48時間後にP.で分離緑膿菌注射（ 図2E）。 96時間後にPにより緑膿菌注射、BALの細胞組成は、制御レベル（ 図2F）に戻った。要約すると、 図2の結果は、増加肺胞関門透過性および急性肺損傷13のすべての特徴であるサイトカイン濃度の増加とともに急性の好中球の炎症性応答を示した。全ての実験において、生理食塩水のそれ注射を対照として用いた。
ve_content "> HおよびE染色、BrdU標識、TUNELアッセイ、BAL分析とMIP2レベル測定を含むデータの一部は、以前に7を発表した。この記事では、我々は、修理では、FOXM1、転写因子の役割を研究ここで7記載緑膿菌肺傷害モデルを用いて肺胞傷害。
P.図1.組織学、細胞死と増殖緑膿菌は、マウス肺傷害モデルを媒介する。 （AF）肺分離、切片化し、H / E染色は、非Pを用いて行った緑膿菌は、注入された （非PA）、24時間（B）、48時間（C）、72時間（D）、96時間（E）、7日（F）郵便P.で対照肺（A）および肺における緑膿菌jection（ポストPA）（GI）肺切片は、対照肺（G）および24時間後P.から調製した。 緑膿菌は、肺（H、I）を注入し、細胞死を検出するためのTUNELアッセイのために進行する。肺切片の形態を示すために肺上皮細胞マーカーのSp-C（青）、T1α（赤色）について染色し、また、TUNEL（緑）について染色した。 （H）中の矢印は、TUNEL陽性細胞を示している。（J、K）のBrdUを非Pに注入した緑膿菌を注射したマウス（J）および72時間後にP.緑膿菌は、腹腔内によりマウス（K）を注射し、肺は5時間後のBrdU注射で調製し、BrdUに対する抗体染色（緑色染色）のために処理した。 AF、G及びHのためには50μm、 私のために20μmであり、JとKのために100μmのための=60μmのスケールバー。この図は、劉から変更されている
Pに以下の図2.歯槽関門透過性および炎症緑膿菌は、肺損傷を誘導した。 （A、B）BALは、制御及びPから採取した緑膿菌の肺を処理した。BAL中（A）のタンパク質濃度は48時間後に増加P.緑膿菌の注入と96時間で減少、5日間は、Pを投稿BALにおける緑膿菌注射（B）総細胞数を48時間後に増加したP.緑膿菌注射（B）および96時間後にPで制御レベルを再調整緑膿菌注入は。MIP-2レベルは、私たちを測定した（C）48時間および96時間後にP.で肺対照マウスから単離された溶解物と同様にマウスる緑膿菌注入 。データは平均±SEで発表された、n個のBALから≥3.（DF）細胞を遠心分離し、スライドガラス上に固定し、HEMA3染色に供した。単球の少数の対照マウスのBAL（D）中に存在した。好中球の大量のBAL中に存在した48時間後にP.で分離緑膿菌注射 （E）。 96時間後にPにより緑膿菌注射 、BAL（F）中の単球の数が少ないがあった。スケールバー=10μmのは、これらの結果は、少なくとも5つの独立した実験の代表である。この図は、Liu ら 7から変更されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで記述するシュードモナスマウス肺損傷モデルは、急性肺損傷または肺炎を以下起こる炎症、肺損傷、修理、および解像度の全体のプロセスを模倣。それは、臨床的に関連して比較的安全で、取り扱いが容易であるという点でいくつかの他の損傷モデルと比較独自の利点を有している。
手順における重要なステップは、菌液の注入が非常に遅くする必要があるということである。注射が速すぎる場合には、マウスは、チョークにより死亡する可能性がある。成功した注射の後、マウスは通常、粒子が肺に入る細菌を助けるいくつかの深い呼吸するとあえぎを示す。
私たちが使用した株は、PA103 6であった。このモデルの重要な点の一つは、Pの力価緑膿菌は、厳密に制御する必要がある。 Pのバッチ異なるソースからの緑膿菌は、さまざまな炎症の程度や損傷さえ示すことができた同じCFUで使用。従って、細菌のすべての新しいバッチ（ 等炎症、細胞増殖、など）、それらの原因となる効果について試験することが推奨され、それに応じて、使用するCFUの数を調整されている。結果の矛盾は、冷蔵細菌株を使用することによって発生した場合、1は各実験のために新鮮なプレートから増殖する細菌によって得られた新鮮な株式を使用することができます。また、細菌やメディアの選択の増殖期は、ホスト応答に対する効果に影響を与えることができる。したがって、介護、細菌接種が細菌の増殖サイクルの同じ位相の間に起こることを保証するために注意すべきである。
Pに応答に差があるかもしれませんマウスの異なる株による緑膿菌 。我々が使用した株は、C57BL / 6およびFVB / Nの混合物であった。適切なP.緑膿菌の力価は、異なるマウス株について決定されるべきである。
このモデルのために考慮すべき要因の一つである細菌の損傷は、一つの細胞型に限定されるものではない。例えば、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞は、すべての破損している可能性があります。したがって、このモデルは、細胞型特異的肺損傷の効果を研究するには適していない。細菌は、炎症反応を刺激することによって、ならびに組織6内毒素を分泌することによって肺の細胞死を引き起こす。生菌は通常、48時間後に傷害7,14内肺からクリアされます。死菌の高濃度はまた、炎症応答15を誘導することによって損傷を引き起こし得る。
肺損傷および修復のメカニズムは、肺損傷の異なる種類に応じて異なる可能性がある。したがって、いくつかの損傷モデルを比較することが重要である。 P.ここで説明緑膿菌モデルは他のモデルにはすてきな付加である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine | pharmaceutical grade | ||
| 27 G needle | Fisher | 1482648 | |
| syringe | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| scissors | Fine Science tools | ||
| forceps | Fine Science tools | ||
| suture | Fisher | 19-037-526 | |
| Eye gauge, glove, gown | |||
| Biosafety Cabinet | |||
| chlorine dioxide based disinfectant | Clidox | ||
| sheep blood agar plates | Medex supply | HL-1160 |
References
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