Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية

Published: January 12, 2015 doi: 10.3791/52047
Automatic Translation
1, 2, 1
1Cardiac Surgery, University of Michigan, 2Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Introduction

لا تزال أمراض القلب السبب الرئيسي في العالم اليوم، وظلت معدلات الوفاة دون تغيير تقريبا في العقدين الماضيين (جمعية القلب الأمريكية). وهناك حاجة ماسة لوضع استراتيجيات علاجية جديدة لمنع بشكل فعال أو عكس فشل القلب. واحد استراتيجية واعدة هي العلاج القائم على الخلايا بعد التطور السريع للخلايا الجذعية علم الأحياء 1. وفي هذا الصدد، يمكن أن تكلفة النقرة متعددة القدرات تكون مصدرا ممتازا للخلية العلاج نظرا لقدرتها على التكاثر ولكن ملتزمة فقط إلى القلب النسب التمايز. لذلك، طريقة فعالة وقوية لتوليد وعزل تكلفة النقرة هو من أهمية كبيرة للدراسات العلاج بالخلايا القلب.

يركز هذا البروتوكول على تكلفة النقرة الجنينية التي تم تحديدها خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر وكيفية توليدها من المجالس الاقتصادية والاجتماعية. تم عزلها تكلفة النقرة مختلفة من قلوب الجنينية والكبار، حتى من الكوسا العظام 2. أثناء تطور الجنين، morphoge العظامالبروتينات المغنطيسية (أفضل الممارسات الإدارية)، من نوع مجنح أفراد الأسرة الموقع التكامل MMTV (Wnts) وإشارات العقدية لحث التزام Mesp1 + الأديم المتوسط ​​متعددة القدرات 3. Mesp1 + خلايا ثم تفرق في تكلفة النقرة الجنينية 4. وعادة ما يتم وضع علامة هذه تكلفة النقرة التي كتبها HCN4، NK2 علبة مثلية 5 (Nkx2-5)، Isl لLIM علبة مثلية 1 (Isl1)، T-مربع 5 (Tbx5)، والعضلية عامل محسن 2C (Mef2c)، تشكل الحقول القلب الابتدائية والثانية، و المساهمة في أجزاء كبيرة من القلب أثناء تخلق القلب 5-10. كلا Nkx2-5 + وIsl1 + / Mef2c + تكلفة النقرة قادرة على التمايز إلى العضلية، والخلايا العضلات الملساء (SMCS)، والخلايا البطانية 5-8. وبالتالي هذه تكلفة النقرة سوف تؤدي إلى الأوعية الدموية في القلب وكذلك أنسجة القلب وهم مصدر خلية مثالية لعلاج القلب خلية القاعدة. ونتيجة لذلك، كان توليد تكلفة النقرة في المختبر وتركيز البحث رئيسيا في الدراسات القلب والأوعية الدموية. منذ المجالس الاقتصادية والاجتماعية لها التوسع غير المحدود قدرةالثانية تمثل الخلايا ICM في مرحلة الكيسة الأريمية، ويعتبر التفريق بين المجالس الاقتصادية والاجتماعية في تكلفة النقرة الجنينية بعد مرحلة التطور الجنيني الطبيعي نهج منطقي وفعال للحصول على تكلفة النقرة.

نهج واحد التطبيقية على نطاق واسع للحصول على تكلفة النقرة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية هو تجميع المجالس الاقتصادية والاجتماعية في EBS 11. لتحسين كفاءة التفريق، وقد استخدمت العوامل الكيميائية ونمو محددة على أساس المعرفة للتنمية القلب 12-14. ومع ذلك، لا توجد علامات جنة البرنامج والتنسيق نهائية، لا سيما لا علامات على سطح الخلية، والتي تحظى بقبول واسع في هذا المجال. لمعالجة هذه المسألة، صممت المجالس الاقتصادية والاجتماعية للاحتفال Isl1 + أو Mef2c + تكلفة النقرة ومشتقاتها مع الصحفيين الفلورسنت باستخدام نظام لجنة المساواة العرقية / loxP. وطرقت recombinase لجنة المساواة العرقية في تحت سيطرة Isl1 / Mef2c المروج / محسن. تعديل RFP بروتين فلوري أو YFP الجين يقودها المروج التأسيسي يمكن تفعيلها من خلال استئصال توقف flox كودون مع لجنة المساواة العرقية recombinase(ISL1: لجنة المساواة العرقية، pCAG-flox وقفة وflox-GFP أو طلب تقديم العروض / Isl1-لجنة المساواة العرقية، Rosa26YFP / Mef2c-لجنة المساواة العرقية، Rosa26YFP) 5،6. وحالما يتم التفريق بين المجالس الاقتصادية والاجتماعية في تكلفة النقرة الحقل القلب الثانية، سوف Isl1 / Mef2c المروج / محسن لجنة المساواة العرقية مدفوعة تفعيل صحفيين الفلورسنت وتكلفة النقرة يمكن تغنى FACS تنقية. لفترة وجيزة، يتم استخدام EB طريقة التجميع لبدء ESC التمايز. لتعزيز كفاءة التمايز، ويتم التعامل مع الخلايا المتمايزة مع حمض الاسكوربيك (AA) وعوامل النمو مثل BMP4، Activin ألف وVEGF 13،15. هذا البروتوكول يسمح قوية وذات كفاءة التفريق CPC باستخدام كل من الفأر والمجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. اشتقاق الفأر الجنينية تكلفة النقرة من ماوس المجالس الاقتصادية والاجتماعية

  1. إعداد الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) طبقة المغذية.
    1. دافئ المتوسطة MEF (10٪ FBS في DMEM) إلى 37 درجة مئوية.
    2. إعداد الجيلاتين المغلفة لوحات.
      1. إضافة 1 مل من 0.1٪ الجيلاتين في الماء في بئر من لوحة 6 جيدا أو 5 مل في صحن 10 سم.
      2. ترك لوحات أو أطباق في 37 ° C أو درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. نطمح الجيلاتين قبل استخدامها.
    3. ذوبان الجليد المشع MEFS بسرعة في حمام مائي 37 ° C، مع الهز لطيف.
    4. نقل الخلايا برفق إلى 15 مل أو 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 5 مل من قبل تحسنت المتوسطة MEF. دوامة الخلايا ببطء وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
    5. الخلايا resuspend في المتوسط ​​MEF وعدد خلايا قابلة للحياة. استخدام وحدات التخزين التالية من MEF المتوسطة: 2 مل لخلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا و10 مل للخلايا من طبق 10 سم.
    6. لوحة الخلايا إلى 6 لوحات جيدا أو 10 سم في أطباق 1-2× 10 6 في لوحة / طبق.
    7. احتضان لوحات MEF / أطباق عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لا يقل عن 24 ساعة قبل استخدامها.
      ملاحظة: تجاهل لوحات MEF / أطباق القديمة من أسبوع.
  2. إعداد المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس
    1. ثقافة Isl1-لجنة المساواة العرقية. Rosa26YFP / Mef2c-لجنة المساواة العرقية. Rosa26YFP الماوس المجالس الاقتصادية والاجتماعية على MEFS حتى 90٪ متموجة. استخدام ES المتوسطة الخلية تتكون من 410 مل DMEM، 75 مل FBS، 0.1 ملي MEM NEAA، 2 مم L-الجلوتامين، 0.1 ملي البيروفات، و 100 U القلم / بكتيريا، و 0.1 ملم β المركابتويثانول.
    2. إعداد الجيلاتين المغلفة 6 لوحات جيدا كما هو موضح في 1.1.2.
    3. نضح المتوسطة من لوحات وشطف الخلايا مع DPBS.
      1. نضح DPBS وإضافة 0.4 مل 0.25٪ التربسين في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق. إضافة 1 مل قبل تحسنت المتوسطة ES لوقف رد الفعل التربسين.
    4. حصاد الخلايا والخلايا الطرد المركزي في 200 x ج ونضح المتوسطة. Resuspend الخلايا في 1 مل المتوسطة خلية ES وعدد الخلايا. </ لى>
    5. المجالس الاقتصادية والاجتماعية لوحة على لوحات الجيلاتين المغلفة في كثافة 3 × 10 4 / سم 2. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 2 أيام عندما تصل المجالس الاقتصادية والاجتماعية حوالي 90٪ متموجة. تغيير المتوسطة كل يوم.
    6. عندما المجالس الاقتصادية والاجتماعية هي 90٪ متموجة، كرر الخطوات من 1.2.2-1.2.5 تماما لإزالة مغذيات MEF.
  3. حمل حزب الشيوعى الصينى التمايز عن طريق تشكيل EB
    1. إعداد التمايز المتوسطة على النحو التالي: 36 مل IMDM، 12 مل F12 هام، و2 مم L-الجلوتامين، 0.34 مل BSA (7.5٪)، 0.25 مل N2، 0.5 مل B27، 50 ميكروغرام / مل AA، و 0.45 مم 1-thioglycerol.
    2. نضح المتوسطة من الخلايا وشطف مع DPBS. نضح DPBS وإضافة 0.4 مل 0.25٪ التربسين في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. إضافة 1 مل التمايز المتوسطة إلى الكف عن رد فعل وماصة صعودا وهبوطا لتفريق مجموعات الخلايا إلى خلايا واحدة.
    4. الطرد المركزي المجالس الاقتصادية والاجتماعية في 200 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل المتوسطة.
      1. في resuspend 1 × 10 6 </ سوب> المجالس الاقتصادية والاجتماعية في 1 مل التمايز المتوسطة. عدد الخلايا، والثقافة الخلايا في انخفاض مفرزة طبق بتري في تركيز 1 × 10 5 خلية / مل في التمايز المتوسطة عند 37 درجة مئوية لمدة الأول EB التجميع.
    5. بعد يومين من تشكيل EB، ونقل EBS من الأطباق إلى 50 مل أنابيب. تدور في 200 x ج لمدة 1 دقيقة. إزالة المتوسطة وشطف EBS مع 10 مل DPBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+.
    6. نضح DPBS وإضافة 1 مل 0.25٪ التربسين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 4.5 مل التمايز المتوسطة لوقف التفاعل. الماصة صعودا وهبوطا لفصل EBS إلى خلايا واحدة.
    7. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. خلايا المتوسطة و resuspend نضح في 1 مل التمايز المتوسطة.
    8. عدد الخلايا، وتمييع 2 × 10 6 خلايا إلى 1 × 10 5 خلية / مل في التمايز المتوسطة. إضافة VEGF، BMP4 وActivin ألف من المتوسط ​​في تركيز النهائي من 5 نانوغرام / مل، 0.8 نانوغرام / مل، و 5 نانوغرام / مل على التوالي. Cultuإعادة الخلايا في طبق بتري لتشكيل EB الثاني عند 37 درجة مئوية.
    9. 40 ساعة بعد تشكيل EB الثاني، ونقل EBS إلى 50 مل أنابيب. شطف مع DPBS مرة واحدة، فصل EBS مع 1 مل 0.25٪ التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الماصة صعودا وهبوطا لفصل EBS إلى خلايا واحدة.
    10. resuspend الخلايا في Stempro-34 متوسطة مع 5 نانوغرام / مل VEGF، 10 نانوغرام / مل bFGF و 12.5 نانوغرام / مل FGF10. لوحة الخلايا في 2 × 10 5 / سم 2 في لوحات الجيلاتين المغلفة. الثقافة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 32 ساعة قبل CPC العزلة.
  4. عزل mCPCs
    1. نضح المتوسطة وشطف مع DPBS. إضافة 0.5 مل 0.25٪ التربسين لوحات الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 4.5 مل التمايز المتوسطة لوقف التفاعل. الماصة صعودا وهبوطا لفصل EBS إلى خلايا واحدة. جمع الخلايا عن طريق خلايا الطرد المركزي و resuspend في 2٪ FBS / PBS لFACS تنقية.
    2. تشغيل المجالس الاقتصادية والاجتماعية غير متمايزة على فارز كما سيطرة سلبية. تغيير الجهد لضبط الموسيقي إلى الأمامثالثا (FSC) والتشرذم الجانب (SSC) لتحديد السكان المطلوب. استخدام الأمام مبعثر مقابل مبعثر الجانب وارتفاع مبعثر الأمام مقابل عرض لاستبعاد الحطام وصدرة. في اختيار من الفئات السكانية الفرعية، وفقا لتوزيع الضوابط ESC، رسم بوابة YFP إيجابية على الرسم البياني للقضاء على تألق ذاتي الخلية. جمع YFP + تكلفة النقرة من YFP + النابضة.
    3. لوحة لتكلفة النقرة المنقى (خلايا YFP +) في 6 لوحات جيدا مع التمايز المتوسطة (1.3.1). ثقافة 3-5 أيام إضافية عند 37 درجة مئوية لمدة التفريق بين تكلفة النقرة في العضلية وSMCS.

2. اشتقاق الإنسان الجنينية تكلفة النقرة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية البشرية

  1. إعداد مغذيات
    1. إعداد الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) طبقة المغذية على النحو المبين أعلاه في كثافة 2 × 10 4 / سم 2.
  2. الحفاظ على المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان
    1. الحفاظ على ISL1 البشري: لجنة المساواة العرقية، pCAG-flox وقفة وflox-GFP أو طلب تقديم العروض المجالس الاقتصادية والاجتماعية بشكل روتيني على MEF باستخدام المتوسطة HESC منتظم (خروج المغلوب DMEM / F-12 385 مل، 100 مل ريال خروج المغلوب، 2 مم L-الجلوتامين، 0.1 ملي NEAA، 0.1 ملم β المركابتويثانول، 10 نانوغرام / مل FGF الأساسي). قبل التمايز القلب، ونقل المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان في حالة حرة المغذية لا يقل عن 2 الممرات.
  3. إعداد المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان في حالة التغذية المجانية
    1. إعداد لوحات المغلفة للثقافة المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان.
      1. ذوبان الجليد matrigel في 4 درجات مئوية خلال الليل. وضع أنبوب 50 مل على الجليد وإضافة 30 مل الباردة DMEM / F12 المتوسط ​​في أنبوب.
      2. إضافة 1 مل matrigel في المتوسط ​​البارد وتخلط جيدا. إضافة 1 مل البارد matrigel-DMEM / 12 المتوسطة في بئر من لوحة 6 جيدا أو 5 مل في صحن 10 سم.
      3. ترك لوحات / أطباق في 4 درجات مئوية خلال الليل أو درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. نضح المتوسطة قبل استخدامها.
    2. تقسيم المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان على لوحات: وسائل الإعلام نضح من لوحة MEF وشطف المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان مع DPBS. ثم يضاف 1 مل dispase (1 ملغ / مل) إلى بئر من لوحة 6 جيدا. احتضان خلايا في 37 ° Cحاضنة حتى حواف المستعمرات بداية لفصل.
    3. إزالة حل dispase. شطف مع DPBS مرتين، ثم يضاف 2.5 مل / في المتوسط ​​mTeSR جيدا أو المتوسطة MEF مكيفة إلى اللوحة.
    4. تتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة الخلية وبعناية الماصة صعودا وهبوطا لكسر المستعمرات ESC الإنسان في كتل صغيرة.
    5. نقل كتل ESC وتمييع 1: 3 في لوحات المغلفة.
    6. إضافة 2 مل / جيد المتوسطة mTeSR أو المتوسطة MEF مكيفة وتغيير المتوسطة يوميا.
    7. ثقافة المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان في mTeSR المتوسطة أو المتوسطة MEF مكيفة على لوحات المغلفة لا يقل عن 2 الممرات.
  4. حمل حزب الشيوعى الصينى التمايز من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان
    1. عندما تكون الخلايا ~ 90٪ متموجة، نضح المتوسطة وشطف مع DPBS. ثم احتضان hESCs في 0.5 ملغ / مل Dispase عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    2. شطف hESCs مع DPBS مرتين، وإزالة الخلايا من لوحات مع رافع الخلية، resuspend ثم المشابك خلية في التمايز المتوسطة (DMEM / F12 تحتوي على 18٪ FBS، 0.1 ملي NEAA، 2 ممL-الجلوتامين، 0.1 ملم β المركابتويثانول و 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك).
    3. نقل الخلايا في 6 جيدا لوحات مرفق منخفضة للغاية لتشكيل EB.
    4. تغيير التمايز المتوسطة اليوم التالي.
    5. استبدال المتوسط ​​كل 3 أيام، والحفاظ على EBS في الثقافة تعليق.
  5. عزل HCPCS
    1. جمع EBS في موعد أقصاه يوم 9 من التمايز لعزل حزب الشيوعى الصينى الإنسان.
    2. نضح المتوسطة وشطف EBS مع DPBS مرتين. إضافة 0.5 مل 0.25٪ التربسين إلى كل بئر من لوحات ثقافة 6 جيدا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. إضافة حجم مساو من التمايز المتوسطة لوقف التفاعل. الماصة صعودا وهبوطا لفصل EBS إلى خلايا واحدة. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend الخلايا في 2٪ FBS / DPBS. تصفية الخلايا مع 40 ميكرومتر مصفاة الخلية وFACS تنقيته-طلب تقديم العروض + خلايا CPC كما وصفها في 1.4.3.
    4. لوحة فرز HCPCS على لوحات المغلفة geltin. HCPCS الثقافة في التمايز المتوسطة لمدة 7-9 أيام على التمايز إلى خلايا cardiomyocyte والعضلات الملساء. بعد 7 أيام والطلاء، والثقافة الخلايا مع 5٪ خروج المغلوب ريال في DMEM / F12 المتوسطة المتفاوتة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين بروتوكول اشتقاق تكلفة النقرة من عدة خطوط الخلايا ES. يتم تجميع المجالس الاقتصادية والاجتماعية لتشكيل EBS على التمايز إلى تكلفة النقرة. يتم الاحتفاظ المجالس الاقتصادية والاجتماعية بشكل روتيني على مغذيات MEF (الشكل 1A، F) وتتم إزالة مغذيات قبل التمايز. على تجميع المجالس الاقتصادية والاجتماعية في EBS في التمايز المتوسطة (الشكل 1B، G)، تعامل EBS شكلت الثانية مع BMP4 وActivin A لتعزيز تمايز الأديم المتوسط ​​في خطوط الخلايا الماوس (الشكل 1C). يتم التمييز المجالس الاقتصادية والاجتماعية في النسب القلب كما حددها بروتين الفلورسنت YFP / RFP (1D الشكل). كانت تكلفة النقرة FACS-طهروا (الشكل 1H) وزيادة مثقف على التمايز إلى العضلية وخلايا العضلات الملساء. أظهر تلطيخ cTnT وSM-MHC قدرة التفريق بين تكلفة النقرة في العضلية وخلايا العضلات الملساء (Figure1 E، I، J). عادة، يتم الحصول على 80-90٪ من تكلفة النقرة الماوس ESC التمايز بروتويتم الحصول على ocol و0،5-5٪ من تكلفة النقرة بروتوكول التمايز ESC البشري.

الشكل (1)
الشكل 1: تمايز المجالس الاقتصادية والاجتماعية في تكلفة النقرة متعددة القدرات. (AE) الماوس ESC التمايز. (A) مورفولوجيا من الماوس ESC في الخلايا المغذية. (ب) تشكيل أول EB من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس. (C) تشكيل EB الثانية في التمايز المتوسطة مع عوامل النمو. (D) تكلفة النقرة يعبرون عن YFP. (E) العضلية (cTnT +) المستمدة من تكلفة النقرة FACS-المنقى. (FJ) تمايز المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان. (F) مورفولوجية ESC البشري الحفاظ على الخلايا المغذية. (G) EB تكوين خلايا ES الإنسان. (H) FACS-تنقيته من تكلفة النقرة. (IJ) تكلفة النقرة متباينة في العضلية (cTnT +) وخلايا العضلات الملساء (SM-MHC + الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FBS Thermo scentific SH30070.03E
Knockout SR Life technology 10828028
Knockout DMEM Life technology 10829018
DMEM Life technology 11965118
NEAA Life technology 11140050
GlutaMAX Life technology 35050061
N2 Life technology 17502048
B27 Life technology 12587010
Ham’s F12 Life technology 11765062
IMDM Life technology 12440061
Pen/Strep Life technology 15140122
Pyruvate Life technology 11360070
Dispase Life technology 17105041
Stempro-34 Life technology 10639011
DMEM/F12 Life technology 11330032
BSA  Life technology 15260037
Trypsin  Life technology 25200056
Ascobic Acid  Sigma A5960
1-Thioglycerol Sigma M1753
2-Mercaptoethanol Sigma M3148
VEGF R&D 293-VE
Bmp4 R&D 314-BP
ActivinA R&D 338-AC
bFgf R&D 233-FB
Fgf10 R&D 345-FG
mTeSR Stemcell technologies 5850
Matrigel BD Biosciences 354277

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
  2. Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).
  3. Bondue, A., Blanpain, C. Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment. Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).
  4. Bondue, A., et al. Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification. Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).
  5. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
  6. Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development. The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).
  7. Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).
  8. Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
  9. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
  10. Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).
  11. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
  12. Wada, R., et al. Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).
  13. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  14. Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).
  15. Wamstad, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151 (1), 206-220 (2012).
  16. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  17. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  18. Gaj, T., Gersbach, C. S. 3rd, Barbas, T. A. L. E. N. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  19. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  20. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  21. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  22. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  23. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
  24. Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).
  25. Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).
  26. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).
  27. Bizy, A., et al. Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes. Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 95، الخلايا الجذعية الجنينية، والهيئات مضغي الشكل، الخلايا الاصلية القلب، والتمايز القلب، FACS الفرز، مراسل الفلورسنت

Erratum

Formal Correction: Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 08/10/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

The following author is now listed as a co-corresponding author:

Lei Bu

اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lei, I. L., Bu, L., Wang, Z.… More

Lei, I. L., Bu, L., Wang, Z. Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (95), e52047, doi:10.3791/52047 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter