Abstract
من أجل دراسة إصابة الرئة الحادة والالتهاب الرئوي الإنسان، فمن المهم تطوير نماذج حيوانية لتقليد العديد من المظاهر المرضية لهذا المرض. نحن هنا قمنا بتطوير نموذج إصابة الرئة الماوس عن طريق الحقن داخل القصبة الهوائية من البكتيريا الزائفة الزنجارية (P. الزنجارية أو PA). باستخدام هذا النموذج، تمكنا من إظهار التهاب الرئة في مرحلة مبكرة من الإصابة. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ السنخية الظهارية حاجز التسرب من خلال تحليل غسيل القصبات (BAL)؛ وموت الخلايا السنخية لوحظ من قبل تونيل الفحص باستخدام الأنسجة المحضرة من المصابين الرئتين. في مرحلة لاحقة بعد الإصابة، لاحظنا انتشار الخلايا المطلوبة لعملية الإصلاح. تم حل إصابة 7 أيام من بدء P. الزنجارية الحقن. هذا نموذج يحاكي مسار تسلسلي للالتهاب الرئة والإصابة وإصلاح أثناء الالتهاب الرئوي. هذا نموذج حيواني ذات الصلة سريريا هو مناسبة لدراسة علم الأمراض، وآلية للإصلاح، وollowing إصابة الرئة الحادة، ويمكن أيضا أن تستخدم لاختبار وكلاء العلاجية المحتملة لهذا المرض.
Introduction
ويتعرض الرئتين لمسببات الأمراض البيئية وعرضة للالتهاب وإصابة 1-3. خلال الحالات المرضية مثل الالتهاب الرئوي أو متلازمة الشدة التنفسية للبالغين (ARDS)، مسببات الأمراض، فضلا عن العوامل الالتهابية الصادرة عن الكريات البيض تحفز الإصابة وموت الخلايا السنخية 1-3. من المهم تطوير نماذج حيوانية من إصابة الرئة الحادة لتسهيل دراسة علم الأمراض من الإصابة وكذلك آلية للإصلاح.
حاليا، معظم الناس يستخدمون فرط التأكسج وبليوميسين يسببها الماوس نماذج إصابة الرئة 4. ومع ذلك، تسببت آليات فرط التأكسج الإصابة ليست هي نفسها حيث أن معظم إصابات الرئة شيوعا التي تحدث أثناء الالتهاب الرئوي أو ARDS 5. بليوميسين الإصابة الحادة يسببها نادرة في سياق السريرية 4. نحن هنا تقرير ماوس الرئة نموذج اصابة باستخدام الحقن داخل القصبة الهوائية من P. الزنجارية 6،7. هذا النموذج هو ذات الصلة سريريا، ويقلد عrocesses أن يحدث بعد الالتهاب الرئوي 8.
على أنه انتهازي، الممرض في المستشفيات الأفراد المناعة، P. الزنجارية عادة يصيب الجهاز الرئوي، والمسالك البولية، والحروق، والجروح، ويسبب أيضا التهابات الدم الأخرى 6. البكتيريا تطلق الفوعة عامل ذيفان خارجي A، تتكاثر وتؤدي الاستجابة المناعية 6. الإدارة داخل trachael من P. الزنجارية يعكس الوضع في تعرض الإنسان للبكتيريا التي تسبب الالتهاب الرئوي، ومن المرجح أن يكون مختلفا عن أفادت مؤخرا فيروس الأنفلونزا H1N1 الرئة الناجم عن نموذج إصابة 9 في علم الأمراض. منذ P. الزنجارية هي العوامل المسببة للأمراض الانتهازية، وأنها آمنة نسبيا للتعامل مع مقارنة لبعض مسببات الأمراض أكثر ضراوة. نحن هنا يستخدم الحقن داخل القصبة الهوائية لإدارة البكتيريا لاحظنا أن هذه الطريقة إدخال المزيد من الجراثيم في المنطقة الأسناخ الرئوية البعيدة للمقارنةبعض الإجراءات الأخرى مثل استخدام القسطرة عن طريق الفم.
بالمقارنة مع غيرها من نماذج إصابة الرئة الحادة، وP. نموذج الزنجارية الموصوفة هنا هي مناسبة لدراسة إصابة الرئة الناجمة عن بكتيريا والالتهاب المفرط. على عكس النماذج الحيوانية الأخرى التي تستخدم P. الزنجارية للحث على الإنتان 10،11، وهنا نستخدم الحقن داخل القصبة الهوائية من هذه البكتيريا للحث محلية إصابة الرئة الحادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان واللجان المؤسسية للسلامة الأحيائية في جامعة إلينوي في شيكاغو.
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي الزائفة مع السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) الممارسات، والتي تشمل ولكن لا تقتصر على: قناع، حماية العين، ثوب أو بذلة، وقفازات مزدوجة. العمل في شهادة السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. علاج الأدوات في اتصال مع البكتيريا مع التبييض أو ثاني أكسيد الكلور المطهرة القائم. استخدام مربع مختومة لعينات النقل.
1. P. الزنجارية الثقافة والنمو
- متجر P. الزنجارية PA103 باعتباره الأسهم البكتيري في كاب المسمار cryovial في -80 درجة مئوية.
- وضع القارورة في رفوف في مربع مع 70٪ من الإيثانول المناشف الورقية المبللة واتخاذ لغرفة المستوى 2 (BSL2) المختبر.
- خط البكتيريا على لوحات أجار الدم الأغنام وتنمو عند 37 درجة مئوية لمدة 15 ساعة ~ في حاضنة. في غطاء BSL2، خدش البكتيريا من البكتيريا لوحة مع حلقة وresuspend في 5 مل PBS.
- تخزين السهم عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. ومع ذلك، وتحديد عيار كل 2 أسابيع.
- متسلسل تمييع البكتيريا في برنامج تلفزيوني (عادة من 4 إلى 1:10 1:10 7) لوحة والتخفيف من المعروف على لوحات أجار الدم الأغنام.
- احتضان لوحات ل~ 15 ساعة. عد المستعمرات وحساب مستعمرة تشكيل وحدة (كفو) لتحديد تركيز البكتيريا.
- resuspend وتركيزات مناسبة (~ 5 × 10 3 خلية / ميكرولتر) في 0.5 مل PBS في 1.5 مل العقيمة cryovials سقف المسمار. ختم cryovials ووضعها في رف cryovial على مطهر المناشف الورقية لادن في مربع المفاجئة غطاء.
- نقل مربع إلى منشأة الحيوان BSL2. مرة واحدة هناك، افتح مربع في مجلس الوزراء BSL2.
2. P. الزنجارية تقطير
- إجراء عملية جراحية بقاء جو معقم و مطهر (قفازات معقمة، والأدوات المعقمة، وتقنيات العقيم). استخدام ثنى العقيمة لتوفير سطح العمل لمعقمة (تعقيمها) الأدوات الجراحية. تعقيم الأدوات باستخدام حبة تعقيم الساخن بين كل إجراء تقطير القصبة الهوائية.
- وزن الفئران قبل التخدير. تخدير الفئران مع الكيتامين (100 ملغ / كلغ)، زيلازين (5 ملغ / كلغ)، في 0،1-0،2 مل PBS البريتونى (IP). تحديد فعالية مخدر من غير استجابة لقرصة أخمص قدميه. استخدام مرهم البيطرية على العينين لمنع جفاف تحت التخدير.
- كبح الفئران على لوحة العمليات الجراحية في BSL2 مجلس الوزراء.
- تحديد المنطقة لقطعها. يحلق هذا المجال وإعداد الجلد باستخدام بالتناوب الكحول ومسحات اليود البوفيدون 3 مرات.
- علاج منطقة شق مع مخدر موضعي (ليدوكائين)، وهذا التخدير كافية لجراحة بسيطة مثل شق الجلد للوصول إلى القصبة الهوائية.
- إجراء شق صغير (حوالي 5 ملم) في خط الوسط من الرقبة، واستخدام و حادةorceps للتحرك برفق العضلات للوصول إلى القصبة الهوائية. فضح القصبة الهوائية عن طريق تشريح الجراحي.
- رسم البكتيريا الحل في 1 مل حقنة واحدة مع إبرة 27 G. لكل الماوس، إدارة 20-30 ميكرولتر من البكتيريا في التركيز المناسب (تصل إلى 10 5 كفو كل الماوس).
- ادخال الإبرة في القصبة الهوائية. حقن محلول ببطء في القصبة الهوائية.
- تأكد من أن صيحات الحيوان، والتي عادة ما يشير هذا الحل قد وصلت إلى الرئة.
- إغلاق الجرح مع الغرز معقمة (6-0 حيدة) تحت ظروف معقمة.
- استخدام 0.1 ملغ / كغ عن طريق الحقن تحت الجلد البوبرينورفين كما تسكين بعد العملية للسيطرة على الألم بعد الجراحة.
- تأكد من أن الوقت اللازم من تحريض التخدير الأولي لإغلاق الجرح هو أقل من 15 دقيقة.
- بعد الحقن، والتخلص من المحاقن والإبر في وعاء واقية الأدوات الحادة المناسبة.
- معالجة الأدوات الجراحية مع ثاني أكسيد الكلور الديسي مقرهاnfectant لمدة 15 دقيقة، شطف والعودة إلى المختبر للتعقيم وإعادة استخدامها عند الضرورة.
- بيت الفئران منفردة في أقفاص نظيفة في بيئة دافئة.
- اطمئنان على الحيوانات كل 30 دقيقة حتى يستعيد وعيه ويبدأ في التحرك. وبعد ذلك في فترات زمنية 12 ساعة لمدة 3 أيام بعد الجراحة الأولى.
- إبقاء الفئران في المنشأة BSL2 الحيوان في كافة مراحل التجربة. تأكد من أن الأنسجة الوحيدة الواردة في صندوق مغلق يترك منشأة BSL2 الحيوان. إذا كانت الفئران تبدي أي من السلوكيات المحتضرة (الذي يعرف بأنه ضيق التنفس والخمول، وعدم ambulate ردا على التحفيز لطيف) في أي نقطة في الدراسة، الموت ببطء الفئران عن طريق الاستنشاق CO 2 من مصدر المعبأة تليها خلع عنق الرحم.
- الموت ببطء موضوع التجريبي استنزاف تحت التخدير.
- جمع أنسجة الرئة من الفئران الموت الرحيم. تنفيذ هذه الإجراءات في غطاء BSL2. إذا لزم الأمر، ونقل العينة باستخدام أنابيب مختومة وضعت في راكك مطهر على مناشف ورقية لادن في مربع غطاء المفاجئة لمزيد من العملية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ابتداء من 24-72 ساعة بعد P. حقن الزنجارية، وقد لوحظ زيادة الخلوية في أقسام الرئة (الشكل 1A-D). بدأت الرئة للتعافي من اصابة في آخر 96 ساعة (الشكل 1E). في 7 أيام إضافة P. الزنجارية، تم استعادة التشكل الحويصلات الهوائية العادية إلى حد كبير (الشكل 1F). نفق تلطيخ أقسام الرئة باستخدام أعدت في 24 ساعة بعد P. أظهر الزنجارية موت الخلية في الخلايا الأسناخ (الشكل 1G-I). من أجل دراسة عملية الإصلاح في هذا النموذج إصابة، تم حقنها في الفئران BrdU في 3 أيام بعد P. الزنجارية. تم عزل الرئتين عند 5 ساعة حقن آخر BrdU ومعالجتها لBrdU تلوين الأجسام المضادة. كما هو مبين في الشكل 1J وK، زيادة كبيرة في عدد الخلايا أدرجت BrdU في 72 ساعة بعد P. إدارة الزنجارية مشيرا المفرط ل.
لدراسة التغير في حاجز للmeability والتهاب إصابة آخر، غسيل القصبات تم جمع (بال) السوائل في نقاط زمنية مختلفة إضافة P. الزنجارية الحقن. وقد ازداد تركيز البروتين في BAL بشكل ملحوظ في 48 ساعة بعد P. الزنجارية حقن (الشكل 2A)، مشيرا إلى الظهارية حاجز التسرب. كما زادت أعداد الخلايا بشكل ملحوظ في بال في 48 ساعة بعد P. الزنجارية حقن (الشكل 2B)، مما يشير إلى استجابة التهابية. عند 4 - 5 ايام بعد P. حقن الزنجارية، بدأ كل من مستوى البروتين بال وعدد الخلايا في الانخفاض مما يدل على الانتعاش (الشكل 2A، B). وعلاوة على ذلك، تم جمعها المحللة الرئة عند نقاط مختلفة ظيفة وP. إدارة الزنجارية ومستوى بلعم بروتين التهابات 2 (MIP2)، خلوى تشارك في جذب العدلات 12، وقد تم قياس بواسطة ELISA. متسقة مع نتائج التحليل بال، ومستوى MIP2 increa كبير الحوار الاقتصادي الاستراتيجي في 48 ساعة بعد P. عاد الزنجارية حقن والمستوى القاعدي في 96 ساعة بعد P. الزنجارية حقن (الشكل 2C). وعلاوة على ذلك، تم إصلاح الخلايا من BAL على الشرائح الزجاجية وتعرض لأمراض الدم تلطيخ. دون P. الزنجارية، لم يكن هناك سوى عدد قليل من وحيدات في بال السائل (الشكل 2D). في المقابل، كانت كمية كبيرة من العدلات الحالي في BAL عزل في 48 ساعة بعد P. الزنجارية حقن (الشكل 2E). قبل 96 ساعة آخر P. حقن الزنجارية، وتكوين خلية من BAL عاد إلى مستوى التحكم (الشكل 2F). لتلخيص، أشارت النتائج في الشكل 2 استجابة التهابية حادة عدلة مع زيادة نفاذية جدار الأسناخ وزيادة في تركيزات خلوى، وهي كلها بصمات إصابة الرئة الحادة 13. في كل التجارب، انه كان يستخدم حقن المحلول الملحي عن السيطرة.
ve_content "> جزء من البيانات، بما في ذلك H و E تلطيخ، ووضع العلامات BrdU، TUNEL فحص وتحليل BAL وقياس مستوى MIP2، ونشرت في السابق 7. في هذه المقالة، درسنا دور FoxM1، وهو عامل النسخ، في إصلاح الإصابة السنخية باستخدام P. الزنجارية نموذج إصابة الرئة هو موضح هنا 7.
الشكل 1. علم الأنسجة، موت الخلايا وانتشار في P. الزنجارية فأر بوساطة نموذج إصابة الرئة. أجريت العزلة (AF) الرئة، باجتزاء وH / E تلطيخ باستخدام غير P. الزنجارية حقن (غير الفلسطينية) الرئتين السيطرة (A)، وكذلك الرئتين في 24 ساعة (B)، 48 ساعة (C)، 72 ساعة (D)، 96 ساعة (E)، 7 أيام (F) آخر P. الزنجارية فيjection (ما بعد السلطة الفلسطينية). (GI) أعدت أقسام الرئة من الرئتين التحكم (G) و 24 ساعة ما بعد P. حقن الزنجارية الرئتين (H، I) والمضي قدما لTUNEL فحص للكشف عن موت الخلايا. كانت ملطخة أقسام الرئة للعلامة الخلايا الظهارية الرئة SP-C (الأزرق)، T1α (أحمر) لإظهار التشكل وملطخة أيضا عن النفق (الخضراء). سهام في (H) تشير الخلايا إيجابية النفق. (J، K) تم حقن BrdU في عدم P. الزنجارية حقن الفئران (J) و 72 ساعة بعد P. حقن الفئران الزنجارية (K) من خلال الملكية الفكرية، وأعدت الرئتين عند 5 ساعة حقن آخر BrdU ومعالجتها لتلوين الأجسام المضادة ضد BrdU (تلطيخ الخضراء). شريط النطاق = 60 ميكرومتر لAF، 50 ميكرون لG و H، 20 ميكرون لأني، و 100 ميكرومتر لJ و K. تم تعديل هذا الرقم من ليو
الشكل 2. السنخية حاجز النفاذية والتهاب التالية في P. الزنجارية التي يسببها إصابة الرئة. (A، B) وقد تم جمع BAL من السيطرة وP. تعامل الزنجارية الرئتين. زيادة (A) تركيز البروتين في بال في 48 ساعة بعد P. الزنجارية الحقن وانخفضت في 96 ساعة، 5 آخر أيام P. ارتفعت الزنجارية الحقن. (ب) مجموع أعداد الخلايا في بال في 48 ساعة بعد P. الزنجارية حقن (ب) وعاد مستوى التحكم في 96 ساعة بعد P. الزنجارية الحقن. (C) MIP-2 تم قياس مستويات لنالست] جي الرئة معزولة عن السيطرة على الفئران وكذلك الفئران في 48 ساعة و 96 ساعة بعد P. الزنجارية الحقن. تم عرض البيانات في متوسط ± SE، ن تم طرد ≥ 3. (DF) من خلايا BAL وثابتة على الشرائح الزجاجية وتعرض لHEMA3 تلطيخ. وكان عدد قليل من حيدات موجودة في بال من السيطرة على الفئران (D). وكانت كمية كبيرة من العدلات الحالي في BAL معزولة في 48 ساعة بعد P. الزنجارية حقن (E). قبل 96 ساعة آخر P. حقن الزنجارية، كان هناك عدد قليل من وحيدات في بال (F). مقياس شريط = 10 ميكرون، وهذه النتائج هي تمثيلية لا يقل عن 5 تجارب مستقلة. تم تعديل هذا الرقم من ليو وآخرون. 7. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والزائفة الماوس الرئة نموذج الإصابة التي وصفنا هنا يحاكي العملية برمتها من التهاب أو إصابة الرئة، والإصلاح، والدقة التي تحدث بعد إصابة الرئة الحادة أو التهاب رئوي. لديها مزايا فريدة مقارنة مع العديد من النماذج إصابة أخرى في أنها ذات الصلة سريريا وآمنة نسبيا وسهلة في التعامل معها.
في خطوة حاسمة في الإجراء هي أن حقن محلول البكتيريا يحتاج إلى أن تكون بطيئة جدا. إذا حقن سريع جدا، من المحتمل أن يموت قبل خنق الفئران. بعد حقن ناجحة، أظهرت الفئران عادة عدة يتنفس عميقا واللحظات، والتي سوف تساعد البكتيريا الجزيئات الحصول في الرئة.
كانت سلالة كنا PA103 6. واحدة من النقاط الهامة لهذا النموذج هو أن من عيار P. الزنجارية يحتاج إلى رقابة مشددة. دفعة من P. الزنجارية من مصدر آخر يمكن أن تظهر درجات مختلفة من الالتهاب والتلف حتى عندماتستخدم في نفس كفو. وبالتالي، فمن المستحسن أن كل دفعة جديدة من البكتيريا يتم اختبار لآثارها المسببة (مثل التهاب، تكاثر الخلايا، الخ)، وبالتالي ضبط عدد من كفو لاستخدامها. إن التناقض في النتائج يحدث باستخدام الأسهم البكتيريا المبردة، يمكن للمرء أن استخدام المخزون جديدة حصلت عليها البكتيريا المتزايد من لوحة جديدة لكل تجربة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرحلة نمو البكتيريا واختيار وسائل الإعلام أيضا أن يكون له تأثير على التأثير على استجابة المضيف. لذا، يجب توخي الحذر لضمان أن التطعيمات البكتيرية تحدث خلال نفس المرحلة من دورة النمو البكتيرية.
قد يكون هناك اختلاف في الاستجابة لP. الزنجارية من قبل سلالات مختلفة من الفئران. كانت سلالة كنا خليط من C57BL / 6 و FVB / N. وP. المناسب وينبغي أن تحدد الزنجارية عيار لسلالات الفئران مختلفة.
أحد العوامل للنظر لهذا النموذج هوأن الضرر من البكتيريا لا يقتصر على نوع خلية واحدة. على سبيل المثال، الظهارية، البطانية، قد تضررت جميع الخلايا الليفية. وبالتالي، لا يناسب هذا النموذج لدراسة آثار خلية من نوع إصابات الرئة محددة. البكتيريا تسبب موت الخلايا في الرئة من خلال تحفيز الاستجابات الالتهابية وكذلك عن طريق إفراز السموم في الأنسجة 6. عادة يتم مسح بكتيريا حية من الرئة خلال 48 ساعة بعد الإصابة 7،14. وهناك نسبة عالية من البكتيريا الميتة يمكن أيضا أن يسبب الضرر عن طريق حفز الاستجابات الالتهابية 15.
آليات إصابة الرئة والإصلاح من المرجح أن تكون مختلفة استجابة لأنواع مختلفة من إصابة الرئة. لذا، من المهم للمقارنة عدة نماذج الاصابة. وP. نموذج الزنجارية الموصوفة هنا هو لطيفة، بالإضافة إلى نماذج أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine | pharmaceutical grade | ||
| 27 G needle | Fisher | 1482648 | |
| syringe | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| scissors | Fine Science tools | ||
| forceps | Fine Science tools | ||
| suture | Fisher | 19-037-526 | |
| Eye gauge, glove, gown | |||
| Biosafety Cabinet | |||
| chlorine dioxide based disinfectant | Clidox | ||
| sheep blood agar plates | Medex supply | HL-1160 |
References
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Shimabukuro, D. W., Sawa, T., Gropper, M. A. Injury and repair in lung and airways. Crit Care Med. 31 (8), 524-531 (2003).
- Wansleeben, C., Barkauskas, C. E., Rock, J. R., Hogan, B. L. Stem cells of the adult lung: Their development and role in homeostasis, regeneration, and disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 131-148 (2013).
- Singleton, P. A., et al. Dynamin 2 and c-abl are novel regulators of hyperoxia-mediated nadph oxidase activation and reactive oxygen species production in caveolin-enriched microdomains of the endothelium. J Biol Chem. 284, 34964-34975 (2009).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J. W., Prince, A. S. Pathogen-host interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1209-1223 (2005).
- Liu, Y., et al. Foxm1 mediates the progenitor function of type ii epithelial cells in repairing alveolar injury induced by pseudomonas aeruginosa. J Exp Med. 208, 1473-1484 (2011).
- Kurahashi, K., et al. Pathogenesis of septic shock in pseudomonas aeruginosa pneumonia. J Clin Invest. 104, 743-750 (1999).
- Kumar, P. A., et al. Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following h1n1 influenza infection. Cell. 147, 525-538 (2011).
- Delano, M. J., et al. Sepsis induces early alterations in innate immunity that impact mortality to secondary infection. J Immunology. 186, 195-202 (2011).
- Lange, M., et al. A murine model of sepsis following smoke inhalation injury. Biochem Biophys Res Commun. 391 (3), 1555-1560 (2010).
- Kobayashi, Y. The role of chemokines in neutrophil biology. Front Biosci. 13, 2400-2407 (2008).
- Matute-Bello, G., et al. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L379-L399 (2008).
- Sadikot, R. T., et al. Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa. J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).
- Pinto, I. L., et al. Development of an experimental model of neutrophilic pulmonary response induction in mice. J Pneumologia. 29, 213-214 (2003).
