Abstract
Con el fin de estudiar la lesión pulmonar aguda humana y la neumonía, es importante desarrollar modelos animales para imitar varias características patológicas de esta enfermedad. Aquí hemos desarrollado un modelo de lesión de pulmón de ratón mediante inyección intra-traqueal de bacterias Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa o PA). Utilizando este modelo, hemos sido capaces de mostrar la inflamación pulmonar en la fase temprana de la lesión. Además, la barrera epitelial alveolar leakiness se observó mediante el análisis de lavado broncoalveolar (BAL); y la muerte celular alveolar se observó mediante el ensayo Tunel utilizando tejido preparado a partir de pulmones lesionados. En una fase posterior después de una lesión, se observó la proliferación de células requerido para el proceso de reparación. La lesión se resolvió 7 días desde el inicio de P. inyección aeruginosa. Este modelo imita el curso secuencial de la inflamación pulmonar, daño y reparación durante la neumonía. Este modelo animal clínicamente relevante es adecuado para el estudio de la patología, el mecanismo de reparación, fespués de la lesión pulmonar aguda, y también puede ser utilizado para probar agentes terapéuticos potenciales para esta enfermedad.
Introduction
Los pulmones están expuestos a los patógenos ambientales y son susceptibles a la inflamación y lesión de 1-3. Durante condiciones patológicas tales como la neumonía o síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA), patógenos, así como los factores inflamatorios liberados por los leucocitos inducen lesiones y la muerte de las células alveolares 1-3. Es importante desarrollar modelos animales de lesión pulmonar aguda para facilitar el estudio de la patología de la lesión, así como mecanismo de reparación.
En la actualidad, la mayoría de las personas utilizan modelos de lesión pulmonar hyperoxia y bleomicina ratón inducida 4. Sin embargo, los mecanismos de hiperoxia causaron daño no son los mismos que la mayoría de las lesiones pulmonares comunes que se producen durante la neumonía o el SDRA 5. La bleomicina lesión aguda inducida es raro en un contexto clínico 4. Aquí mostramos un modelo de lesión pulmonar de ratón utilizando la inyección intra-traqueal de P. aeruginosa 6,7. Este modelo es clínicamente relevante, e imita el procesos que suceden después de la neumonía 8.
Como un patógeno oportunista, nosocomial de individuos inmunocomprometidos, P. aeruginosa típicamente infecta el tracto pulmonar, tracto urinario, quemaduras, heridas, y también causa otras infecciones de sangre 6. Las bacterias liberan factor de virulencia exotoxina A, se multiplican y desencadenan respuestas inmunes 6. Administración intra-de la tráquea de P. aeruginosa refleja la situación en la exposición humana a las bacterias que causan la neumonía y la patología es probable que sea diferente del modelo de lesión informado recientemente de virus de la gripe H1N1 pulmonar inducida 9. Desde P. aeruginosa es un patógeno oportunista, es relativamente seguro de manejar en comparación con algunos de los patógenos más virulentas. Aquí hemos utilizado la inyección intra-traqueal para administrar las bacterias porque se observó que este método introduce más bacterias en la región distal alvéolos del pulmón en comparación conalgunos otros procedimientos, tales como el uso de un catéter a través de la boca.
En comparación con otros modelos de lesión pulmonar aguda, la P. aeruginosa modelo aquí descrito es adecuado para el estudio de la lesión pulmonar inducida por bacterias y por la inflamación excesiva. A diferencia de otros modelos animales que utilizan P. aeruginosa para inducir la sepsis 10,11, aquí utilizamos la inyección intra-traqueal de estas bacterias para inducir la lesión pulmonar aguda localizada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Protección de los Animales y de los Comités Institucionales de Bioseguridad de la Universidad de Illinois en Chicago.
NOTA: Todos los procedimientos que involucran pseudomonas deben realizarse con nivel de bioseguridad 2 (BSL2) prácticas, que incluyen pero no se limitan a: la máscara, protección para los ojos, bata o mono, y guantes dobles. Trabajar en la certificación de Bioseguridad gabinete. Tratar a los instrumentos en contacto con las bacterias con desinfectante a base de lejía o cloro dióxido. Use una caja sellada para muestras de transporte.
1. P. aeruginosa cultura y Crecimiento
- Tienda P. aeruginosa PA103 como una acción bacteriana en un tapón de rosca criovial a -80 ° C.
- Coloque el vial en un estante en una caja con un 70% de etanol mojado toallas de papel y llevarlo al laboratorio de Bioseguridad Nivel 2 (BSL2).
- Racha de las bacterias sobre placas de agar sangre de oveja y crecen a 37 ° C durante ~ 15 horas en una incubadora. En una campana BSL2, rayar las bacterias de la placa con el lazo bacterias y volver a suspender en 5 ml de PBS.
- Guarde el archivo a 4 ° C durante un máximo de 3 meses. Sin embargo, determinar el título cada 2 semanas.
- En serie diluir las bacterias en PBS (por lo general de 1:10 a 1:10 4 7) y la placa de la dilución conocida en placas de agar sangre de oveja.
- Incubar las placas durante ~ 15 h. Recuento de las colonias y calcular formadoras de colonias Unidad (CFU) para determinar la concentración de bacterias.
- Resuspender las concentraciones apropiadas (~ 5 x 10 3 UFC / l) en 0,5 ml de PBS en 1,5 ml crioviales estériles con tapón de rosca. Selle los crioviales y colocarlos en un estante criovial en desinfectantes toallas de papel cargado en una caja de tapa a presión.
- Transporte el cuadro de instalación para animales BSL2. Una vez allí, abrir la caja en el armario BSL2.
2. P. aeruginosa instilación
- Lleve a cabo la cirugía aséptica supervivencia (guantes estériles, instrumentos estérilesy técnicas asépticas). Utilice un paño estéril para proporcionar una superficie de trabajo para (autoclave) los instrumentos quirúrgicos estériles. Esterilizar los instrumentos utilizando un esterilizador de cuentas caliente entre cada procedimiento de instilación traqueal.
- Pesar los ratones antes de la anestesia. Anestesiar a los ratones con ketamina (100 mg / kg), xilazina (5 mg / kg), en 0,1-0,2 ml de PBS por vía intraperitoneal (ip). Determinar la eficacia de la anestesia por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie. Use un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia.
- Restringir los ratones en un tablero quirúrgico en el gabinete BSL2.
- Identificar el área para el corte hacia abajo. Afeitado esta área y preparar la piel con 3 veces alternando con el alcohol y povidona hisopos de yodo.
- Tratar el área de la incisión con anestesia local (lidocaína), ya que la anestesia es suficiente para una cirugía menor, tales como una incisión en la piel para acceder a la tráquea.
- Haga una pequeña incisión (aproximadamente 5 mm) en la línea media del cuello, y el uso de f romaorceps para mover suavemente el músculo para el acceso a la tráquea. Exponer la tráquea por la disección quirúrgica.
- Dibuje solución de bacterias en una jeringa desechable de 1 ml con aguja 27 G. Para cada ratón, administrar 20-30 l de bacterias a la concentración apropiada (hasta 10 5 CFU cada ratón).
- Insertar la aguja en la tráquea. Inyectar la solución lentamente en el traqueal.
- Asegúrese de que los jadeos de los animales, que por lo general indica que la solución ha alcanzado en el pulmón.
- Cierre la herida con suturas estériles (6-0 monofilamento) en condiciones asépticas.
- Utilice 0,1 mg / kg de buprenorfina por inyección subcutánea como post-op analgesia para controlar el dolor post-quirúrgico.
- Asegúrese de que el tiempo requerido desde la inducción anestésica inicial a la incisión de cierre es inferior a 15 min.
- Después de la inyección, desechar las jeringas y agujas en un recipiente previsto apropiado.
- Tratar a los instrumentos quirúrgicos con DISI basado dióxido de cloronfectant durante 15 minutos, enjuagar y volver al laboratorio para su esterilización y reutilizar cuando sea necesario.
- La casa de los ratones individualmente en jaulas limpias en ambiente cálido.
- Compruebe en el animal cada 30 minutos hasta que se recupera la conciencia y empieza a moverse; y posteriormente a intervalos de 12 h durante los primeros 3 días después de la cirugía.
- Mantener los ratones en las instalaciones de BSL2 animales durante todo el experimento. Asegúrese de que sólo el tejido contenido en la caja sellada salgan de la instalación BSL2 animal. Si los ratones expresan cualquiera de los comportamientos moribundas (definido como dificultad respiratoria, letargo, falta de deambular en respuesta a la estimulación suave) en cualquier punto en el estudio, la eutanasia a los ratones mediante inhalación de CO2 de una fuente embotellada seguido por dislocación cervical.
- La eutanasia el sujeto experimental por desangrado bajo anestesia.
- Recoger el tejido pulmonar de los ratones sacrificados. Llevar a cabo estos procedimientos en una capucha BSL2. Si es necesario, transferir la muestra utilizando tubos sellados colocados en un rack en desinfectantes toallas de papel cargado en una caja de tapa a presión para su posterior proceso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A partir de 24 a 72 h después de P. inyección aeruginosa, aumento de la celularidad se observó en secciones de pulmón (Figura 1A-D). El pulmón comenzó a recuperarse a partir de 96 horas después de la lesión (Figura 1E). A los 7 días después de la P. aeruginosa, la morfología normal de los alvéolos fue restaurada en gran medida (Figura 1F). Tinción Túnel secciones usando pulmonares prepararon a 24 h después de P. aeruginosa mostró la muerte celular en células de los alvéolos (Figura 1G-I). Con el fin de estudiar el proceso de reparación en este modelo de lesión, se inyectó BrdU a ratones a los 3 días de correos P. aeruginosa. Los pulmones fueron aisladas a las 5 horas después de la inyección de BrdU y se procesaron para la tinción de anticuerpos BrdU. Como se muestra en la Figura 1J y K, aumentó significativamente el número de células BrdU incorporado a 72 h después de P. administración aeruginosa indicando hiperproliferación.
Para estudiar el cambio en la barrera porpermeabilidad y posterior inflamación lesión, el lavado broncoalveolar (BAL) se recogió en diferentes puntos de tiempo publicar P. inyección aeruginosa. La concentración de proteínas en el BAL se incrementó de manera significativa a las 48 h después de P. aeruginosa inyección (Figura 2A), indicando la barrera epitelial permeabilidad. Los números de células en el BAL también aumentaron significativamente en 48 h después de P. aeruginosa inyección (Figura 2B), lo que sugiere una respuesta inflamatoria. A los 4 - 5 días posteriores P. inyección aeruginosa, tanto el nivel de la proteína BAL y número de células empezó a disminuir la recuperación sugiriendo (Figura 2A, B). Además, lisado de pulmón se recogió en diferentes puntos El poste de P. administración aeruginosa y el nivel de la proteína inflamatoria de macrófagos 2 (MIP2), una citoquina implicada en la atracción de neutrófilos 12, se midió mediante ELISA. Consistente con los resultados del análisis BAL, nivel MIP2 INCREA significativamente sed a las 48 h después de P. inyección aeruginosa y regresó al nivel basal a las 96 h después de P. aeruginosa inyección (Figura 2C). Además, las células de BAL se fijaron en portaobjetos de vidrio y se sometieron a tinción de hematología. Sin P. aeruginosa, sólo hubo un pequeño número de monocitos en el fluido BAL (Figura 2D). Por el contrario, gran cantidad de neutrófilos estaban presentes en BAL aisladas a las 48 h después de P. aeruginosa inyección (Figura 2E). Por 96 horas posteriores P. inyección aeruginosa, la composición de células de BAL regresó al nivel de control (Figura 2F). Para resumir, los resultados en la Figura 2 indican una respuesta inflamatoria neutrofílica aguda junto con una mayor permeabilidad de barrera alvéolos y el aumento de las concentraciones de citoquinas, que son todas las características de la lesión pulmonar aguda 13. En todos los experimentos, se utilizó la inyección de solución salina como control.
ve_content "> Parte de los datos, incluyendo H y E tinción, BrdU etiquetado, ensayo de TUNEL, el análisis y la medición de nivel BAL MIP2, se publicó anteriormente con el 7. En este artículo, se estudió el papel de FoxM1, un factor de transcripción, en la reparación de lesión alveolar utilizando el modelo de lesión pulmonar P. aeruginosa 7 describe aquí.
Figura 1. Histología, la muerte celular y la proliferación en P. aeruginosa modelo de lesión de pulmón de ratón mediada. Aislamiento (AF) de pulmón, seccionamiento y tinción H / E se realizaron con no P. inyecta-aeruginosa (no-PA) control de los pulmones (A), así como los pulmones a las 24 h (B), 48 h (C), 72 h (D), 96 h (E), 7 días (F) post P. aeruginosa eninyección (post-PA). (GI) secciones de pulmón se preparan a partir de pulmones de control (G) y 24 hr post-P. aeruginosa inyecta pulmones (H, I) y siga los pasos para el ensayo de TUNEL para detectar la muerte celular. Pulmón secciones fueron teñidas con marcador de células epiteliales de pulmón Sp-C (azul), T1α (rojo) para mostrar la morfología y también se tiñeron para TUNEL (verde). Las flechas en (H) indican células TUNEL positivas. (J, K) BrdU se inyecta en no P. aeruginosa ratones inyectados (J) y 72 h después de P. aeruginosa ratones inyectados (K) por IP, los pulmones se prepararon a 5 horas después de la inyección de BrdU y se procesaron para la tinción de anticuerpos contra BrdU (tinción verde). Barra de escala = 60 micras de AF, de 50 micras para G y H, de 20 micras de I, y 100 micras para J y K. Esta cifra se ha modificado a partir de Liu
Figura 2. alveolar permeabilidad de la barrera y la inflamación siguiente en P. aeruginosa induce lesión pulmonar. (A, B) BAL se recogió de control y P. aeruginosa tratada pulmones. (A) La concentración de proteína en el BAL se incrementó a 48 h después de P. inyección aeruginosa y la disminución a las 96 horas, a 5 días después de la P. aeruginosa inyección. (B) el número de células totales en BAL se incrementaron a 48 h después de P. aeruginosa inyección (B) y el nivel de control reajustada a 96 h después de P. inyección aeruginosa. (C) MIP-2 niveles se nos mideing lisados pulmonares aislados de los ratones de control, así como los ratones a las 48 hr y 96 hr de post P. inyección aeruginosa. Los datos fueron presentados en media ± SE, n ≥ 3. (DF) Las células de BAL se centrifuga y se fijaron en portaobjetos de vidrio y se sometieron a tinción Hema3. Un pequeño número de monocitos estaban presentes en BAL de ratones de control (D). Gran cantidad de neutrófilos estaban presentes en BAL aisladas a las 48 h después de P. aeruginosa inyección (E). Por 96 horas posteriores P. inyección aeruginosa, hubo un pequeño número de monocitos en el BAL (F). Barra de escala = 10 micras, estos resultados son representativos de al menos 5 experimentos independientes. Esta cifra se ha modificado a partir de Liu et al. 7. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El modelo de lesión pulmonar por Pseudomonas ratón que describimos aquí imita todo el proceso de la inflamación, lesión pulmonar, la reparación, y la resolución que se producen después de una lesión pulmonar aguda o neumonía. Tiene ventajas únicas en comparación con varios otros modelos de lesión, ya que es clínicamente relevante y relativamente seguro y fácil de manejar.
El paso crítico en el procedimiento es que la inyección de solución de bacterias tiene que ser muy lenta. Si la inyección es demasiado rápido, los ratones son propensos a morir por estrangulación. Después de una inyección de éxito, los ratones suelen mostrar varias respiraciones profundas y jadeo, que ayudarán a las bacterias partículas entran en los pulmones.
La cepa que utilizamos fue PA103 6. Uno de los puntos críticos de este modelo es que el título de P. aeruginosa debe ser estrechamente controlada. Lote de P. aeruginosa de origen diferente podría mostrar diferentes grados de inflamación y daño incluso cuandoutilizado al mismo CFU. Por lo tanto, se recomienda que cada nuevo lote de bacterias ser probado por sus efectos causales (tales como la inflamación, la proliferación celular, etc.), y, en consecuencia ajustar el número de CFU a utilizar. Si la inconsistencia de los resultados se produce mediante el uso de bacterias refrigerados de valores, uno puede usar valores fresca obtenida por bacterias que crecen de una placa fresca para cada experimento. Además, la fase de crecimiento de las bacterias y la elección de los medios de comunicación también puede tener un impacto en el efecto sobre la respuesta del huésped. Por lo tanto, se debe tener cuidado para asegurar que las inoculaciones bacterianas ocurren durante la misma fase del ciclo de crecimiento bacteriano.
Puede haber una diferencia en la respuesta a P. aeruginosa por diferentes cepas de ratones. La cepa se utilizó era una mezcla de C57BL / 6 y FVB / N. El P. apropiado aeruginosa título debe determinarse para diferentes cepas de ratones.
Uno de los factores a considerar para este modelo esque el daño de las bacterias no se limita a un tipo de célula. Por ejemplo, epiteliales, endoteliales, fibroblastos podrían todos han sido dañados. Por lo tanto, este modelo no es adecuado para estudiar los efectos de las lesiones pulmonares específica de tipo celular. Las bacterias causan la muerte celular de pulmón mediante la estimulación de las respuestas inflamatorias, así como mediante la secreción de toxinas en el tejido 6. Bacterias vivas por lo general se eliminan de los pulmones después de la lesión dentro de 48 horas 7,14. Una alta concentración de bacterias muertas también puede causar daño mediante la inducción de respuestas inflamatorias 15.
Los mecanismos de la lesión pulmonar y reparación son probable que sea diferente en respuesta a diferentes tipos de lesión pulmonar. Por lo tanto, es importante comparar varios modelos de lesión. El P. aeruginosa modelo descrito aquí es una buena adición a los otros modelos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine | pharmaceutical grade | ||
| 27 G needle | Fisher | 1482648 | |
| syringe | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| scissors | Fine Science tools | ||
| forceps | Fine Science tools | ||
| suture | Fisher | 19-037-526 | |
| Eye gauge, glove, gown | |||
| Biosafety Cabinet | |||
| chlorine dioxide based disinfectant | Clidox | ||
| sheep blood agar plates | Medex supply | HL-1160 |
References
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Shimabukuro, D. W., Sawa, T., Gropper, M. A. Injury and repair in lung and airways. Crit Care Med. 31 (8), 524-531 (2003).
- Wansleeben, C., Barkauskas, C. E., Rock, J. R., Hogan, B. L. Stem cells of the adult lung: Their development and role in homeostasis, regeneration, and disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 131-148 (2013).
- Singleton, P. A., et al. Dynamin 2 and c-abl are novel regulators of hyperoxia-mediated nadph oxidase activation and reactive oxygen species production in caveolin-enriched microdomains of the endothelium. J Biol Chem. 284, 34964-34975 (2009).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J. W., Prince, A. S. Pathogen-host interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1209-1223 (2005).
- Liu, Y., et al. Foxm1 mediates the progenitor function of type ii epithelial cells in repairing alveolar injury induced by pseudomonas aeruginosa. J Exp Med. 208, 1473-1484 (2011).
- Kurahashi, K., et al. Pathogenesis of septic shock in pseudomonas aeruginosa pneumonia. J Clin Invest. 104, 743-750 (1999).
- Kumar, P. A., et al. Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following h1n1 influenza infection. Cell. 147, 525-538 (2011).
- Delano, M. J., et al. Sepsis induces early alterations in innate immunity that impact mortality to secondary infection. J Immunology. 186, 195-202 (2011).
- Lange, M., et al. A murine model of sepsis following smoke inhalation injury. Biochem Biophys Res Commun. 391 (3), 1555-1560 (2010).
- Kobayashi, Y. The role of chemokines in neutrophil biology. Front Biosci. 13, 2400-2407 (2008).
- Matute-Bello, G., et al. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L379-L399 (2008).
- Sadikot, R. T., et al. Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa. J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).
- Pinto, I. L., et al. Development of an experimental model of neutrophilic pulmonary response induction in mice. J Pneumologia. 29, 213-214 (2003).
