Summary
破骨细胞是体内的主要骨吸收细胞。一个分离的破骨细胞中大量的能力已经导致破骨细胞生物学的理解显著进步。在这个协议中，我们描述了一种用于分离，培养和定量破骨细胞的体外活性。
Abstract
破骨细胞是从骨髓中的单核细胞/巨噬细胞系衍生的高度特化的细胞。其重吸收两者的有机和无机骨基质的独特能力意味着它们在调节骨骼重塑中发挥关键作用。在一起，成骨细胞和破骨细胞是负责动态耦合的过程，涉及既骨吸收和骨形成的共同行动，以维持健康和疾病过程中的正常骨架。
如在体内主要骨吸收细胞，改变破骨细胞的分化或功能可能导致在体内产生深远的影响。具有改变破骨细胞功能有关的疾病的范围可以在严重程度从致命新生儿疾病由于不能形成对造血骨髓的空间，更通常观察到的疾病，如骨质疏松症，其中过度的破骨细胞骨吸收易患断裂形成。
ENT“>一个孤立的破骨细胞的数量高在体外的能力也允许在骨重建周期的理解显著的进展，并铺平了道路，以应对这些疾病的新的治疗策略的发现。在这里，我们描述了一个协议，分离培养小鼠骨髓，将产生大量的破骨细胞的破骨细胞。
Introduction
骨重建是动态的，并且涉及骨形成与骨吸收1的耦合。这个严格调节的过程是负责维持正常的体内平衡中的骨架，并响应于损伤和疾病。
破骨细胞是独特的，多核细胞，其能够再吸收二者的有机和无机骨基质。破骨细胞是来源于骨髓的2-5的单核细胞/巨噬细胞系。在破骨细胞的功能，或形成的异常可导致多种临床病症，包括骨质疏松症象常见的情况的。
在体外产生的破骨细胞的能力已经允许在我们的骨生物学6的理解显著进步。其结果是，新的治疗剂的新兴治疗破骨细胞有关的疾病，这是负责显著发病率和死亡率7 8,9的一致行动人。骨骼平衡被改变中的一些疾病，包括绝经后骨质疏松症，其中增加的破骨细胞活性导致骨质量和密度10的致病损失。随着人类疾病的转基因小鼠模型的可用性，有更多的机会来破译人骨疾病11-13的破骨细胞的作用。
对破骨细胞的培养技术大量协议，出现在文献中，有许多变型描述9,12,14。性和同事描述了类似的方法，以如下所述，在小鼠骨髓细胞中破骨测定中对它们的描述的协议。然而，释放以下长骨收获骨髓细胞，性等冲洗骨髓腔的α-MEM完全培养基14。Catalfamo检查高血糖对破骨细胞功能的影响，并描述了其中的所有细胞动员骨髓潮红的方法进行培养24小时，在该点处的非贴壁细胞被丢弃12，一种技术也可用于由Boyle 等人的9，这些先前公布的协议必要冲洗骨髓，一个繁琐的实践中，其中还引入了针刺伤害和有价值的骨髓损失的风险，因为一个人必须切骨的两端部的做法。的协议中，我们描述了，实现了使用研钵和研杵的分离的破骨细胞，其类似于由Weischenfeldt 等人所述的巨噬细胞分离的方法。15
我们的经验，但是，是使用在破骨细胞的生产方面先前公布的技术的结果变量的结果即破骨细胞的分离和体外培养，常常导致在无法培养的破骨细胞。因此，我们设计了一个协议，该协议允许对小鼠骨髓的一贯隔离，以产生大量的体外多核破骨细胞，具有细胞最初镀形成的巨噬细胞和破骨细胞随后的70-80％的产率约，在存在破骨细胞诱导培养基。
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Protocol
注：伦理声明：在批准的斯坦福大学行政专家组对实验室动物护理（APLAC）按照协议进行的所有涉及脊椎动物的研究。
1.准备
- 允许10毫升市售的密度梯度的细胞分离介质（包含多聚蔗糖和泛影酸钠，调整至10.77克/毫升的密度）来RT在50ml锥形管中。
- 制备流式细胞术（FACS）缓冲液用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）和2％胎牛血清（FCS）中。取50毫升的等分试样，并且在密度梯度的细胞分离介质步骤保持这种等分在RT下使用。
- 有冰准备保持在分离过程中分离的组织和细胞的桶。
2.准备文化传媒
- 制备基础培养基：MEM（最低必需培养基），不含酚红（500毫升），谷氨酸（1×），FCS（10倍），10,000单位/ ml的青霉N（1X）。
- 过滤基础培养基用0.22微米的过滤器。
- 准备骨髓巨噬细胞诱导培养基：
- 取50毫升步骤2.1准备的基础培养基中。
- 添加前列腺素E2（PGE2，先生352.465克/摩尔）在10 -7 M终浓度。
- 添加巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）在10纳克/毫升。
- 不过滤骨髓巨噬细胞刺激媒体的最终解决方案。
- 准备破骨细胞诱导培养基：
- 取50毫升步骤2.1准备的基础培养基中。
- 添加前列腺素E2（PGE2，先生352.465克/摩尔）在10 -7 M终浓度
- 添加巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）在10纳克/毫升。
- 添加RANKL在10纳克/毫升。
- 不过滤破骨细胞诱导培养基的最终解决方案。
3.骨髓隔离
- 安乐死1 C57BL / 6小鼠用二氧化碳吸入法，随后通过颈脱位。
注：鼠害必须由经过培训的人员使用适当的技术，设备和代理进行安乐死。 - 位置并固定在鼠标上的夹层板，并喷以70％的酒精。
- 剖析了股骨，胫骨，肱骨和脊柱。
- 首先用鼠标在仰卧位。做一个切口垂直地沿着下肢并通过除以软组织的附件沿股骨和胫骨的长度解剖开始。最后，脱臼从膝关节和髋关节的骨头从骨架完全释放的骨头。
- 继续使沿上肢分离肱骨长度的切口。通过解剖软组织囊附着脱位的肱骨肩和肘关节。
- 最后，把鼠标，让鼠标趴着。使皮肤切口沿着脊柱的长度，在中线。观察椎旁软组织对脊柱和切割沿脊柱的骨边缘的每一侧，通过椎旁软组织肿块解剖。使用剪刀，使整个脊柱的水平切口在颈部的基部，并在脊柱，刚好接近尾部插入，释放从软组织附着在脊柱的末端。
- 一旦骨头收获，让他们在FACS缓冲冰上。
- 用薄纸从骨子里清除肌肉和软组织。
- 将洗净的骨头成杵和研钵用3ml FACS缓冲液。
- 在研钵轻轻粉碎的骨头。
- 吸脱血染色流体和转移到50ml锥形管中通过使溶液通过70微米的细胞过滤网。
- 加入5 ml FACS缓冲的碎骨头，并进一步挤压。再次，用移液管取出流体，并通过一个70微米的过滤器转移到50ml锥形管中。
- 通常，粉碎的骨头TWI策，以新鲜FACS缓冲液三次，用研钵和研杵，每次加入另外5毫升新鲜的FACS缓冲液中，直到该流体不染色的红色。
- 离心机在200×g离心骨髓溶液中5分钟，在4℃下，得到的细胞沉淀。
骨髓细胞4.梯度分离
- 吸去上清，重悬在10ml的FACS缓冲液（保持在室温下）。
- 以50毫升锥形管含有10ml市售的密度梯度细胞分离介质（RT）的。
- 层的骨髓液涂布到密度梯度的细胞分离介质。慢慢地使用电动移液器做到这一点。角对着附近的锥形管顶部的内表面上的移液管尖和倾斜的锥形管中，以大约30°。上吸管用慢速设置，轻轻驱逐骨髓溶液，以便不打扰密度梯度的细胞分离介质。
注：最终会有是上述两种溶液（蜂窝溶液和密度梯度的细胞分离介质溶液）之间的明确定义。 - 使用RT离心机，离心密度梯度细胞分离培养基和细胞溶液中的平衡离心机在200×g离心15分钟。此外，除去在离心机上的加速和减速，以确保有足够的相分离使用密度梯度的细胞分离介质梯度。
- 离心后，吸断其包含感兴趣的骨髓细胞的混浊的中间层。
- 转移这些细胞到新的离心管中。加入20毫升的附加FACS缓冲液（保持在冰上）洗涤细胞。
- 离心机在200×g离心5分钟，在4℃下，得到的细胞沉淀。
- 重悬在巨噬细胞刺激介质，以允许使用血球计数器进行细胞计数1毫升的最终的细胞沉淀。
5.细胞计数
- 取10微升的细胞溶液和混用10微升台盼蓝。负载10微升所得的混合物到血细胞计数器，将获得每毫升溶液中的细胞计数。
6.细胞培养
- 放置2毫升巨噬细胞刺激介质到24孔板的每个孔中。
- 加入200,000细胞，以每孔中。
注意：根据我们的经验，细胞铺板密度是足够的破骨细胞的体外培养中最关键的要求之一。 - 轻轻搅动板和放置在一个常规的培养箱中在37℃。
- 不要更改媒体3天。
- 后在巨噬细胞刺激媒体3天，改变媒体破骨细胞培养基。
- 此后，为5-7天，在该点，大，多核破骨细胞应该在培养板上的可见每日更换介质。
7.染色用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）
- 经过5-7天的体外 CULTURE，从培养物中吸出培养基良好。
- 用1×PBS三次，轻轻地洗井。
- 通过加入4％多聚甲醛溶液固定细胞，并在4℃下离开1小时。
- 在此期间，准备为TRAP染色（其可商购）通过预热到37℃。
- 1小时的多聚甲醛后，吸过和多聚甲醛轻轻洗净用1×PBS 3倍。
- 加入1毫升的预温热的TRAP染色到板的每个孔被染色。
- 将板在培养箱中在37℃下1小时，从光屏蔽。
- 1小时后，吸脱TRAP染色。
- 用预热的去离子水洗涤各孔3次。
- 染液井与吉尔的苏木（注意）1-2分钟。
- 用亮视野显微镜图像的破骨细胞。
- 洗孔用离子交换水，直至污迹的适当颜色强度来实现，典型地当晶核出现蓝Ë。
8，破骨细胞骨吸收分析
- 使用市售的24孔聚苯乙烯培养皿是预先涂有骨基质或无机晶体磷酸钙涂层。
- 放置2毫升巨噬细胞刺激介质到每个孔中。
- 添加在步骤2至各孔的端部获得200000新鲜分离骨髓细胞。
- 轻轻之前搅动板以将其放置在培养箱中在37℃下3天。
- 第3天，改变媒体破骨细胞分化的媒体。
- 5-7天执行与破骨细胞分化的媒体每日介质的变化。
9.定量破骨细胞骨吸收活动的
- 5-7天后的体外培养破骨细胞的分化培养基上的矿化基质的，分析的矿化的表面，如下面所述，以评估破骨细胞的形成resorpti的能力上的凹坑，破骨细胞活性的指标。
- 从再吸收测定板抽吸介质，并添加100微升10％的漂白剂溶液到每个孔中。
- 孵育细胞15分钟，在室温下的10％漂白溶液中。
- 用蒸馏水洗涤各孔3次。
- 吸掉任何剩余的水，并从板甩掉多余的水，并允许在空气中干燥3-5小时。
- 染液在板与市售冯Kossa染色试剂盒，以允许将未再吸收衬底更容易可视化。
- 用亮视野显微镜采取的再吸收表面的代表性部分图像。
- 利用图像分析软件，计算出再吸收表面的百分比，以允许破骨细胞骨吸收活性的定量。
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Representative Results
该方法的目的是要在一个星期容易分离大量破骨细胞的体外培养 ，典型。大量破骨细胞的成功分离用抗酒石酸酸性磷酸酶染色（ 图1A）中得到证实。大破骨细胞被可视化为紫色大细胞细胞核多个（通常≥3核）。使用该协议，它是常见的，分离的破骨细胞与破骨细胞每多达30细胞核（ 图1B）。
使用矿化的表面被认为是评估在体外破骨细胞的骨吸收活性的金标准方法。用这种方法，表面矿化的已形成的百分比，或“吸收陷窝”允许测定破骨细胞的骨吸收的能力（ 图2）。
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培养的骨髓以下破骨细胞诱导条件下，10天的文化图1（A）抗酒石酸酸性磷酸酶染色。明视场显微照片放大10倍显示出多个大，多核破骨细胞是TRAP阳性（紫色染色）。一个大的，多核破骨细胞的一个例子是由一个红色虚线在10X放大率展示一个大型的，多核，TRAP阳性破骨细胞的概述。（B）的明场显微照片。在一个多核破骨细胞的细胞核的例子所示的红色箭头， 请点击这里查看该图的放大版本。
图2.明视场显微照片放大10倍显示出了破骨细胞的骨吸收活动形成骨吸收陷窝。矿化基质沾有冯·科萨染色，以便进行可视化。黑色虚线勾勒矩阵的再吸收方面的一个例子。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
一个很容易分离，培养大量的破骨细胞在体外的能力一直负责帮助推动骨生物学和破骨细胞介导的疾病的认识。这是RANKL的识别，导致此，当它最近被鉴定为破骨细胞的形成，分化和存活16-18的主要调节剂。
据我们的经验是， 在体外培养骨髓破骨细胞在很大程度上依赖于接种密度。我们观察到，该协议得到的破骨细胞的失败通常是由于一个不理想的接种密度电镀骨髓来源的细胞时。因此，在该协议中，建议将种子每24孔板200,000个细胞很好。此外，为了实现这种技术的最大成功，建议以精确制备破骨细胞诱导培养基上方和改变介质在的S如所述火焰时间的每一天中，初始3天后，当一个不需要打扰的培养板中。这可以允许的破骨细胞诱导培养基因子的恒定浓度。此外，我们已发现，使用特定的试剂也允许大量多核破骨细胞的培养更大的潜力。
该技术是由逆转录离心机，其中一个可改变的加速和减速的参数和采购特定试剂的可用性的限制。其实不然一个非常简单的协议，与我们有过太多的成功，在一系列不同的年龄和遗传背景的小鼠（ 如 C57BL / 6，CD1，NOD SCID，瘦素DB - / - ）。
该技术提供了一种可靠的方法来产生在体外破骨细胞，并确定其重吸收矿化基质的能力。使用该协议，有可能分离出大量在VITR多核破骨细胞的Ø通常在一个星期内。我们的经验是破骨细胞的分离和体外培养使用破骨细胞生产方面此前公布的技术成果在充满变数的结果，往往造成了无法培养破骨细胞9,12,14。
破骨细胞的功能是复杂的和骨吸收是一个被在本地级别由成骨细胞和破骨19之间的串扰介导的高度编排过程。除了 骨骼平衡的本地控制，新的证据表明，破骨细胞的活性是通过与免疫，神经和其他体制性因素20-24系统性因素的制约。
由于破骨细胞生物学的认识继续快速推进，包括流程，从骨重塑的作用在调节肿瘤骨转移25-27其不同的作用，该协议将允许研究人员组成ently分离大量破骨细胞在体外 。
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Disclosures
没有一个作家有披露或有利益冲突申报。
Acknowledgments
我们承认美国国立卫生研究院拨款R01 DE021683，R01 DE019434，U01 HL099776，橡树基金会和Hagey实验室小儿再生医学的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
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