Abstract
Um die menschliche akute Lungenschädigung oder Lungenentzündung zu untersuchen, ist es wichtig, Tiermodelle zu entwickeln, um verschiedene pathologische Merkmale dieser Krankheit zu imitieren. Hier haben wir eine Maus Lungenverletzung Modell durch intratracheale Injektion von Bakterien Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa oder PA) entwickelt. Mit diesem Modell konnten wir Lungenentzündung in der frühen Phase der Verletzung zeigen. Zusätzlich wurde Alveolarepithel- Sperr Undichtigkeit durch Analysieren bronchoalveoläre Lavage (BAL) beobachtet; und alveoläre Zelltod wurde durch TUNEL-Assay mit Gewebe aus verletzten Lunge vorbereitet beobachtet. Zu einem späteren Phase nach der Verletzung, beobachteten wir die Zellproliferation für den Reparaturvorgang erforderlich. Die Verletzung wurde von 7 Tagen ab der Einleitung des P. gelöst aeruginosa Injektion. Dieses Modell imitiert die sequentielle Verlauf Lungenentzündung, Verletzungen und Reparatur während einer Lungenentzündung. Diese klinisch relevanten Tiermodell eignet sich für das Studium der Pathologie, Mechanismus der Reparatur, fach akuter Lungenverletzung, und kann auch verwendet werden, um potentielle therapeutische Mittel für diese Krankheit zu testen.
Introduction
Lungen Umweltkrankheitserreger ausgesetzt und sind anfällig für Entzündungen und Verletzungen 1-3. Während pathologischen Zuständen, wie Lungenentzündung oder Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS), Krankheitserreger sowie Entzündungsfaktoren von Leukozyten freigesetzt induzieren Verletzungen und Tod von Alveolarzellen 1-3. Es ist wichtig zu Tiermodellen von akutem Lungenversagen entwickeln, um die Untersuchung der Pathologie von Verletzungen sowie Mechanismus der Reparatur zu erleichtern.
Gegenwärtig sind die meisten Leute benutzen Hyperoxie und Bleomycin induzierten Mauslungenverletzung Modelle 4. Jedoch sind die Mechanismen der Hyperoxie Schädigung verursacht sind nicht die gleichen wie die häufigste Lungenverletzungen, die bei Lungenentzündung oder ARDS 5 auftreten. Bleomycin induzierte akute Verletzung ist selten im klinischen Kontext 4. Eine Maus Lungenverletzung Modell mit intratracheale Injektion von P. Hier berichten wir aeruginosa 6,7. Dieses Modell ist klinisch relevant, und ahmt die prozesse, die folgende Lungenentzündung 8 geschehen.
Als opportunistische, nosokomiale Erreger der immungeschwächten Personen, P. aeruginosa infiziert in der Regel die Lungenwege, der Harnwege, Verbrennungen, Wunden, und verursacht auch andere Blutinfektionen 6. Die Bakterien setzen Virulenzfaktor Exotoxin A, multiplizieren und lösen Immunreaktionen 6. Intra-trachael Verabreichung von P. aeruginosa spiegelt die Situation in der menschlichen Exposition gegenüber den Bakterien, die Lungenentzündung verursachen und die Pathologie ist wahrscheinlich anders als die vor kurzem berichtet, Influenza-Virus H1N1 induzierten Lungenschädigung Modell 9 zu sein. Da P. aeruginosa ist ein opportunistisches Pathogen, das relativ sicher im Vergleich zu einigen der virulenten Pathogenen handhaben ist. Hier verwendeten wir intratracheale Injektion, um die Bakterien zu verabreichen, weil wir festgestellt, dass dieses Verfahren eingeführt mehr Bakterien in den distalen Bereich der Alveolen der Lunge im Vergleich mitEinige andere Verfahren wie die Verwendung eines Katheters über den Mund.
Verglichen mit anderen akuten Lungenverletzung Modelle, die P. hier beschriebenen aeruginosa Modell eignet sich für das Studium Lungenschädigung durch Bakterien und durch übermäßige Entzündung induziert. Im Gegensatz zu anderen Tiermodellen, die P. verwenden aeruginosa Sepsis 10,11 induzieren, hier verwenden wir intratracheale Injektion dieser Bakterien, um lokalisierte akute Lungenschädigung zu induzieren.
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Protocol
Die Tierversuche wurden von der Tierpflege Ausschuss und Institutional Biosafety Ausschüsse der Universität von Illinois in Chicago genehmigt.
HINWEIS: Maske, Augenschutz, Kleid oder Overall und Doppelhandschuhe: Alle Verfahren, die Pseudomonas sollte mit biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL2) Praktiken, die umfassen, sind aber nicht beschränkt durchgeführt werden. Arbeiten Sie in zertifizierten Sicherheitswerkbank. Gönnen Instrumente in Kontakt mit Bakterien mit Bleichmittel oder Chlordioxid Desinfektionsmittel. Verwenden Sie eine versiegelte Verpackung für den Transport Proben.
1. P. aeruginosa Kultur und Wachstum
- Shop P. aeruginosa PA103 als Bakterienbestand in einer Schraubkappe Kryoröhrchen bei -80 ° C.
- Legen Sie das Fläschchen in einem Rack in einem Kasten mit 70% Ethanol benetzt Papierhandtücher und zu ergreifen, um die biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL2) Labor.
- Streak die Bakterien auf Schafblut-Agar-Platten wachsen bei 37 ° C für ~ 15 Stunden in einem Inkubator. In einer BSL2- Haube, kratzen die Bakterien von der Platte mit Bakterien Schleife und resuspendieren in 5 ml PBS.
- Bewahren Sie die Lager bei 4 ° C für bis zu 3 Monate. Allerdings bestimmen die Titer alle 2 Wochen.
- Seriell zu verdünnen, die Bakterien in PBS (in der Regel von 1:10 4 bis 1:10 7) und die Platte des bekannten Verdünnung auf Schafblut-Agar-Platten.
- Inkubieren Sie die Platten für ~ 15 Std. Graf Kolonien und berechnen Colony Forming Unit (CFU) nach Bakterienkonzentration zu bestimmen.
- Resuspendieren der entsprechenden Konzentrationen (~ 5 x 10 3 KbE / ul) in 0,5 ml PBS in 1,5 ml steriler Schraubkappe Kryoröhrchen. Dichten Sie die Kryoröhrchen und legen Sie sie in einem Kryoröhrchen Rack auf Desinfektionsmittel beladene Papierhandtücher in einem Schnappdeckel-Box.
- Transportieren Sie das Kästchen, um BSL2- Tieranlage. Dort angekommen, öffnen Sie die Box in der BSL2- Schrank.
2. P. aeruginosa Instillation
- Führen Überleben Chirurgie aseptisch (sterile Handschuhe, sterile InstrumenteUnd aseptischer Techniken). Verwenden Sie eine sterile Abdeckung, eine Arbeitsfläche für sterile (autoklaviert) chirurgische Instrumente bereitzustellen. Sterilisieren Instrumente mit einer Heiß Perle Sterilisator zwischen jeder Instillation Verfahren.
- Wiegen Mäusen vor Betäubung. Mäuse anästhesiert mit Ketamin (100 mg / kg), Xylazin (5 mg / kg) in 0.1 - 0.2 ml PBS intraperitoneal (ip). Bestimmung der Wirksamkeit der Betäubung durch Nichtreaktionsfähigkeit auf Zehenklemm. Verwenden Sie einen Tierarzt Salbe auf die Augen bis zur Trockene unter Narkose zu verhindern.
- Rain Mäuse auf einer chirurgischen Bord in BSL2- Schrank.
- Identifizieren Sie den Bereich für den Schnitt nach unten. Rasur dieses Gebiet und bereiten die Haut mit Wechselstrom Alkohol und Povidoniod Tupfer 3 mal.
- Behandlung der Schnittbereich mit einem Lokalanästhetikum (Lidocain), da dies der Anästhesie ist ausreichend für eine kleinere chirurgische Eingriffe, wie einen Hautschnitt, um die Luftröhre gelangen.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 5 mm) an der Mittellinie des Halses, und benutzen stumpfe forceps sanft bewegen die Muskeln für den Zugriff auf die Luftröhre. Setzen Sie die Luftröhre durch chirurgische Dissektion.
- Zeichnen Bakterienlösung in eine 1 ml Einwegspritze mit 27 G-Nadel. Für jede Maus, verabreichen 20-30 ul Bakterien bei der entsprechenden Konzentration (bis zu 10 5 CFU je Maus).
- Setzen Sie die Nadel in die Luftröhre. Injizieren Lösung langsam in den Luftröhren.
- Stellen Sie sicher, dass die Tier keucht, die normalerweise an, dass Lösung in die Lunge erreicht.
- Schließen Sie die Wunde mit sterilem Nahtmaterial (6-0 Monofilament) unter aseptischen Bedingungen.
- Verwenden Sie 0,1 mg / kg Buprenorphin durch subkutane Injektion als post-op Analgesie zu postoperativen Schmerzen zu kontrollieren.
- Stellen Sie sicher, dass die Zeit von der ersten Narkoseeinleitung erforderlichen Schließung Schnitt weniger als 15 min.
- Nach der Injektion entsorgen Spritzen und Nadeln in einem geeigneten Biohazard Behälter für scharfe Gegenstände.
- Behandeln Sie die chirurgischen Instrumente mit Chlordioxid basierend DISInfectant für 15 min, spülen und zum Labor für die Sterilisation und Wiederverwendung wie nötig.
- Haus die Mäuse einzeln in saubere Käfige bei warmen Umgebung.
- Überprüfen Sie auf dem Tier alle 30 Minuten, bis er das Bewusstsein wiedererlangt und beginnt sich zu bewegen; und später in 12 Stunden Intervallen für die ersten 3 Tage nach der Operation.
- Halten die Mäuse in der Tier BSL2 Einrichtung während des Experiments. Stellen Sie sicher, dass nur in versiegelten Kiste enthaltene Gewebe verlässt das Tier BSL2- Möglichkeiten. Wenn die Mäuse exprimieren einem der moribund Verhaltensweisen (definiert als Atemnot, Lethargie, Versagen in Reaktion auf sanfte Stimulierung ambulate) an einem Punkt in der Studie euthanize die Mäuse durch CO 2 Inhalation aus einem Flaschenquelle gefolgt durch zervikale Dislokation.
- Euthanize die Versuchspersonen durch Ausbluten unter Narkose.
- Sammeln Lungengewebe von Mäusen getötet. Führen Sie diese Verfahren in einem BSL2 Kapuze. Falls erforderlich, überweisen Sie den Proben mit verschlossenen Röhrchen in einem rac platziertk on Desinfektions beladene Papierhandtücher in einem Schnappdeckel-Box für weitere Prozess.
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Representative Results
Ab 24 bis 72 Stunden nach P. aeruginosa Injektion erhöhte Zellularität wurde in Lungenschnitten beobachtet (1A-D). Die Lunge begonnen, von 96 Stunden nach der Verletzung (1E) erholen. 7 Tage nach P. aeruginosa, normalen Alveolen Morphologie wurde weitgehend wiederhergestellt (1F). Tunnel Färbung mit Lungenabschnitte bei 24 h nach P. vorbereitet aeruginosa zeigte Zelltod in Alveolen Zellen (1G-I). Um den Reparaturprozess in diesem Verletzungsmodell zu untersuchen, wurde BrdU in Mäuse bei 3 Tage nach P. injiziert aeruginosa. Lungen wurden bei 5 h nach BrdU Injektion isoliert und für BrdU-Antikörper-Färbung verarbeitet. Wie in 1J und K gezeigt, signifikant erhöhte Anzahl von Zellen eingebaut BrdU bei 72 h nach P. aeruginosa Verabreichung, was Hyperproliferation.
Um die Änderung der Sperr pro StudieLässigkeit und Entzündungen nach Verletzungen, bronchoalveoläre Lavage (BAL) Flüssigkeit wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt veröffentlichen P. aeruginosa Injektion. Die Proteinkonzentration in BAL wurde bei 48 h nach P. deutlich erhöht aeruginosa Injektion (2A), was anzeigt, epitheliale Barriere Undichtigkeit. Die Zellzahlen in BAL ebenfalls deutlich auf 48 h nach P. aeruginosa Injektion (2B), was eine Entzündungsreaktion. Bei 4 - 5 Tage nach P. aeruginosa Injektion, sowohl die BAL-Protein-Level und die Zellzahl begonnen, was auf Wiederherstellung (2A, B) verringern. Weiterhin wurde Lungen Lysat an verschiedenen Punkten gesammelt pfosten P. aeruginosa Verwaltung und der Pegel des Makrophagen-Entzündungsprotein 2 (MIP2), einem Zytokin in Neutrophilen Anziehungs 12 beteiligt sind, wurde durch ELISA gemessen. In Übereinstimmung mit den BAL Analyseergebnisse MIP2 Ebene deutlich Increa bei 48 h nach P. sed aeruginosa Injektion und kehrte nach Grundniveau bei 96 h nach P. aeruginosa Injektion (2C). Außerdem wurden Zellen aus BAL auf Glasobjektträger fixiert und der Hämatologie-Färbung unterworfen. Ohne P. aeruginosa, gab es nur eine geringe Anzahl von Monozyten in BAL-Flüssigkeit (2D). Im Gegensatz dazu große Menge an Neutrophile wurden in BAL präsentieren isoliert auf 48 h nach P. aeruginosa Injektion (2E). Um 96 h nach P. aeruginosa-Injektion, die Zellzusammensetzung BAL kehrte an die Steuerungsebene (2F). Um zusammenzufassen, Ergebnisse in 2 angegeben akute neutrophile Entzündungsreaktion mit erhöhter Alveolen-Schranke und Erhöhung der Zytokin-Konzentrationen, die alle Merkmale des akuten Lungenversagens 13. In allen Experimenten wurde Injektion von Salzlösung als Kontrolle verwendet.
ve_content "> Ein Teil der Daten, einschließlich H und E-Färbung, BrdU-Markierung, TUNEL-Assay, BAL Analyse und MIP2 Füllstandmessung wurden bisher veröffentlichten sieben. In diesem Artikel haben wir untersucht die Rolle der FoxM1, einen Transkriptionsfaktor, bei der Reparatur von Alveolarverletzung Verwendung der hier beschriebenen 7 P. aeruginosa Lungenverletzung Modell.
Abbildung 1. Histologie, Zelltod und Proliferation in P. aeruginosa vermittelte Maus Lungenverletzung Modell. (AF) Lung Isolation, Schneiden und H / E-Färbung wurden unter Verwendung von nicht-P. aeruginosa-injiziert (Nicht-PA) Steuer Lunge (A) sowie die Lunge bei 24 Stunden (B), 48 h (C), 72 h (D), 96 Stunden (E), 7 Tage (F) Beitrag P. aeruginosa inPritz (post-PA). (GI) Lungenschnitte wurden aus Steuer Lunge (G) und 24 Stunden post P. vorbereitet aeruginosa injiziert Lunge (H, I) und fahren TUNEL-Assay, um den Zelltod zu erkennen. Lungenschnitte wurden für Lungenepithelzellen Zellmarker Sp-C (blau), T1α (rot) gefärbt, um die Morphologie zu zeigen und auch TUNEL (grün) angefärbt. Pfeile in (H) zeigen TUNEL-positiven Zellen. (J, K) BrdU wurde nicht injiziert P. aeruginosa injizierten Mäusen (J) und 72 h nach P. aeruginosa injizierten Mäusen (K) durch ip wurden die Lungen bei 5 h nach BrdU Injektion vorbereitet und für die Antikörperfärbung gegen BrdU (grüne Färbung) verarbeitet. Maßstabsbalken = 60 & mgr; m für AF, 50 & mgr; m für G und H, 20 & mgr; m für I und 100 & mgr; m für J und K. Diese Zahl wurde von Liu modifiziert worden
Abbildung 2. Alveolar-Schranke und Entzündungen nach in P. aeruginosa induzierte Lungenschädigung. (A, B) BAL wurde aus Kontroll- und P. gesammelten aeruginosa behandelten Lungen. (A) Die Proteinkonzentration in BAL erhöht bei 48 h nach P. aeruginosa Einspritzung und sank auf 96 Stunden, 5 Tage nach der P. Zellzahlen aeruginosa Injektion. (B) Gesamt in BAL erhöht bei 48 h nach P. aeruginosa Injektion (B) und umgestimmt Steuerungsebene bei 96 h nach P. aeruginosa Injektion. (C) MIP-2-Spiegel wurden uns gemessening Lungen Lysaten aus Kontrollmäusen sowie Mäusen isoliert auf 48 h und 96 h nach P. aeruginosa Injektion. Daten wurden auf Mittelwert ± SE dargestellt, n ≥ 3 (DF) aus BAL-Zellen wurden zentrifugiert und auf Glasobjektträgern befestigt und mit HEMA3 Färbung unterworfen. Eine kleine Anzahl von Monozyten wurden in BAL von Kontrollmäusen (D) vorhanden ist. Große Menge von Neutrophilen in BAL anwesend waren bei 48 h nach P. isoliert aeruginosa Injektion (E). Um 96 h nach P. aeruginosa Injektion gab es eine kleine Anzahl von Monozyten in BAL (F). Maßstabsbalken = 10 & mgr; m, sind diese Ergebnisse repräsentativ für mindestens 5 unabhängigen Experimenten. Diese Zahl wurde von Liu et al. 7 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Pseudomonas-Maus Lungenverletzung Modell, das wir beschreiben imitiert den gesamten Prozess der Entzündung, Lungenverletzung, Reparatur und Auflösung, die nach einer akuten Lungenschädigung oder Lungenentzündung auftreten. Es hat einzigartige Vorteile im Vergleich mit einigen anderen Verletzungen Modelle, dass es klinisch relevanten und relativ sicher und einfach zu handhaben.
Der kritische Schritt in dem Verfahren ist, dass die Injektion von Bakterienlösung muss sehr langsam. Wenn Einspritzung zu schnell ist, werden die Mäuse wahrscheinlich durch Drossel sterben. Nach einer erfolgreichen Injektion wurden die Mäuse zeigen in der Regel mehrere tiefe Atemzüge und Keuchen, die die Bakterien Partikel in die Lunge bekommen helfen.
Der Stamm wir früher war PA103 6. Einer der kritischen Punkte des Modells ist, dass die Titer von P. aeruginosa muss streng kontrolliert werden. Batch von P. aeruginosa aus unterschiedlichen Quell konnten verschiedene Grade von Entzündungen und Schäden, auch wenn zeigengleichzeitig CFU verwendet. Daher wird empfohlen, daß jede neue Charge von Bakterien, die für die ursächliche Wirkung (wie Entzündung, Zellproliferation, usw.) getestet werden, und passt die Anzahl der CFU verwendet werden. Wenn Inkonsistenz der Ergebnisse durch die Verwendung gekühlter Bakterien Lager auftritt, kann man frische Bestand, die von wachsenden Bakterien erhalten aus einer frischen Platte für jedes Experiment zu verwenden. Zusätzlich kann der Wachstumsphase der Bakterien und Auswahl der Medien auch einen Einfluss auf die Wirkung auf die Reaktion des Wirtes. Daher sollte darauf geachtet werden, dass bakterielle Inokulation während der gleichen Phase des bakteriellen Wachstumszyklus erfolgen.
Es kann ein Unterschied in der Antwort auf sein P. aeruginosa von verschiedenen Mäusestämmen. Der Stamm Eingesetzt wurde eine Mischung von C57BL / 6 und FVB / N. Die entsprechende P. aeruginosa-Titer sollten für verschiedene Mausstämme ermittelt werden.
Ein zu berücksichtigender Faktor für dieses Modeldaß die Beschädigung der Bakterien ist nicht auf einen Zelltyp beschränkt. Zum Beispiel Epithelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten könnten alle beschädigt wurden. Daher ist dieses Modell nicht geeignet ist, um die Wirkungen von Zelltyp-spezifischen Lungenverletzungen zu untersuchen. Die Bakterien verursachen Lungen Zelltod durch Stimulierung Entzündungsreaktionen sowie durch Sekretion von Toxinen in das Gewebe 6. Lebenden Bakterien sind in der Regel aus der Lunge innerhalb von 48 Stunden nach der Verletzung 7,14 gelöscht. Eine hohe Konzentration von toten Bakterien können auch Schäden durch Induktion von Entzündungsantworten 15.
Die Mechanismen der Lungenschädigung und Reparatur sind wahrscheinlich in Reaktion auf verschiedene Arten von Lungenverletzung, unterschiedlich zu sein. Daher ist es wichtig, mehrere Verletzungen Modellen zu vergleichen. Die P. hier beschriebenen aeruginosa-Modell ist eine schöne Ergänzung zu den anderen Modellen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine | pharmaceutical grade | ||
| 27 G needle | Fisher | 1482648 | |
| syringe | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| scissors | Fine Science tools | ||
| forceps | Fine Science tools | ||
| suture | Fisher | 19-037-526 | |
| Eye gauge, glove, gown | |||
| Biosafety Cabinet | |||
| chlorine dioxide based disinfectant | Clidox | ||
| sheep blood agar plates | Medex supply | HL-1160 |
References
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