Abstract
С целью изучения острое повреждение легких человека и пневмонию, важно разработать модели на животных, чтобы имитировать различные патологические особенности этого заболевания. Здесь мы разработали мыши легких модель травм между внутри трахеи инъекции бактерий синегнойной палочки (синегнойной или ПА). Используя эту модель, мы смогли показать, воспаление легких на ранней стадии травмы. Кроме того, ФРК барьер неплотности наблюдалось при анализе бронхоальвеолярного лаважа (BAL); и альвеолярного гибель клеток наблюдалась Тунел анализе с использованием ткани, полученной из пострадавших легких. На более позднем этапе после повреждения, мы наблюдали пролиферацию клеток, необходимое для процесса ремонта. Травма была решена 7 дней от начала P. палочки для инъекций. Эта модель имитирует последовательный курс воспаления легких, травмы и ремонта в течение пневмонии. Это клинически значимых животная модель подходит для изучения патологии, механизм ремонта, еollowing острого повреждения легких, а также может быть использована для проверки потенциальных терапевтических агентов для данного заболевания.
Introduction
Легкие подвергаются воздействию окружающей среды патогенными микроорганизмами и восприимчивы к воспалению и повреждению 1-3. В патологических условиях, таких как пневмония или взрослых респираторный дистресс-синдром (ОРДС), возбудители, а также воспалительные факторы, выпущенные лейкоцитов вызвать повреждение и гибель альвеолярных клеток 1-3. Важно развивать животные модели острого повреждения легких, чтобы облегчить изучение патологии травмы, а также механизм ремонта.
В настоящее время, большинство людей используют модели повреждения легких гипероксии и блеомицин индуцированной мыши 4. Тем не менее, механизмы гипероксии вызвало повреждение не то же самое, как наиболее распространенных травм легких, которые происходят во время пневмонии или ОРДС 5. Блеомицин индуцированной острое повреждение редко встречается в клиническом контексте 4. Здесь мы сообщаем о легких модель повреждения мыши, используя внутри трахеи инъекцию P. палочки 6,7. Эта модель является клинически значимым, и имитирует рrocesses которые происходят следующие пневмонии 8.
Как оппортунистической, внутрибольничной возбудителя ослабленным лицам, P. палочки обычно заражает легких путей, мочевыводящих путей, ожоги, раны, а также вызывает другие инфекции крови 6. Бактерии освободить фактор вирулентности экзотоксина, размножаться и вызывать иммунный ответ 6. Intra-трахеальных администрация Р. палочки отражает ситуацию в воздействии на человека в бактерии, которые вызывают пневмонию и патология, скорее всего, будет отличаться от недавно сообщалось вирус гриппа H1N1 индуцированного повреждения легких модели 9. С Р. палочка является оппортунистических патогенов, что это относительно безопасны в обращении в сравнении с некоторыми из более вирулентных возбудителей. Здесь мы использовали инъекцию внутри трахеи вводить бактерии, потому что мы наблюдали, что этот метод больше бактерий введены в дистальный альвеол области легкого по сравнению снекоторые другие процедуры, такие как с помощью катетера через рот.
По сравнению с другими острыми моделей повреждения легких, П. палочки модель описана здесь подходит для изучения повреждение легких, вызванное бактериями и чрезмерным воспаления. В отличие от других животных моделях, использующих P. палочки, чтобы вызвать сепсис 10,11, здесь мы используем внутри трахеи инъекции этих бактерий, чтобы вызвать локализованную острого повреждения легких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных были утверждены Комитетом по уходу за животными и Институциональные комитеты по биобезопасности университета Иллинойса в Чикаго.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с Pseudomonas должны быть выполнены с биологической безопасности 2-го уровня практики (BSL2), которые включают, но не ограничиваются: маски, средства защиты глаз, платье или комбинезон, и двойные перчатки. Работа в Кабинете сертифицированной биобезопасности. Лечить инструментов в контакте с бактериями с отбеливателем или диоксид хлора дезинфицирующих основе. Используйте закрытый ящик для образцов транспортных.
1. P. палочки Культура и рост
- Магазин П. палочки PA103 как бактериальная складе в винтовой крышкой криопробирку при -80 ° С.
- Поместите флакон в стойке в коробке с 70% этанола смачивается бумажных полотенец и принять к уровню биобезопасности 2 (BSL2) лаборатории.
- Подряд бактерии на чашках с агаром с овечьей кровью и расти при 37 ° С в течение ~ 15 ч в инкубаторе. В BSL2 капотом, поцарапать бактерии от пластины с бактериями петли и ресуспендируют в 5 мл PBS.
- Храните запас на 4 ° С в течение 3 месяцев. Тем не менее, определить титр каждые 2 недели.
- Серийно разбавить бактерий в PBS (обычно от 1:10 до 1:10 4 7) и пластины из известного разбавление на чашках с агаром овечьей крови.
- Инкубируйте пластин для ~ 15 часов. Граф колонии и рассчитать колониеобразующие единицы (КОЕ), чтобы определить концентрацию бактерий.
- Ресуспендируйте соответствующие концентрации (~ 5 · 10 3 КОЕ / мл) в 0,5 мл PBS в 1,5 мл стерильные криопробирки винтовой крышкой. Уплотните криопробирки и поместите их в криопробирку стойку на дезинфицирующих груженых бумажных полотенец в оснастке крышки коробки.
- Транспорт коробку к BSL2 животных объекте. Когда-то, открыть окно в BSL2 кабинета.
2. P. палочки Инстилляции
- Выполните хирургии выживание в асептических условиях (стерильные перчатки, стерильные инструментыи асептических методов). Используйте стерильную салфетку, чтобы обеспечить рабочую поверхность для стерильных (автоклавного) хирургических инструментов. Стерилизовать инструментов, используя горячий шарик стерилизатор между каждой процедуры трахеи закапывания.
- Взвесьте мышей до обезболивания. Обезболить мышей с кетамина (100 мг / кг), ксилазина (5 мг / кг), в 0,1 - 0,2 мл PBS внутрибрюшинно (IP). Определить эффективность анестезии при не-реагирование на носок щепотку. Используйте ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
- Задержите мышей на хирургическом борту в BSL2 кабинета.
- Определить место для разреза вниз. Бритье эту область и подготовить кожу с помощью переменного алкоголя и йодповидон тампоны 3 раза.
- Лечить разрез зона с местной анестезией (лидокаин), как это анестезия является достаточным для незначительного хирургического вмешательства, таких как разрез кожи, чтобы получить доступ в трахею.
- Сделайте небольшой надрез (примерно 5 мм) в средней линии шеи, и использовать тупой пorceps мягко двигаться мышцы для доступа к трахее. Expose трахею по хирургической диссекции.
- Нарисуйте бактерий раствор в 1 мл одноразовый шприц с 27 G иглы. Для каждой мыши, управлять 20-30 мкл бактерий в соответствующей концентрации (до 10 5 КОЕ каждого мыши).
- Вставьте иглу в трахею. Внедрить решение медленно в трахеи.
- Убедитесь, что задыхается животных, которые, как правило, означает, что решение достигло в легких.
- Закройте рану стерильным швов (6-0 мононити) в асептических условиях.
- Использование 0,1 мг / кг бупренорфина путем подкожной инъекции в качестве послеоперационной аналгезии, чтобы контролировать пост-хирургической боли.
- Убедитесь, что время, необходимое от начальной индукции анестезии в разрез закрытие составляет менее 15 мин.
- После инъекции, распоряжаться шприцев и игл в соответствующем биологической контейнер для острых предметов.
- Лечить хирургических инструментов с основанной диоксид хлора DISInfectant в течение 15 мин, промыть и вернуться в лабораторию для стерилизации и повторно по мере необходимости.
- Дом мышей по отдельности в чистых клетках в теплом помещении.
- Проверьте на животных каждые 30 минут, пока она не приходит в сознание и начинает двигаться; а затем в 12 интервалах ч в течение первых 3 дней после операции.
- Держите мышей в животное BSL2 объекте в течение всего эксперимента. Убедитесь, что только ткань, содержащаяся в запечатанной коробке оставляет животное BSL2 центр. Если мыши экспрессируют любой из умирающих поведения (определена как респираторный дистресс-синдром, вялость, неспособность передвигаться в ответ на нежной стимуляции) в любой точке в исследовании, эвтаназии мышей путем ингаляции СО 2 из источника в бутылках с последующим смещением шейных позвонков.
- Усыпить экспериментальный предмет обескровливанием под наркозом.
- Соберите ткань легкого от эвтаназии мышей. Провести эти процедуры в BSL2 капотом. При необходимости, перенести образец в запаянных пробирках, помещенных в рацК о дезинфицирующих груженых бумажных полотенец в крышке коробки оснастки для дальнейшего процесса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Начиная с 24 - 72 часов после П. палочки для инъекций, увеличилась клеточности наблюдалось в срезах легких (1А-D). Легких начала восстанавливаться от 96 ч после травмы (рис 1E). На 7 дней после P. палочки, нормально альвеолы морфология была в значительной степени восстановлен (рис 1F). Окрашивание Tunnel разделы с помощью легких подготовлен на 24 ч сообщению П. палочки показали гибель клеток в альвеолах клеток (рис 1G-I). С целью изучения процесса в этой модели повреждения ремонта, BrdU вводили мышам в 3 дня после P. палочки. Легкие были изолированы на 5 ч после инъекции BrdU и обработаны для окрашивания BrdU антителами. Как показано на рисунке 1J и К, значительно увеличилось число клеток, включенных BrdU при 72 ч после P. Администрация палочки с указанием гиперпролиферацию.
Для изучения изменений в барьер напроницаемости и воспаление после травмы, бронхоальвеолярного лаважа (BAL) жидкость собирали в различные моменты времени после P. палочки для инъекций. Концентрацию белка в BAL была значительно увеличена на 48 ч после P. палочки для инъекций (2А), что указывает на эпителиальный барьер неплотности. Цифры клеток в БАЛ также значительно увеличился в 48 ч сообщению П. палочки для инъекций (2В), что указывает на воспалительную реакцию. На 4 - 5 дней почтовых P. палочки для инъекций, и уровень белка BAL и число клеток начала снижаться с предложением восстановление (Фигура 2А, В). Кроме того, легких лизат был собран в различных точках напишите P. Администрация палочки и уровень белка макрофагов воспалительное 2 (MIP2), цитокин, участвующий в привлечении нейтрофилов 12, измеряли с помощью ELISA. В соответствии с результатами анализа БАЛ, уровень MIP2 значительно increa СЭД на 48 ч сообщению П. палочки для инъекций и вернулся в базального уровня в 96 ч сообщению П. палочки для инъекций (рис 2С). Кроме того, клетки БАЛ были зафиксированы на стеклах и подвергали окрашиванию гематологии. Без P. палочки, появились лишь небольшое число моноцитов в БАЛ (рис 2D). В отличие от этого, большое количество нейтрофилов присутствовали в BAL изолированы на 48 ч после P. палочки для инъекций (рис 2Е). К 96 ч сообщению П. палочки для инъекций, клеточный состав БАЛ вернулся на уровень управления (рис 2F). Подводя итог, приводит рисунке 2 показано острый нейтрофильный воспалительную реакцию вместе с увеличением альвеол барьера проницаемости и увеличение концентрации цитокинов, которые все признаки острого повреждения легких 13. Во всех экспериментах, это инъекции физиологического раствора использовали в качестве контроля.
ve_content "> Часть данных, в том числе H и E окраски, BrdU маркировки, TUNEL анализа, анализа БАЛ и измерения уровня MIP2, были ранее опубликованы 7. В этой статье мы исследовали роль FoxM1, транскрипционный фактор, в ремонте альвеолярного повреждения, используя модель повреждения легких синегнойной описанный здесь 7.
Рисунок 1. Гистология, гибель клеток и пролиферации в P. палочки опосредованной мышь модель повреждения легких. Изоляция (AF) легких, секционирования и H / E окрашивание проводили с использованием не-П. палочки впрыском (не PA) контроля легкие (A), а также легкие в 24 часов (В), 48 ч (C), 72 ч (D), 96 ч (E), 7 дней (F) после П. палочки впроекция (пост-PA). (GI) секции легких были получены из контрольных легких (G) и 24 часов пост P. палочки вводят легкие (H, I) и перейдите на TUNEL анализа для обнаружения гибели клеток. Разделы легких окрашивали для легких эпителиальных клеток маркера SP-C (синий), T1α (красный), чтобы показать, морфологию, а также окрашивают в течение TUNEL (зеленый). Стрелки в (H) указывают TUNEL-положительных клеток. (J, K) вводили BrdU в не-P. палочки вводят мышам (J) и 72 ч после P. палочки вводят мышам (K) по ф, легкие были подготовлены на 5 ч после инъекции BrdU и обрабатываются для окрашивания антител против BrdU (зеленый окрашивание). Шкала бар = 60 мкм для АФ, 50 мкм для G и H, 20 мкм для I и 100 мкм для J и K. Эта цифра была изменена с Лю
Рисунок 2. альвеолярного проницаемость барьера и воспаление следующее P. палочки индуцированного повреждения легких. (А, В) BAL были собраны от контроля и P. палочки лечение легких. (А) Концентрация белка в БАЛ увеличена на 48 ч сообщению П. палочки впрыска и снижение на 96 часов, 5 дней после P. палочка впрыска. (B) Всего число клеток в БАЛ увеличена на 48 ч сообщению П. палочки для инъекций (B) и настраивали уровень управления в 96 ч сообщению П. палочки для инъекций. (C) MIP-2 были измерены уровни насING лизаты легких, выделенные из контрольных мышей, а также мышей на 48 часов и 96 часов после П. палочки для инъекций. Данные были представлены на среднее ± SE, п ≥ 3. (DF) Клетки БАЛ центрифугировали и фиксируется на стеклах и подвергали окрашиванию HEMA3. Небольшое количество моноцитов присутствовали в БАЛ контрольных мышей (D). Большое количество нейтрофилов присутствовали в БАЛ изолированы на 48 ч сообщению П. палочки для инъекций (Е). К 96 ч сообщению П. палочки для инъекций, было небольшое количество моноцитов в BAL (F). Шкала бар = 10 мкм, эти результаты являются репрезентативными по меньшей мере 5 независимых экспериментов. Эта цифра была изменена с Лю и др. 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pseudomonas мыши легких модель травмы, которые мы описываем здесь имитирует весь процесс воспаления, повреждения легких, ремонта и разрешением, которые происходят после острого повреждения легких или пневмония. Она имеет уникальные преимущества по сравнению с рядом других моделей от травм в том, что он является клинически значимым и относительно безопасный и простой в обращении.
Критическим этапом процедуры является то, что инъекции бактерий раствора должен быть очень медленным. Если инъекция слишком быстро, мыши, скорее всего, умрет от дросселя. После успешной инъекции мышей обычно показывают несколько глубоких вдохов и ахнула, которые помогут бактерии частицы попадают в легкие.
Штамм мы использовали, был PA103 6. Одним из критических точек этой модели является то, что титр P. палочки должны быть под жестким контролем. Пакетное P. палочки из другого источника может показать различные степени воспаления и повреждения даже когдаиспользоваться в то же КОЕ. Поэтому, рекомендуется, чтобы каждый новый пакетный бактерий быть проверены на их причинных эффектов (таких как воспаление, клеточную пролиферацию и т.д.), и, соответственно, регулировать количество КОЕ, которые будут использоваться. Если несоответствие результатов происходит с помощью охлажденных бактерий запас, можно использовать свежий запас полученный растущих бактерий из свежего пластины для каждого эксперимента. Кроме того, фаза роста бактерий и выбора средств массовой информации может также оказывать влияние на эффект на хост-ответ. Таким образом, следует позаботиться, чтобы убедиться, что бактериальные посевы происходят во время одной и той же фазе бактериальной цикла роста.
Там может быть разница в ответ на P. палочки различными штаммами мышей. Штамм мы использовали смесь из C57BL / 6 и FvB / N. Соответствующий П. Титр палочки должны быть определены для различных штаммов мышей.
Одним из факторов, чтобы рассмотреть для этой модели являетсячто ущерб от бактерий не ограничивается одним типом клеток. Например, эпителиальные, эндотелиальные, фибробласты, возможно, все было повреждено. Таким образом, эта модель не подходит для изучения последствий камерного типа травм конкретных легких. Бактерии вызывают гибель клеток легких, стимулируя воспалительные реакции, а также за счет секреции токсинов в ткани 6. Живые бактерии, как правило, удалены из легких в 48 ч после травмы 7,14. Высокая концентрация мертвых бактерий также могут вызвать повреждение, вызывая воспалительные реакции 15.
Механизмы повреждения и восстановления легких, вероятно, будут отличаться в ответ на различные виды повреждения легких. Таким образом, важно, чтобы сравнить несколько моделей травматизма. П. палочки модель описана здесь является хорошим дополнением к другим моделям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: Ketamin, xylazine, lidocaine, buprenorphine | pharmaceutical grade | ||
| 27 G needle | Fisher | 1482648 | |
| syringe | Fisher | 14823434 | 1 ml |
| scissors | Fine Science tools | ||
| forceps | Fine Science tools | ||
| suture | Fisher | 19-037-526 | |
| Eye gauge, glove, gown | |||
| Biosafety Cabinet | |||
| chlorine dioxide based disinfectant | Clidox | ||
| sheep blood agar plates | Medex supply | HL-1160 |
References
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. N Engl J Med. 342, 1334-1349 (2000).
- Matthay, M. A., Ware, L. B., Zimmerman, G. A. The acute respiratory distress syndrome. J Clin Invest. 122, 2731-2740 (2012).
- Shimabukuro, D. W., Sawa, T., Gropper, M. A. Injury and repair in lung and airways. Crit Care Med. 31 (8), 524-531 (2003).
- Wansleeben, C., Barkauskas, C. E., Rock, J. R., Hogan, B. L. Stem cells of the adult lung: Their development and role in homeostasis, regeneration, and disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 131-148 (2013).
- Singleton, P. A., et al. Dynamin 2 and c-abl are novel regulators of hyperoxia-mediated nadph oxidase activation and reactive oxygen species production in caveolin-enriched microdomains of the endothelium. J Biol Chem. 284, 34964-34975 (2009).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J. W., Prince, A. S. Pathogen-host interactions in pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1209-1223 (2005).
- Liu, Y., et al. Foxm1 mediates the progenitor function of type ii epithelial cells in repairing alveolar injury induced by pseudomonas aeruginosa. J Exp Med. 208, 1473-1484 (2011).
- Kurahashi, K., et al. Pathogenesis of septic shock in pseudomonas aeruginosa pneumonia. J Clin Invest. 104, 743-750 (1999).
- Kumar, P. A., et al. Distal airway stem cells yield alveoli in vitro and during lung regeneration following h1n1 influenza infection. Cell. 147, 525-538 (2011).
- Delano, M. J., et al. Sepsis induces early alterations in innate immunity that impact mortality to secondary infection. J Immunology. 186, 195-202 (2011).
- Lange, M., et al. A murine model of sepsis following smoke inhalation injury. Biochem Biophys Res Commun. 391 (3), 1555-1560 (2010).
- Kobayashi, Y. The role of chemokines in neutrophil biology. Front Biosci. 13, 2400-2407 (2008).
- Matute-Bello, G., et al. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L379-L399 (2008).
- Sadikot, R. T., et al. Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa. J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).
- Pinto, I. L., et al. Development of an experimental model of neutrophilic pulmonary response induction in mice. J Pneumologia. 29, 213-214 (2003).
