Summary
Les ostéoclastes sont des cellules du capital de résorption osseuse dans le corps. Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre a conduit à des avancées significatives dans la compréhension de la biologie des ostéoclastes. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour l'isolement, la culture et la quantification de l'activité des ostéoclastes in vitro.
Abstract
Les ostéoclastes sont des cellules hautement spécialisées qui sont dérivés de la lignée des monocytes / macrophages de la moelle osseuse. Leur capacité unique à se résorber à la fois les matrices organiques et inorganiques de l'os signifie qu'ils jouent un rôle clé dans la régulation de remodelage osseux. Ensemble, les ostéoblastes et les ostéoclastes sont responsables du processus de couplage dynamique qui implique à la fois la résorption osseuse et la formation osseuse agissant de concert pour maintenir le squelette normal pendant la santé et la maladie.
Comme la cellule principale de résorption osseuse dans le corps, des changements dans la différentiation ou la fonction des ostéoclastes peuvent entraîner des effets profonds dans le corps. Les maladies associées à la fonction des ostéoclastes modifié peut varier dans la sévérité de la maladie néonatale létale due à l'échec à former un espace de moelle pour l'hématopoïèse, à des pathologies telles que l'ostéoporose, dans lequel excessive résorption osseuse ostéoclastique prédispose aux fractures formation plus couramment observé.
ent "> Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre in vitro a permis des avancées significatives dans la compréhension du cycle de remodelage osseux et a ouvert la voie à la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques qui luttent contre ces maladies.Ici, nous décrivons un protocole pour isoler et cultiver les ostéoclastes de moelle osseuse de souris qui donnera un grand nombre d'ostéoclastes.
Introduction
Le remodelage osseux est dynamique et implique le couplage de la formation osseuse à la résorption osseuse 1. Ce processus finement régulé est responsable du maintien du squelette au cours de l'homéostasie normale, et en réponse à une blessure et maladie.
Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées uniques qui sont capables de se résorber à la fois les matrices organiques et inorganiques de l'os. Les ostéoclastes sont issus de la lignée des monocytes / macrophages de la moelle osseuse 5.2. Les anomalies de la fonction ou de la formation des ostéoclastes peuvent entraîner une variété de pathologies cliniques, y compris les conditions courantes telles que l'ostéoporose.
La capacité de générer des ostéoclastes in vitro a permis des avancées significatives dans notre compréhension de la biologie de l'os 6. En conséquence, de nouveaux agents thérapeutiques émergent pour traiter des maladies liées aux ostéoclastes qui sont responsables de la morbidité et de la mortalité importantes 7 8,9. homéostasie osseuse est modifiée dans un certain nombre de maladies, y compris l'ostéoporose post-ménopausique, dans lequel une activité accrue des ostéoclastes conduit à la perte pathogène de la masse osseuse et de la densité 10. Avec l'augmentation de la disponibilité des modèles murins transgéniques de la maladie humaine, il n'y a plus possibilité de déchiffrer le rôle des ostéoclastes dans la maladie de l'os humain 11-13.
De nombreux protocoles pour des techniques de culture d'ostéoclastes apparaissent dans la littérature, avec de nombreuses variantes décrites 9,12,14. Xing et ses collègues décrivent une méthodologie similaire au protocole décrit ci-dessous, dans leur description de dosages ostéoclastogéniques à partir de cellules de la moelle osseuse de souris. Cependant, pour libérer les cellules de la moelle osseuse après la récolte des os longs, Xing et al. Vider la cavité médullaire d'α-MEM milieu complet14. Catalfamo examine l'effet de l'hyperglycémie sur la fonction des ostéoclastes et décrit un procédé dans lequel toutes les cellules mobilisées rinçage de la moelle osseuse par des sont cultivées pendant 24 heures, après quoi les cellules non adhérentes sont éliminées 12, une technique également utilisée par Boyle et al . 9 Ces protocoles publiés précédemment nécessitent la pratique de la chasse d'eau de la moelle osseuse, une pratique fastidieux, qui présente aussi le risque d'une blessure par piqûre d'aiguille et de la perte de valeur de la moelle osseuse, comme on doit couper les deux extrémités de l'os. Le protocole, que nous décrivons, met en oeuvre l'utilisation d'un mortier et d'un pilon pour isoler les ostéoclastes, qui est similaire à la méthode d'isolement de macrophages décrit par Weischenfeldt 15 et al.
Notre expérience, cependant, est que l'isolement des ostéoclastes et la culture in vitro en utilisant les résultats des techniques déjà publiés dans les résultats variables en termes de production des ostéoclastes, ce qui entraîne souventune incapacité à cultiver les ostéoclastes. Par conséquent, nous avons mis au point un protocole qui permet l'isolement compatible de moelle osseuse de souris pour produire un grand nombre d'ostéoclastes multinucléés in vitro, avec un rendement approximatif de 70 à 80% des cellules plaquées initialement la formation d'ostéoclastes et des macrophages par la suite, en présence de médias ostéoclastes à induction.
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Protocol
REMARQUE: déclaration éthique: Toute recherche impliquant des animaux vertébrés a été réalisée dans les protocoles de conformité approuvés par la commission administrative de Stanford sur le soin des animaux de laboratoire (APLAC).
1. Préparation
- Autoriser 10 ml de milieux disponibles dans le commerce de séparation cellulaire à gradient de densité (qui contient le polysucrose et de diatrizoate de sodium, ajusté à une densité de 1,077 g / ml) de venir à la température ambiante dans un tube conique de 50 ml.
- Préparer cytométrie en flux (FACS) avec un tampon phosphate de 1x solution saline tamponnée (PBS) et 2% de sérum de veau foetal (SVF). Il suffit de 50 ml aliquote et maintenir cette aliquote à la température ambiante pour une utilisation au cours de l'étape de milieux de séparation cellulaire à gradient de densité.
- Avoir un seau de glace prêt à maintenir le tissu isolé et cellules en cours de la procédure d'isolement.
2. Préparer les milieux de culture
- Préparez le support de base: MEM (Minimal Essential Medium), sans rouge de phénol (500 ml), le glutamate (1x), FCS (10x), 10 000 unités / ml penicillin (1x).
- Filtre milieux de base avec un filtre de 0,22 um.
- Préparer os médias moelle macrophages par induction:
- 50 ml de milieux de base préparé à l'étape 2.1.
- Ajouter la prostaglandine E2 (PGE2, M. 352,465 g / mol) à 10 -7 M concentration finale.
- Ajouter Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF) à 10 ng / ml.
- Ne pas filtrer la solution finale de macrophages de la moelle osseuse en stimulant médias.
- Préparez le support d'induction des ostéoclastes:
- 50 ml de milieux de base préparé à l'étape 2.1.
- Ajouter la prostaglandine E2 (PGE2, M. 352,465 g / mol) à 10 -7 M concentration finale
- Ajouter Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF) à 10 ng / ml.
- Ajouter RANKL à 10 ng / ml.
- Ne pas filtrer la solution finale de médias ostéoclastes d'induction.
3. Isolement de moelle osseuse
- Euthanasier une souris C57BL / 6Procédé utilisant le dioxyde de carbone par inhalation, suivie d'une dislocation cervicale.
NOTE: Les rongeurs doivent être euthanasiés par un personnel qualifié en utilisant la technique, matériel et les agents appropriés. - Positionner et fixer la souris sur une planche de dissection et pulvériser avec 70% d'alcool.
- Disséquer les fémurs, tibias, humérus et la colonne vertébrale.
- Commencez avec la souris en position couchée. Faire une incision verticale le long de la branche inférieure et commencer par dissection sur la longueur du fémur et du tibia en divisant les pièces jointes des tissus mous. Enfin, disloquer les os de l'articulation du genou et de la hanche afin de libérer pleinement os du squelette.
- Procéder pour faire une incision le long de la longueur du membre supérieur pour isoler l'humérus. Disloquer l'humérus à l'épaule et du coude en disséquant doux attachement capsulaire de tissu.
- Enfin, mettez la souris sur, de sorte que la souris est sujette. Faire une incision de la peau le long de la longueur de la colonne vertébrale, à la ligne médiane. Observez la douce paravertebralle tissu de chaque côté de la colonne vertébrale et incise le long du bord osseux de la colonne vertébrale, de dissection à travers la masse paravertébrale des tissus mous. En utilisant une paire de ciseaux, faire une coupe horizontale à travers la colonne vertébrale à la base du cou, et à la fin de la colonne vertébrale, juste en amont de l'insertion de la queue, ce qui libère la colonne vertébrale de la fixation des tissus mous.
- Une fois que les os sont récoltées, les garder dans un tampon FACS sur la glace.
- Utilisez du papier de soie pour nettoyer les muscles et les tissus mous de l'os.
- Placez les os nettoyés dans un mortier avec 3 ml de tampon FACS.
- Concasser les os doucement dans le pilon et le mortier.
- Aspirer le fluide et le transfert taché de sang dans un tube conique de 50 ml en faisant passer la solution à travers un tamis cellulaire de 70 pm.
- Ajouter 5 ml de tampon FACS à l'os écrasés et écraser davantage. Encore une fois, retirez le fluide à l'aide d'une pipette et transférer à la 50 ml tube conique à travers une passoire 70 um.
- Typiquement écraser les os twiCE à trois fois dans du tampon FACS frais, à l'aide d'un mortier et d'un pilon, ajoutant à chaque fois à nouveau 5 ml de tampon FACS frais, jusqu'à ce que le liquide ne tache pas rouge.
- Centrifuger la solution de la moelle osseuse à 200 xg pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir un culot cellulaire.
4. Séparation Gradient de cellules de moelle osseuse
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 10 ml de tampon FACS (maintenu à la température ambiante).
- Prendre le tube conique de 50 ml contenant 10 ml de milieux disponibles dans le commerce de séparation cellulaire à gradient de densité (RT).
- La solution de couche de moelle osseuse sur le gradient de densité des milieux de séparation cellulaire. Pour ce faire, lentement en utilisant une pipette électrique. Angle de la pointe de la pipette contre la surface intérieure vers le haut du tube conique et incliner le tube conique à environ 30 °. L'utilisation d'un réglage de la vitesse lente de la pipette, expulser doucement la solution de la moelle osseuse de manière à ne pas perturber le gradient de densité des milieux de séparation cellulaire.
NOTE: En fin de compte il y auraune définition claire entre les deux solutions (solution cellulaire et la solution de milieu de séparation cellulaire en gradient de densité). - L'utilisation d'une centrifugeuse à température ambiante, centrifuger le gradient de densité milieux de séparation cellulaire et de la solution de cellules dans une centrifugeuse équilibré à 200 xg pendant 15 min. En outre, supprimer l'accélération et la décélération de la centrifugeuse afin d'assurer une séparation de phases appropriée à l'aide du gradient de densité de gradient de milieu de séparation cellulaire.
- Après centrifugation, aspirer hors de la couche du milieu trouble qui contient les cellules de moelle osseuse d'intérêt.
- Transférer ces cellules dans un nouveau tube conique. Ajouter 20 ml de tampon FACS supplémentaire (conservé dans la glace) pour laver les cellules.
- Centrifuger à 200 g pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir un culot cellulaire.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml finale de stimulation des macrophages médias pour permettre le comptage des cellules en utilisant un hématimètre.
5. Décompte Cellulaire
- Prenez 10 pl de la solution cellulaire et mélangeravec 10 pi de bleu trypan. Charge 10 ul du mélange résultant SUR UNE hémocytomètre et obtenir le nombre de cellules par ml de solution.
6. La culture cellulaire
- Placer 2 ml de milieu de macrophage dans chaque puits d'une plaque de 24 puits.
- Ajouter 200.000 cellules dans chaque puits.
NOTE: Dans notre expérience, la densité cellulaire placage est l'un des besoins les plus cruciaux pour adéquat à la culture in vitro des ostéoclastes. - Agiter doucement la plaque et placer dans un incubateur régulière à 37 ° C.
- Ne modifiez pas les médias pendant 3 jours.
- Après 3 jours dans les médias de macrophage, changer les médias aux médias des ostéoclastes.
- Ci-après, changer le quotidien des médias pendant 5-7 jours, à quel point, les grandes, les ostéoclastes multinucléées doit être visible sur la plaque de culture.
7. coloration avec résistant au tartrate acide phosphatase (TRAP)
- Après 5-7 jours in vitro de culture, aspirer les médias de la culture bien.
- Laver les puits doucement avec du PBS 1X trois fois.
- Fixer les cellules par addition d'une solution de paraformaldéhyde à 4% et laisser reposer pendant 1 heure à 4 ° C.
- Pendant ce temps, préparer la tache de TRAP (qui est disponible dans le commerce) par préchauffage à 37 ° C.
- Après 1 heure dans du paraformaldéhyde, Aspirer paraformaldéhyde et laver délicatement 3 fois avec PBS 1x.
- Ajouter 1 ml de colorant préchauffé piège dans chaque puits de la plaque à colorer.
- Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 heure, à l'abri de la lumière.
- Après 1 heure, aspirer la tache de TRAP.
- Laver les puits 3 fois avec de l'eau déminéralisée préchauffé.
- Contre le bien à l'hématoxyline de Gill (MISE EN GARDE) pendant 1-2 min.
- ostéoclastes de l'image en utilisant la microscopie à champ clair.
- Laver les puits avec de l'eau déminéralisée jusqu'à une intensité de la couleur adéquate de la tache est réalisée, généralement lorsque les noyaux apparaissent blue.
8. résorption ostéoclastique Assay
- Utilisation d'une boîte de culture de 24 puits en polystyrène disponibles dans le commerce qui est pré-revêtu d'une ou l'autre substrat de l'os ou un revêtement de phosphate de calcium cristallin inorganique.
- Placer 2 ml de milieu de macrophage dans chaque puits.
- Ajouter 200 000 cellules de moelle osseuse fraîchement isolées obtenues à l'issue de l'étape 2 à chaque puits.
- Agiter doucement la plaque avant de la placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 3 jours.
- Au jour 3, modifier le support de médias de la différenciation des ostéoclastes.
- Effectuer des changements quotidiens des médias avec les médias de la différenciation des ostéoclastes pendant 5-7 jours.
9. Quantification de la résorption ostéoclastique activité
- Après 5-7 jours de culture dans un milieu de différenciation des ostéoclastes in vitro sur un substrat minéralisé, d'analyser la surface minéralisée, comme décrit ci-dessous, afin d'évaluer la capacité des ostéoclastes pour former resorptisur puits, un indicateur de l'activité des ostéoclastes.
- Aspirer le milieu de la plaque d'essai de résorption et ajouter 100 ul d'une solution d'eau de Javel à 10% dans chaque puits.
- Incuber les cellules avec la solution d'eau de Javel à 10% pendant 15 min à température ambiante.
- Laver les puits 3 fois avec de l'eau distillée.
- Aspirer l'eau restante et secouer l'excès d'eau de la plaque et laisser sécher à l'air pendant 3-5 heures.
- Contre la plaque avec un kit de coloration de Von Kossa disponible dans le commerce pour permettre la visualisation facile du substrat non résorbé.
- Utilisez la microscopie à champ clair de prendre des images de pièces représentatives de la surface résorbée.
- En utilisant le logiciel d'analyse d'image, calculer le pourcentage de la surface résorbé pour permettre une quantification de l'activité de résorption ostéoclastique.
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Representative Results
Le but de cette méthode est d'isoler facilement un grand nombre d'ostéoclastes in vitro, typiquement en une semaine. Isolation réussie d'un grand nombre d'ostéoclastes a été confirmée en utilisant la phosphatase acide tartrate de coloration résistant (Figure 1A). Pour les ostéoclastes sont visualisées en tant que grandes cellules pourpres avec de multiples noyaux (typiquement ≥ 3 noyaux). En utilisant ce protocole, il est fréquent d'isoler les ostéoclastes avec pas moins de 30 noyaux par les ostéoclastes (figure 1B).
Utilisation d'une surface minéralisée est considérée comme la méthode de référence pour évaluer l'activité de résorption des ostéoclastes in vitro. En utilisant cette méthode, le pourcentage de surface minéralisée, ou "creux de résorption" qui ont formé permet une détermination de la capacité de résorption des ostéoclastes (Figure 2).
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1. (A) résistant à l'acide tartrate Figure phosphatase coloration de culture de moelle osseuse après 10 jours de culture dans des conditions ostéoclastes inductifs. Micrographie en champ clair à un grossissement de 10X démontre plusieurs grands ostéoclastes multinucléées qui sont TRAP (coloration pourpre) positif. Un exemple d'un grand, ostéoclastes multinucléées est décrit par une ligne pointillée rouge. (B) Lumineux micrographie champ au grossissement 10X démontrant une grande multinucléées, TRAP ostéoclastes, positif. Un exemple d'un noyau dans un ostéoclastes multinucléées est indiqué par la flèche rouge. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Lumineux micrographie champ au grossissement 10X démontre creux de résorption formés par l'activité de résorption des ostéoclastes. Matrice minéralisée est tachée de Von Kossa tache pour permettre la visualisation. Le noir des lignes en pointillés décrivent un exemple de zones résorbés de la matrice. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Une capacité d'isoler et de cultiver facilement un grand nombre d'ostéoclastes in vitro a été chargé d'aider à faire progresser la compréhension de la biologie des maladies des os et des ostéoclastes. Il a été l'identification de RANKL qui mènent à cela, quand il a récemment été identifié comme le principal régulateur de la formation des ostéoclastes, la différenciation et la survie 16-18.
Il a été notre expérience que la culture in vitro des ostéoclastes à partir de la moelle osseuse est largement tributaire de la densité de semis. Nous avons observé que l'échec de ce protocole pour obtenir des ostéoclastes est généralement dû à une densité de semis optimale lorsque étalement des cellules dérivées de la moelle osseuse. Ainsi, dans ce protocole, il est recommandé d'ensemencer 200 000 cellules par plaque de 24 puits bien. En outre, afin d'obtenir le maximum de succès avec cette technique, il est recommandé de préparer les milieux d'induction des ostéoclastes, comme décrit précisément ci-dessus et à modifier le support à la stemps ame chaque jour, après les 3 premiers jours où l'on n'a pas besoin de déranger les plaques de culture. Cela peut permettre une concentration constante des facteurs de médias ostéoclastes à induction. En outre, nous avons constaté que l'utilisation de réactifs spécifiques permet également un plus grand potentiel pour la culture d'un grand nombre d'ostéoclastes multinucléés.
Cette technique est limitée par la disponibilité d'une centrifugeuse à température ambiante, dans laquelle on peut modifier les paramètres d'accélération et de décélération et l'achat de réactifs spécifiques. Il est par ailleurs un protocole très simple, avec qui nous avons eu beaucoup de succès, dans une gamme de souris d'âge et le patrimoine génétique différent (par exemple, C57BL / 6, CD1, NOD SCID, Lep db - / -).
Cette technique offre une méthode fiable pour générer des ostéoclastes in vitro et à déterminer leur capacité à résorber matrice minéralisée. En utilisant ce protocole, il est possible d'isoler un grand nombre d'ostéoclastes multinucléés dans vitro typiquement en une semaine. Notre expérience est que l'isolement des ostéoclastes et la culture in vitro en utilisant les résultats des techniques déjà publiées dans des résultats très variables en termes de production des ostéoclastes, ce qui entraîne souvent une incapacité à cultiver ostéoclastes 9,12,14.
la fonction des ostéoclastes est complexe et la résorption osseuse est un processus hautement orchestrée qui est médiée au niveau local par la diaphonie entre les ostéoblastes et les ostéoclastes 19. En plus de contrôle local de l'équilibre de l'os, nouvelles preuves suggèrent que l'activité des ostéoclastes est régi systémique par des facteurs liés à l'abri, neuronale, et d'autres facteurs systématiques 20-24.
Comme la compréhension de la biologie des ostéoclastes continue de progresser rapidement, y compris leur rôle dans divers processus allant de remodelage osseux à leur rôle dans la régulation des métastases de cancer de l'os 25-27, ce protocole permettra aux chercheurs de se composentremment isoler de grandes quantités d'ostéoclastes in vitro.
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Disclosures
Aucun des auteurs n'a divulgation ou de conflit d'intérêt à déclarer.
Acknowledgments
Nous reconnaissons l'appui de subventions des NIH R01 DE021683, DE019434 R01, U01 HL099776, la Fondation Oak et le laboratoire Hagey for Pediatric médecine régénérative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
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