Summary
Osteoklasten sind die Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper. Eine Fähigkeit, die Osteoklasten in großer Zahl zu isolieren hat erhebliche Fortschritte im Verständnis der Osteoklasten Biologie geführt. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultivierung und Quantifizierung der Osteoklastenaktivität in vitro.
Abstract
Osteoklasten sind hoch spezialisierte Zellen, die von Monozyten / Makrophagen-Linie im Knochenmark abgeleitet sind. Ihrer einzigartigen Fähigkeit, sowohl die organischen und anorganischen Matrices von Knochen resorbieren, bedeutet, dass sie eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Skelettumbau spielt. Gemeinsam sind Osteoblasten und Osteoklasten für die dynamische Kopplung Prozess, der sowohl die Knochenresorption und gemeinsam handeln, um den normalen Skelett während Gesundheit und Krankheit pflegen Knochenbildung beinhaltet verantwortlich.
Als Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper, können Änderungen in der Osteoklastendifferenzierung oder Funktion in tiefgreifende Wirkungen im Körper führen. Krankheiten mit veränderter Osteoklasten-Funktion verbunden sind, können im Schweregrad von letalen neonatalen Erkrankung aufgrund eines Fehlers einen Markraum für Hämatopoese bilden reichen, um mehr häufigsten beobachteten Pathologien wie Osteoporose, bei denen eine übermäßige Knochenresorption durch Osteoklasten prädisponiert Formation zu brechen.
ent "> Eine Fähigkeit, Osteoklasten in hoher Anzahl in vitro zu isolieren hat für bedeutende Fortschritte im Verständnis der Knochenumbauzyklus erlaubt und hat den Weg für die Entdeckung neuer therapeutischer Strategien, die Bekämpfung dieser Krankheiten geebnet.Hier beschreiben wir ein Protokoll zu isolieren und zu kultivieren Osteoklasten aus Knochenmark der Maus, die eine große Zahl von Osteoklasten ergeben wird.
Introduction
Knochenumbau ist dynamisch und umfasst die Kopplung von Knochenbildung mit Knochenresorption 1. Diese stark regulierten Prozess ist für die Aufrechterhaltung der Skelett während normaler Homöostase verantwortlich ist und in Reaktion auf eine Verletzung und Krankheit.
Osteoklasten sind einzigartig, mehrkernige Zellen, die fähig resorbierenden sowohl die organischen und anorganischen Matrizen von Knochen sind. Osteoklasten sind aus der Monozyten / Makrophagen-Linie im Knochenmark 2-5 abgeleitet. Anomalien in der Funktion oder Bildung von Osteoklasten in einer Vielzahl von klinischen Erkrankungen, einschließlich gemeinsamer Erkrankungen wie Osteoporose führen.
Die Fähigkeit, die Osteoklasten in vitro zu erzeugen hat signifikante Fortschritte im Verständnis von Knochen biology 6 erlaubt. Als Ergebnis werden neue therapeutische Mittel Schwellen Osteoklasten bedingten Krankheiten, die zur schweren Erkrankungen und Todesfälle verantwortlich sind, zu behandeln 7 8,9. Knochenhomöostase ist in einer Reihe von Krankheiten, einschließlich postmenopausalen Osteoporose verändert, bei denen erhöhte Osteoklastenaktivität führt zu pathogenen Verlust von Knochenmasse und Dichte 10. Mit zunehmender Verfügbarkeit von transgenen Mausmodellen menschlicher Krankheiten gibt es mehr Möglichkeiten, um die Rolle der Osteoklasten in menschlichen Knochenerkrankung 11-13 entziffern.
Zahlreiche Protokolle für Osteoklastenkulturverfahren werden in der Literatur, mit vielen Variationen beschriebene 9,12,14. Xing und Kollegen beschreiben ähnliche Methodik auf die nachstehend beschriebenen, in ihrer Beschreibung osteoclastogenic Assays von murinen Knochenmarkszellen Protokoll. Allerdings, um die Knochenmarkzellen nach langen Knochen Ernte freizugeben, Xing et al. Spülen Markhöhle mit α-MEM komplette Medien14. Catalfamo untersucht die Wirkung von Hyperglykämie auf die Osteoklastenfunktion und beschreibt ein Verfahren, bei denen alle Zellen von Knochenmark mobilisiert Spülung kultiviert für 24 Stunden, wobei an diesem Punkt die nicht-adhärenten Zellen werden verworfen, 12, auch eine Technik von Boyle et al . 9 Die zuvor veröffentlichten Protokollen erfordern die Durchführung der Spülung des Knochenmarks, eine mühsame Praxis, die führt auch das Risiko einer Nadelstichverletzung und den Verlust wertvoller Knochenmark, so muß man die beiden Enden des Knochens schneiden. Das Protokoll, das wir beschreiben, führt die Verwendung von Mörser und Pistill zu Osteoklasten zu isolieren, die ähnlich dem Verfahren von Weischenfeldt et al Makrophagen Isolation 15.
Unsere Erfahrung ist jedoch, dass Osteoklasten Isolierung und in vitro-Kultur unter Verwendung von früher veröffentlichten Verfahren ergibt unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf die Osteoklasten-Produktion, was häufigin der Unfähigkeit, die Osteoklasten zu kultivieren. Daher haben wir ein Protokoll, das für die konsequente Trennung von Knochenmark der Maus eine große Anzahl von mehrkernigen Osteoklasten in vitro, mit einer ungefähren Ausbeute von 70-80% der Zellen anfänglich plattierten Form Makrophagen und Osteoklasten erzeugen kann anschließend in Gegenwart entwickelt, Osteoklasten Induktionsmedien.
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Protocol
HINWEIS: Ethische Aussage: Alle Forschungs mit Wirbeltieren wurde nach Protokollen von der Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) zugelassen geführt.
1. Vorbereitung
- Geben Sie 10 ml des im Handel erhältlichen Dichtegradienten Zellentrennmedium (das Polysaccharose und Natriumdiatrizoat enthält, auf eine Dichte von 1,077 g / ml eingestellt) auf RT in einem 50 ml konischen Röhrchen kommen.
- Vorbereitung Durchflusszytometrie (FACS) mit Puffer 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 2% fötalem Kälberserum (FCS). Nehmen Sie ein 50 ml Aliquot und dieses aliquoten bei RT für den Einsatz zu halten während des Dichtegradienten Zelltrennmedien Schritt.
- Haben Sie einen Eimer mit Eis bereit, isolierten Gewebe und Zellen in während der Isolierungsverfahren beizubehalten.
2. Bereiten Kultur Medien
- Vorbereitung Basalmedium: MEM (Minimal Essential Medium) ohne Phenolrot (500 ml), Glutamat (1x), FCS (10x), 10.000 Einheiten / ml Penicillin (1x).
- Filtern Basalmedium mit einem 0,22 um-Filter.
- Bereiten Knochenmark-Makrophagen-Induktionsmedien:
- Nehmen Sie 50 ml der in Schritt 2.1 vorbereitet Basalmedien.
- In Prostaglandin E2 (PGE2, Herr 352,465 g / mol) bei 10 -7 M Endkonzentration.
- Hinzufügen Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) bei 10 ng / ml.
- Nicht filtern die endgültige Lösung von Knochenmark-Makrophagen-stimulierende Medien.
- Bereiten Osteoklasten Induktionsmedien:
- Nehmen Sie 50 ml der in Schritt 2.1 vorbereitet Basalmedien.
- In Prostaglandin E2 (PGE2, Herr 352,465 g / mol) bei 10 -7 M Endkonzentration
- Hinzufügen Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) bei 10 ng / ml.
- Hinzufügen RANKL bei 10 ng / ml.
- Nicht filtern die endgültige Lösung von Osteoklasten Induktionsmedien.
3. Knochenmark-Isolation
- Euthanize einer C57BL / 6-Maus,Verwendung von Kohlendioxid Inhalationsverfahren, gefolgt durch zervikale Dislokation.
HINWEIS: Nagetiere müssen von geschultem Personal mit geeigneten Technik, Ausrüstung und Agenten eingeschläfert werden. - Position und sichern Sie die Maus auf eine Dissektion Bord und Spray mit 70% Alkohol.
- Präparieren Sie die Oberschenkelknochen, Schienbeine, Oberarmknochen und Wirbelsäule.
- Beginnen Sie mit der Maus in Rückenlage. Einen Einschnitt vertikal entlang der unteren Extremität und beginnen durch Sezieren entlang der Länge des Oberschenkelknochens und des Schienbeins durch Division Weichgewebe-Anhänge. Schließlich verrenken Knochen vom Knie und Hüftgelenk Knochen vollständig aus dem Skelett zu befreien.
- Gehen Sie, um einen Einschnitt entlang der Länge der oberen Extremitäten, den Oberarmknochen zu isolieren machen. Verrenken den Humerus an der Schulter und Ellenbogengelenke durch Sezieren Weichgewebe Kapselansatz.
- Schließlich drehen Sie die Maus über, so dass die Maus liegt auf dem Bauch. Machen Sie eine Hautschnitt entlang der Länge der Wirbelsäule, in der Mittellinie. Beachten Sie die paravertebralen WeichGewebe auf jeder Seite der Wirbelsäule und Einschnitt entlang der knöchernen Rand der Wirbelsäule, Sezieren durch die paravertebralen Weichgewebemasse. Mit einer Schere, einen horizontalen Schnitt über der Wirbelsäule an der Basis des Halses, und am Ende der Wirbelsäule, genau proximal zum Schwanz Insertion, die Befreiung der Wirbelsäule vom Weichteilbefestigung.
- Sobald die Knochen geerntet werden, halten sie in FACS-Puffer auf Eis.
- Verwenden Sie Seidenpapier, um Muskeln und Weichteile von den Knochen zu reinigen.
- Legen Sie die gereinigten Knochen in einen Mörser und Stößel mit 3 ml FACS-Puffer.
- Crush die Knochen sanft im Stößel und Mörser.
- Absaugen der blutigen Flüssigkeit und Überführung in eine 50 ml konischen Röhrchen, indem die Lösung durch ein 70 & mgr; m Zellsieb.
- 5 ml FACS-Puffer, um das zerkleinerte Knochen und weitere zerquetschen. Wieder, entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette und Transfer zum 50 ml konischen Röhrchen durch einen 70 & mgr; m Sieb.
- Die Knochen twi Typischerweise zerquetschence zu dreimal in frischem FACS-Puffer mit einem Mörser und Stößel, jedes Mal Zugabe von weiteren 5 ml frischem FACS-Puffer, bis die Flüssigkeit hinterlässt keine Flecken rot.
- Zentrifugieren des Knochenmarks Lösung bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C, um ein Zellpellet zu erhalten.
4. Gradiententrennung von Knochenmarkszellen
- Aspiration des Überstands und Resuspension in 10 ml FACS-Puffer (bei RT gehalten).
- Nehmen Sie die 50 ml konischen Röhrchen, enthaltend 10 ml von im Handel erhältlichen Dichtegradienten Zelltrennmedium (RT).
- Schicht die Knochenmark-Lösung auf den Dichtegradienten Zellseparationsmedium. Tun Sie dies langsam mit Hilfe eines elektrischen Pipette. Winkel der Pipettenspitze gegen die Innenfläche in der Nähe der Spitze der konischen Rohr und Neigung der konischen Rohr auf ca. 30 °. Eine langsame Geschwindigkeitseinstellung für die Pipette vorsichtig vertreiben die Knochenmarklösung, um nicht den Dichtegradienten Zelltrennungsmedium stören.
HINWEIS: Letztlich wird essein eine klare Definition zwischen den beiden Lösungen (Mobillösung und Dichtegradienten Zellseparation Media-Lösung). - Mit einem RT Zentrifuge Zentrifugation der Dichtegradienten Zelltrennmedien und Zelllösung in einem ausgewogenen Zentrifuge bei 200 xg für 15 min. Darüber hinaus entfernen Beschleunigung und Verzögerung an der Zentrifuge, um eine ausreichende Phasentrennung zu gewährleisten mit der Dichtegradienten Zelltrennmedien Gradienten.
- Nach der Zentrifugation absaugen den bewölkten Mittelschicht, die die Knochenmarkzellen von Interesse enthält.
- Übertragen diese Zellen in ein neues konisches Rohr. 20 ml zusätzliches FACS-Puffer (auf Eis gehalten), um die Zellen zu waschen.
- Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C, um ein Zellpellet zu erhalten.
- Resuspendieren die endgültige Zellpellet in 1 ml Makrophagen stimulierende Medien zur Zellzählung mit einer Zählkammer ermöglichen.
5. Zellzählung
- Nimm 10 & mgr; l der Zelllösung und Mischenmit 10 ul Trypanblau. Last 10 ul der resultierenden Mischung auf einem Hämozytometer und erhalten die Zellzahl pro ml Lösung.
6. Zellkultur
- Platzieren 2 ml Makrophagen stimulierende Medium in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen.
- Hinzufügen 200.000 Zellen in jede Vertiefung.
HINWEIS: Nach unserer Erfahrung ist zell Plattierungsdichte eine der wichtigsten Voraussetzungen für eine angemessene in vitro Kultivierung von Osteoklasten. - Die Platte und in einem regelmäßigen Inkubator behutsam schütteln bei 37 ° C.
- Die Medien für 3 Tage nicht verändern.
- Nach 3 Tagen in Makrophagen stimulierende Medien verändern die Medien, um Osteoklasten Medien.
- Jenseits, ändern Sie die Medien täglich für 5-7 Tage, an welchem Punkt, große, mehrkernige Osteoklasten sollte auf der Kulturplatte sichtbar sein.
7. Färbung mit Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP)
- Nach 5-7 Tagen in vitro cultur, saugen Sie den Medien aus der Kultur gut.
- Vorsichtig mit 1x PBS dreimal waschen Brunnen.
- Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 4% Paraformaldehydlösung und lassen für 1 Stunde bei 4 ° C.
- Während dieser Zeit bereiten die TRAP-Färbung (das im Handel erhältlich ist) durch Vorwärmen auf 37 ° C.
- Nach 1 Stunde in Para, absaugen Para und vorsichtig waschen 3 Mal mit 1x PBS.
- 1 ml der vorgewärmten TRAP-Färbung in jedes Well der Platte zu gefärbt werden.
- Die Platte wird in einem Brutschrank bei 37 ° C für 1 h, vor Licht geschützt.
- Nach 1 Stunde, absaugen das TRAP-Färbung.
- 3 mal mit vorgewärmten deionisiertem Wasser waschen die Vertiefungen geben.
- Gegenfärbung der gut mit Gill Hämatoxylin (VORSICHT) für 1-2 min.
- Bild Osteoklasten mit Hellfeldmikroskopie.
- Waschen Vertiefungen mit entionisiertem Wasser, bis eine ausreichende Farbintensität des Flecks erreicht ist, typischerweise, wenn Kerne erscheinen Blue.
8. Osteoklasten Resorption Assay
- Verwenden Sie einen handelsüblichen 24-Well-Polystyrol-Kulturschale, die entweder mit Knochen Substrat oder einem anorganischen kristallinen Calciumphosphat-Beschichtung vorbeschichtet ist.
- Platz 2 ml Makrophagen stimulierende Medien in jedes Well.
- Hinzufügen 200.000 frisch isolierte Knochenmarkszellen am Ende von Schritt 2 zu jeder Vertiefung erhalten.
- Die Platte behutsam schütteln vor dem Einlegen in einem Brutschrank bei 37 ° C für 3 Tage.
- Am Tag 3 Verändern Sie die Medien, um die Differenzierung von Osteoklasten Medien.
- Führen Sie täglich Medienwechsel mit Osteoklastendifferenzierung Medien für 5-7 Tage.
9. Quantifizierung von Osteoklasten Resorptionsaktivität
- Nach 5-7 Tagen der in vitro-Kultur in der Osteoklastendifferenzierungsmedien auf einem mineralisierten Substrats, analysieren die mineralisierten Oberfläche, wie nachstehend beschrieben, um die Fähigkeit von Osteoklasten zu bilden resorpti beurteilenauf Gruben, ein Indikator für die Osteoklasten-Aktivität.
- Saugen Sie Medien aus dem Resorption Assayplatte und fügen Sie 100 ul 10% Bleichmittel-Lösung in jede Vertiefung.
- Inkubieren der Zellen mit 10% Bleichmittel-Lösung für 15 min bei RT.
- 3 mal mit destilliertem Wasser waschen die Vertiefungen geben.
- Absaugen restliche Wasser und schütteln Sie überschüssiges Wasser von der Platte und an der Luft trocknen für 3-5 Std.
- Gegenfärbung der Platte mit einem im Handel erhältlichen Von Kossa-Färbung Kit zur leichteren Visualisierung des nicht resorbiert Substrat zu ermöglichen.
- Verwenden Hellfeldmikroskopie, um Bilder von repräsentativen Teilen der resorbiert Fläche zu nehmen.
- Mit Bildanalyse-Software, die Berechnung der Prozentanteil der resorbierten Oberfläche für die Quantifizierung der Osteoklasten Resorptionsaktivität ermöglichen.
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Representative Results
Das Ziel dieses Verfahrens war die einfache Isolierung einer großen Anzahl von Osteoklasten in vitro, typischerweise in einer Woche. Erfolgreiche Isolierung einer großen Anzahl von Osteoklasten wurde mit Tartrat-resistente saure Phosphatase-Färbung (1A) bestätigt. Große Osteoklasten werden als große, violette Zellen mit mehreren Kernen (typischerweise ≥ 3 Kerne) visualisiert. Unter Verwendung dieses Protokolls ist es üblich, Osteoklasten mit nicht weniger als 30 Keime pro Osteoklasten (1B) zu isolieren.
Verwendung eines mineralisierten Oberfläche als der Goldstandard Verfahren zur Beurteilung Osteoklasten resorptive Aktivität in vitro. Unter Verwendung dieses Verfahrens ermöglicht die Bestimmung der Osteoklasten Resorptionsfähigkeit (Figur 2) der Prozentsatz der mineralisierten Oberfläche oder "Resorptionsgruben", die sich gebildet haben.
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Abbildung 1. (A) Tartrat-resistente saure Phosphatase-Färbung der kultivierten Knochenmark darauf folgenden 10 Tagen in Kultur unter Osteoklasten induktiven Bedingungen. Hellfeldaufnahme bei 10-facher Vergrößerung zeigt mehrere große, mehrkernige Osteoklasten, die TRAP sind positiv (lila Färbung). Ein Beispiel eines großen, mehrkernige Osteoklasten wird durch eine rote gestrichelte Linie (B) Hellfeldaufnahme bei 10-facher Vergrößerung zeigen, eine große, mehrkernige, TRAP positive Osteoklasten beschrieben.. Ein Beispiel für einen Kern innerhalb einer mehrkernigen Osteoklasten wird durch den roten Pfeil angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Hellfeldaufnahme bei 10-facher Vergrößerung zeigt Resorptionsgruben durch osteoklastische Resorptionsaktivität gebildet. Die mineralisierten Matrix mit Von Kossa-Färbung angefärbt, um zur Visualisierung ermöglichen. Die schwarze gestrichelte Linien skizzieren ein Beispiel resorbiert Bereichen Matrix. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Eine Fähigkeit, leicht zu isolieren und zu kultivieren eine große Zahl von Osteoklasten in vitro wurde für die Hilfe, Verständnis für Knochenbiologie und Osteoklasten-vermittelten Krankheiten voranzutreiben verantwortlich. Es war die Identifizierung von RANKL, die zu diesem führen, als es vor kurzem als Hauptregulator der Osteoklastenbildung, Differenzierung und das Überleben von 16 bis 18 identifiziert.
Es ist unsere Erfahrung, dass die in vitro-Kultivierung von Osteoklasten aus Knochenmark ist weitgehend abhängig von Aussaatdichte. Wir beobachteten, dass Scheitern dieses Protokoll zu Osteoklasten Ausbeute ist in der Regel aufgrund einer suboptimalen Aussaatdichte beim Plattieren Knochenmark stammenden Zellen. Somit wird in diesem Protokoll ist es empfehlenswert, 200.000 Zellen pro 24-Well-Platte und Samen. Darüber hinaus, um den maximalen Erfolg mit dieser Technik zu erreichen, empfiehlt es sich, die Osteoklasten-Induktionsmedien genau vorbereiten wie oben und die Medien an der s ändern beschriebename Zeit jeden Tag, nach den ersten 3 Tage, wenn man nicht brauchen, um die Kulturplatten stören. Dies kann eine konstante Konzentration der Osteoklasteninduktionsmedium Faktoren ermöglichen. Zusätzlich haben wir gefunden, dass die Verwendung von spezifischen Reagenzien können auch ein größeres Potenzial für die Kultivierung einer großen Zahl von vielkernigen Osteoklasten.
Diese Technik wird von der Verfügbarkeit eines RT-Zentrifuge, in dem man Beschleunigungs- und Verzögerungsparameter und Beschaffung von spezifischen Reagenzien verändern beschränkt. Sonst ist es ein sehr einfacher Protokoll, mit dem wir sehr erfolgreich in einem Bereich von Mäusen mit unterschiedlichen Alters und genetischen Hintergrund hat, (beispielsweise C57BL / 6, CD1, NOD-SCID, Lep db - / -).
Diese Technik bietet eine zuverlässige Methode, um die Osteoklasten in vitro zu erzeugen, und ihrer Fähigkeit, mineralisierte Matrix resorbieren bestimmen. Mit diesem Protokoll ist es möglich, eine große Anzahl von mehrkernigen Osteoklasten in vitr isoliereno typischerweise in einer Woche. Unsere Erfahrung ist, dass Osteoklasten Isolation und in-vitro-Kultur mit zuvor veröffentlichten Techniken resultiert in sehr variablen Ergebnisse in Bezug auf Osteoklasten Produktion, was häufig zu einer Unfähigkeit, Osteoklasten 9,12,14 kultivieren.
Osteoklasten-Funktion ist komplex und Knochenresorption ist ein hoch orchestrierten Prozess, der auf der lokalen Ebene durch Übersprechen zwischen Osteoblasten und Osteoklasten 19 vermittelt wird. Neben lokalen Kontrolle von Knochenbilanz, Emerging Hinweise darauf, dass die Aktivität der Osteoklasten wird systemisch durch Faktoren, die Immun, neuronale und andere systematische Faktoren 20-24 bezogen geregelt.
Da das Verständnis der Osteoklasten Biologie weiterhin schnell vorankommen und auch ihre vielfältigen Rolle in Prozesse von der Knochenumbau, ihre Rolle bei der Regulierung der Krebs Metastasen in Knochen 25-27, wird dieses Protokoll den Forschern ermöglichen, bestehenständig zu isolieren große Mengen von Osteoklasten in vitro.
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Disclosures
Keiner der Autoren hat Offenlegung oder Interessenkonflikt zu erklären.
Acknowledgments
Wir erkennen die Unterstützung der NIH Zuschüsse R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, The Oak Foundation und das Hagey Labor für Pädiatrische Regenerative Medizin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
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