Summary
Osteoclasts शरीर में प्रिंसिपल हड्डी-resorbing सेल हैं. बड़ी संख्या में osteoclasts को अलग करने की क्षमता अस्थिशोषक जीव विज्ञान की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है. इस प्रोटोकॉल में, हम खेती और इन विट्रो में अस्थिशोषक गतिविधि बढ़ाता, अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन.
Abstract
Osteoclasts अस्थि मज्जा की monocyte / बृहतभक्षककोशिका वंश से प्राप्त कर रहे हैं कि अति विशिष्ट कोशिकाओं रहे हैं. हड्डी के कार्बनिक और अकार्बनिक matrices के दोनों resorb को अपने अद्वितीय क्षमता है कि वे कंकाल remodeling के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं कि इसका मतलब है. साथ में, अस्थिकोरक और osteoclasts अस्थि अवशोषण और स्वास्थ्य और बीमारी के दौरान सामान्य कंकाल बनाए रखने के लिए एक साथ अभिनय हड्डी गठन दोनों शामिल है कि गतिशील युग्मन प्रक्रिया के लिए जिम्मेदार हैं.
शरीर में प्रिंसिपल हड्डी-resorbing सेल के रूप में, अस्थिशोषक भेदभाव या समारोह में परिवर्तन शरीर में गहरा प्रभाव में परिणाम कर सकते हैं. बदल अस्थिशोषक समारोह के साथ जुड़े रोगों और आमतौर पर इस तरह के अत्यधिक osteoclastic अस्थि अवशोषण गठन फ्रैक्चर को predisposes जिसमें ऑस्टियोपोरोसिस, के रूप में विकृतियों मनाया के कारण hematopoiesis के लिए एक मज्जा अंतरिक्ष के लिए फार्म की विफलता के लिए घातक नवजात रोग से गंभीरता में लेकर कर सकते हैं.
ईएनटी "> इन विट्रो में उच्च संख्या में osteoclasts को अलग करने की क्षमता हड्डी remodeling के चक्र को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति के लिए अनुमति दी गई है और इन बीमारियों से निपटने कि उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों की खोज के लिए मार्ग प्रशस्त किया है.यहाँ, हम अलग और osteoclasts की बड़ी संख्या निकलेगा कि माउस अस्थि मज्जा से osteoclasts खेती करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Introduction
हड्डी remodeling गतिशील है और अस्थि अवशोषण 1 के साथ हड्डी गठन के युग्मन शामिल है. इस कसकर विनियमित प्रक्रिया सामान्य समस्थिति दौरान कंकाल को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार है, और चोट और बीमारी के जवाब में.
Osteoclasts हड्डी के कार्बनिक और अकार्बनिक matrices के दोनों resorbing में सक्षम हैं कि अद्वितीय, multinucleated कोशिकाओं रहे हैं. Osteoclasts अस्थि मज्जा 2-5 की monocyte / बृहतभक्षककोशिका वंश से निकाली गई है. Osteoclasts के समारोह या गठन में असामान्यताएं ऑस्टियोपोरोसिस की तरह आम शर्तों सहित नैदानिक विकृतियों की एक किस्म में परिणाम कर सकते हैं.
इन विट्रो में osteoclasts उत्पन्न करने की क्षमता हड्डी जीव विज्ञान 6 के बारे में हमारी समझ में महत्वपूर्ण प्रगति के लिए अनुमति दी गई है. नतीजतन, नई चिकित्सकीय एजेंटों 7 महत्वपूर्ण रुग्णता और मौत के लिए जिम्मेदार हैं जो अस्थिशोषक से संबंधित रोगों के इलाज के लिए उभर रहे हैं 8,9 की ठोस कार्रवाई की आवश्यकता है. अस्थि समस्थिति जिसमें अस्थिशोषक गतिविधि हड्डी द्रव्यमान और घनत्व 10 से रोगजनक नुकसान होता वृद्धि हुई है, रजोनिवृत्ति ऑस्टियोपोरोसिस सहित रोगों के एक नंबर में बदल दिया है. मानव रोग के ट्रांसजेनिक murine मॉडल की उपलब्धता में वृद्धि के साथ, मानव हड्डी रोग 11-13 में osteoclasts की भूमिका समझने के लिए अधिक अवसर है.
कई रूपों 9,12,14 वर्णित साथ अस्थिशोषक संवर्धन तकनीक के लिए कई प्रोटोकॉल, साहित्य में दिखाई देते हैं. ज़िंग और सहयोगियों murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं से osteoclastogenic assays के उनके वर्णन में, नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के समान पद्धति का वर्णन. हालांकि लंबी हड्डी फसल निम्नलिखित अस्थि मज्जा कोशिकाओं को रिहा करने, जिंग एट अल. Α सदस्य पूरा मीडिया के साथ मज्जा गुहा फ्लश14. Catalfamo, अस्थिशोषक समारोह पर ह्य्पेरग्ल्य्समिया के प्रभाव की जाँच और सभी कोशिकाओं अस्थि मज्जा निस्तब्धता द्वारा जुटाए जिसमें एक विधि है, जिस पर गैर-पक्षपाती कोशिकाओं 12 खारिज कर रहे हैं इंगित, 24 घंटा के लिए संवर्धित कर रहे हैं का वर्णन भी बॉयल एट अल द्वारा इस्तेमाल तकनीक 9. ये पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल एक हड्डी के दोनों सिरों में कटौती करनी चाहिए के रूप में भी, एक सुई छड़ी चोट और मूल्यवान अस्थि मज्जा की हानि के जोखिम का परिचय जो अस्थि मज्जा, एक थकाऊ अभ्यास, निस्तब्धता के अभ्यास की जरूरत. हम वर्णन जो प्रोटोकॉल, Weischenfeldt एट अल द्वारा वर्णित बृहतभक्षककोशिका अलगाव की विधि के समान है जो osteoclasts अलग करने के लिए एक मोर्टार और मूसल का उपयोग, लागू करता है. 15
हमारा अनुभव है, हालांकि, अक्सर, जिसके परिणामस्वरूप अस्थिशोषक उत्पादन के मामले में चर परिणामों में पहले प्रकाशित तकनीक परिणामों का उपयोग कि अस्थिशोषक अलगाव और इन विट्रो संस्कृति में हैएक असमर्थता में osteoclasts खेती करने के लिए. इसलिए, हम की उपस्थिति में शुरू में मैक्रोफेज और बाद में osteoclasts बनाने चढ़ाया कोशिकाओं के 70-80% की एक अनुमानित उपज के साथ इन विट्रो में multinucleated osteoclasts की बड़ी संख्या, निर्माण करने के लिए माउस अस्थि मज्जा के अनुरूप अलगाव के लिए अनुमति देता है कि एक प्रोटोकॉल तैयार कर लिया है अस्थिशोषक प्रेरण मीडिया.
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Protocol
नोट: एथिकल बयान: हड्डीवाला जानवरों से जुड़े सभी अनुसंधान प्रयोगशाला पशु की देखभाल पर स्टैनफोर्ड प्रशासनिक पैनल (APLAC) द्वारा अनुमोदित अनुसार प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया गया था.
1. तैयारी
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घनत्व ढाल सेल जुदाई मीडिया के 10 एमएल एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में आर टी करने के लिए आने के लिए (polysucrose और सोडियम diatrizoate जिसमें, 1.077 ग्राम / मिलीलीटर की एक घनत्व के लिए समायोजित) की अनुमति.
- फ्लो तैयार (FACS) 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और 2% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ बफर. एक 50 मिलीलीटर विभाज्य लो और घनत्व ढाल सेल जुदाई मीडिया चरण के दौरान इस्तेमाल के लिए आरटी पर इस विभाज्य बनाए रखें.
- अलगाव की प्रक्रिया के दौरान में पृथक ऊतक और कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए तैयार बर्फ की एक बाल्टी है.
2. संस्कृति मीडिया की तैयारी
- बेसल मीडिया तैयार: सदस्य (न्यूनतम आवश्यक मध्यम), फिनोल लाल (500 मिलीलीटर), ग्लूटामेट (1x) के बिना, एफसीएस (10x), 10,000 इकाइयों / मिलीलीटर penicilliN (1x).
- 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ बेसल मीडिया फिल्टर.
- अस्थि मज्जा मैक्रोफेज प्रेरण मीडिया तैयार करें:
- 2.1 कदम में तैयार बेसल मीडिया के 50 मिलीलीटर ले लो.
- 10 -7 एम अंतिम एकाग्रता में प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (PGE2, श्री 352.465 छ / mol) जोड़ें.
- 10 एनजी / एमएल पर बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर (एम-सीएसएफ) जोड़ें.
- मीडिया उत्तेजक अस्थि मज्जा मैक्रोफेज का अंतिम समाधान फ़िल्टर न करें.
- अस्थिशोषक प्रेरण मीडिया तैयार करें:
- 2.1 कदम में तैयार बेसल मीडिया के 50 मिलीलीटर ले लो.
- जोड़ें 10 -7 एम अंतिम एकाग्रता में प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (PGE2, श्री 352.465 छ / mol)
- 10 एनजी / एमएल पर बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर (एम-सीएसएफ) जोड़ें.
- 10 एनजी / एमएल पर RANKL जोड़ें.
- अस्थिशोषक प्रेरण मीडिया का अंतिम समाधान फ़िल्टर न करें.
3. अस्थि मज्जा अलगाव
- एक C57BL 6 / माउस Euthanizeग्रीवा अव्यवस्था के बाद कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना विधि का उपयोग करते हुए.
नोट: चूहे उपयुक्त तकनीक, उपकरण और एजेंटों का उपयोग करते हुए प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा euthanized किया जाना चाहिए. - स्थिति एक विच्छेदन बोर्ड पर माउस सुरक्षित और 70% शराब के साथ स्प्रे और.
- Femurs, tibiae, humeri और रीढ़ की हड्डी काटना.
- लापरवाह स्थिति में माउस के साथ शुरू करो. खड़ी कम अंग के साथ एक चीरा और कोमल ऊतकों संलग्नक विभाजित करके फीमर और टिबिया की लंबाई के साथ विदारक से शुरू करते हैं. अंत में, कंकाल से पूरी तरह से हड्डियों मुक्त करने के लिए घुटने और कूल्हे से हड्डियों हटाना.
- प्रगंडिका अलग करने के लिए ऊपरी अंग की लंबाई के साथ एक चीरा बनाने के लिए आगे बढ़ें. नरम ऊतक सम्पुटी लगाव विदारक से कंधे और कोहनी जोड़ों में प्रगंडिका हटाना.
- माउस का खतरा निहित है, ताकि अंत में, पर माउस बदल जाते हैं. Midline में, रीढ़ की हड्डी की लंबाई के साथ एक त्वचा चीरा. Paravertebral मुलायम निरीक्षणparavertebral नरम ऊतक जन के माध्यम से विदारक रीढ़ की हड्डी बढ़त के साथ रीढ़ की हड्डी और काटना के प्रत्येक पक्ष पर ऊतक,. एक कैंची का प्रयोग, गर्दन के आधार पर रीढ़ भर में एक क्षैतिज काट कर, और नरम ऊतक लगाव से रीढ़ मुक्त रीढ़, पूंछ प्रविष्टि के लिए सिर्फ समीपस्थ, के अंत में.
- हड्डियों काटा जाता है एक बार, बर्फ पर FACS बफर में उन्हें रखने के लिए.
- हड्डियों से मांसपेशियों और कोमल ऊतकों को साफ करने के लिए टिशू पेपर का प्रयोग करें.
- FACS बफर के 3 मिलीलीटर के साथ एक मूसल और मोर्टार में साफ हड्डियों रखें.
- मूसल और मोर्टार में धीरे हड्डियों को कुचलने.
- एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से समाधान से गुजर रहा एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में खून से सना हुआ तरल पदार्थ और हस्तांतरण बंद महाप्राण.
- 5 मिलीलीटर FACS के कुचल हड्डी करने के लिए बफर और आगे कुचलने जोड़ें. फिर, एक पिपेट का उपयोग तरल पदार्थ को हटाने और एक 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए स्थानांतरण.
- आमतौर पर हड्डियों ट्वी कुचलनेताजा FACS बफर में तीन बार, द्रव लाल दाग नहीं है, जब तक एक मोर्टार और मूसल, ताजा FACS बफर का एक और 5 मिलीलीटर जोड़ने हर समय का उपयोग करने के लिए सीई.
- एक सेल गोली उपज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर अस्थि मज्जा समाधान अपकेंद्रित्र.
अस्थि मज्जा की कोशिकाओं की 4. ढाल पृथक्करण
- FACS बफर के 10 एमएल में सतह पर तैरनेवाला और resuspend Aspirate (आरटी पर बनाए रखा).
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घनत्व ढाल सेल जुदाई मीडिया (आरटी) के 10 मिलीलीटर युक्त 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ले लो.
- घनत्व ढाल सेल जुदाई मीडिया पर अस्थि मज्जा समाधान परत. धीरे-धीरे एक बिजली पिपेट का उपयोग कर यह मत करो. कोण पिपेट शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष के निकट भीतरी सतह के खिलाफ टिप और के बारे में 30 डिग्री के लिए शंक्वाकार ट्यूब झुकाव. घनत्व ढाल सेल जुदाई मीडिया को परेशान करने के लिए नहीं के रूप में तो पिपेट पर एक धीमी गति सेटिंग का प्रयोग, धीरे अस्थि मज्जा समाधान निष्कासित.
नोट: अंत में वहाँ होगादो समाधान (सेलुलर समाधान और घनत्व ढाल सेल जुदाई मीडिया समाधान) के बीच एक स्पष्ट परिभाषा हो. - एक आर टी सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करना, 15 मिनट के लिए 200 XG पर एक संतुलित अपकेंद्रित्र में घनत्व ढाल सेल जुदाई मीडिया और सेल समाधान अपकेंद्रित्र. इसके अलावा, घनत्व ढाल सेल जुदाई मीडिया ढाल का उपयोग पर्याप्त चरण जुदाई सुनिश्चित करने के लिए सेंट्रीफ्यूज पर त्वरण और मंदी को दूर.
- Centrifugation के बाद, ब्याज की अस्थि मज्जा कोशिकाओं जिसमें बादल मध्यम परत बंद महाप्राण.
- एक नए शंक्वाकार ट्यूब में इन कोशिकाओं का स्थानांतरण. कोशिकाओं को धोने के लिए (बर्फ पर रखा) अतिरिक्त FACS बफर के 20 मिलीलीटर जोड़ें.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र एक सेल गोली उपज.
- एक hemocytometer का उपयोग सेल गिनती के लिए अनुमति देने के लिए मीडिया उत्तेजक बृहतभक्षककोशिका की 1ml में अंतिम सेल गोली Resuspend.
5. सेल गिनती
- सेल समाधान के 10 μl ले लो और मिश्रणtrypan नीले रंग के 10 μl के साथ. लोड परिणामी मिश्रण के 10 μl एक hemocytometer पर और समाधान के मिलीलीटर प्रति सेल गिनती प्राप्त करते हैं.
6. सेल संवर्धन
- 24 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में बृहतभक्षककोशिका उत्तेजक मीडिया के 2 मिलीलीटर रखें.
- प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 200,000 कोशिकाओं जोड़ें.
नोट: हमारे अनुभव में, सेल चढ़ाना घनत्व osteoclasts की इन विट्रो संवर्धन में पर्याप्त के लिए सबसे महत्वपूर्ण आवश्यकताओं में से एक है. - धीरे 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नियमित इनक्यूबेटर में थाली और जगह आंदोलन.
- 3 दिन के लिए मीडिया को मत बदलो.
- बृहतभक्षककोशिका उत्तेजक मीडिया में 3 दिनों के बाद, अस्थिशोषक मीडिया के लिए मीडिया बदलें.
- इसके बाद, बिंदु, बड़े, multinucleated osteoclasts संस्कृति प्लेट पर दिखाई जानी चाहिए, जिस पर 5-7 दिनों के लिए दैनिक मीडिया बदल जाते हैं.
7. धुंधला के साथ Tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप)
- इन विट्रो संस्कृति के 5-7 दिनों के बादसंरचना, अच्छी तरह से संस्कृति से मीडिया महाप्राण.
- 1x पीबीएस तीन बार के साथ धीरे कुओं धो लें.
- 4% paraformaldehyde समाधान जोड़कर कोशिकाओं को ठीक और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए छोड़ दें.
- इस समय के दौरान, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व वार्मिंग से (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है) जाल दाग तैयार करते हैं.
- Paraformaldehyde में 1 घंटे के बाद, paraformaldehyde के बंद महाप्राण और 1x पीबीएस के साथ धीरे 3 बार धोएं.
- थाली के प्रत्येक कुएं में पूर्व गर्म जाल दाग के 1 मिलीलीटर जोड़ें दाग होंगे.
- प्रकाश से परिरक्षित 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में प्लेट रखें.
- 1 घंटे बाद, जाल दाग बंद महाप्राण.
- पूर्व गर्म विआयनीकृत पानी के साथ कुओं 3 बार धोएं.
- 1-2 मिनट के लिए गिल की Hematoxylin (सतर्कता) के साथ अच्छी तरह से Counterstain.
- उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि osteoclasts.
- दाग की एक पर्याप्त रंग तीव्रता तक विआयनीकृत पानी से कुओं धो नाभिक Blu प्रकट आम तौर पर, जब हासिल की हैई.
8. अस्थिशोषक अवशोषण परख
- हड्डी सब्सट्रेट या एक अकार्बनिक क्रिस्टलीय कैल्शियम फॉस्फेट कोटिंग के साथ या तो पूर्व में लिपटे है कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 24 अच्छी तरह से योग्य polystyrene संस्कृति पकवान का प्रयोग करें.
- प्रत्येक कुएं में बृहतभक्षककोशिका उत्तेजक मीडिया के 2 मिलीलीटर रखें.
- प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए चरण 2 के अंत में प्राप्त 200.000 हौसले से अलग अस्थि मज्जा कोशिकाओं जोड़ें.
- धीरे 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में इसे रखने से पहले थाली आंदोलन.
- 3 दिन, अस्थिशोषक भेदभाव मीडिया के लिए मीडिया बदलें.
- 5-7 दिनों के लिए अस्थिशोषक भेदभाव मीडिया के साथ दैनिक मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन करना.
अस्थिशोषक अवशोषण गतिविधि का 9. मात्रा
- नीचे वर्णित के रूप में एक mineralized सब्सट्रेट पर अस्थिशोषक भेदभाव मीडिया में इन विट्रो संस्कृति के 5-7 दिनों के बाद, resorpti फार्म को osteoclasts की क्षमता का आकलन करने के लिए, mineralized सतह का विश्लेषणगड्ढ़े, osteoclastic गतिविधि का एक संकेतक पर.
- अवशोषण परख थाली से महाप्राण मीडिया और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 10% ब्लीच समाधान के 100 μl जोड़ें.
- आरटी पर 15 मिनट के लिए 10% ब्लीच समाधान के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
- आसुत जल के साथ कुओं 3 बार धोएं.
- किसी भी शेष पानी बंद Aspirate और थाली से अतिरिक्त पानी बंद मिलाने और 3-5 घंटे के लिए शुष्क हवा की अनुमति देते हैं.
- एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वॉन Kossa धुंधला किट के साथ थाली Counterstain संयुक्त राष्ट्र resorbed सब्सट्रेट की आसान दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए.
- Resorbed सतह के प्रतिनिधि भागों का चित्र लेने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करें.
- छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग, osteoclastic resorptive गतिविधि की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देने के लिए resorbed सतह के प्रतिशत की गणना.
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Representative Results
इस पद्धति का लक्ष्य आसानी से एक सप्ताह में आम तौर पर, इन विट्रो में osteoclasts की बड़ी संख्या को अलग करने के लिए था. Osteoclasts की बड़ी संख्या के सफल अलगाव Tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट धुंधला (चित्रा 1 ए) का उपयोग कर पुष्टि की गई. बड़े osteoclasts कई नाभिक (आमतौर पर ≥ 3 नाभिक) के साथ बड़े बैंगनी कोशिकाओं के रूप में कल्पना कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, यह अस्थिशोषक प्रति के रूप में कई के रूप में 30 नाभिक (चित्रा 1 बी) के साथ osteoclasts अलग करने के लिए आम है.
एक mineralized सतह का प्रयोग इन विट्रो में अस्थिशोषक resorptive गतिविधि का आकलन करने के स्वर्ण मानक पद्धति माना जाता है. इस पद्धति का प्रयोग, का गठन किया है कि mineralized सतह का प्रतिशत, या "अवशोषण गड्ढ़े" अस्थिशोषक resorptive क्षमता का निर्धारण (चित्रा 2) के लिए अनुमति देता है.
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अस्थिशोषक प्रेरक परिस्थितियों में संस्कृति में 10 दिनों के लिए निम्न संवर्धित अस्थि मज्जा की संख्या 1 (ए) Tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट धुंधला हो जाना. 10X बढ़ाई उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोग्राफ सकारात्मक (बैंगनी धुंधला) जाल हैं कि कई बड़े, multinucleated osteoclasts दर्शाता है. एक बड़े, multinucleated अस्थिशोषक का एक उदाहरण एक लाल धराशायी लाइन द्वारा उल्लिखित है. (बी) उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोग्राफ एक बड़े, multinucleated, जाल सकारात्मक अस्थिशोषक प्रदर्शन 10X बढ़ाई. एक multinucleated अस्थिशोषक भीतर एक नाभिक का एक उदाहरण लाल तीर द्वारा दिखाया गया है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
10X बढ़ाई चित्रा 2. उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोग्राफ osteoclastic अवशोषण गतिविधि द्वारा गठित अवशोषण गड्ढों को दर्शाता है. Mineralized मैट्रिक्स दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए वॉन Kossa दाग से सना हुआ है. काले लाइनों मैट्रिक्स की resorbed क्षेत्रों का एक उदाहरण रूपरेखा धराशायी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
आसानी से इन विट्रो में osteoclasts की बड़ी संख्या को अलग करने और खेती करने की क्षमता हड्डी जीव विज्ञान और अस्थिशोषक की मध्यस्थता रोगों की समझ के अग्रिम की मदद करने के लिए जिम्मेदार है. यह हाल ही में अस्थिशोषक गठन, भेदभाव और अस्तित्व 16-18 के प्रमुख नियामक के रूप में पहचान की थी जब यह इस लिए है कि नेतृत्व RANKL की पहचान थी.
यह अस्थि मज्जा से osteoclasts की इन विट्रो खेती बोने घनत्व पर निर्भर है कि हमारे अनुभव रहा है. हम अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं चढ़ाना जब osteoclasts उपज के लिए इस प्रोटोकॉल की विफलता एक suboptimal बोने घनत्व के लिए आम तौर पर कारण है कि मनाया. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में, यह अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह से थाली प्रति 200,000 कोशिकाओं बीज के लिए सिफारिश की है. इसके अलावा, इस तकनीक के साथ अधिकतम सफलता प्राप्त करने के क्रम में, यह ठीक अस्थिशोषक प्रेरण मीडिया तैयार करने के लिए सिफारिश की है ऊपर और एस में मीडिया को बदलने के लिए वर्णित के रूप मेंAME समय प्रत्येक दिन, प्रारंभिक 3 दिनों के बाद एक संस्कृति प्लेटों को परेशान करने की जरूरत नहीं है जब. इस अस्थिशोषक प्रेरण मीडिया कारकों में से एक निरंतर एकाग्रता अनुमति दे सकता है. इसके अलावा, हम विशिष्ट अभिकर्मकों का उपयोग भी multinucleated osteoclasts की बड़ी संख्या के संवर्धन के लिए अधिक से अधिक क्षमता की अनुमति देता है कि मिल गया है.
इस तकनीक को एक त्वरण और मंदी मापदंडों और विशिष्ट अभिकर्मकों की खरीद को बदल सकते हैं, जिसमें एक आर टी अपकेंद्रित्र, की उपलब्धता सीमित है. यह अन्यथा हम उम्र और आनुवंशिक पृष्ठभूमि भिन्न की चूहों की एक श्रृंखला में, ज्यादा सफलता मिली है, जिसके साथ एक बहुत ही सरल प्रोटोकॉल, है (उदाहरण के लिए, C57BL 6 /, CD1, मंजूरी SCID, एलईपी DB - / -).
इस तकनीक इन विट्रो में osteoclasts उत्पन्न करने के लिए और mineralized मैट्रिक्स resorb करने की क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, यह vitr में multinucleated osteoclasts की बड़ी संख्या को अलग करने के लिए संभव हैओ आम तौर पर एक सप्ताह में. हमारा अनुभव अस्थिशोषक अलगाव और इन विट्रो संस्कृति में अक्सर osteoclasts 9,12,14 खेती करने में असमर्थता, जिसके परिणामस्वरूप अस्थिशोषक उत्पादन के मामले में अत्यधिक चर परिणामों में पहले प्रकाशित तकनीक परिणामों का उपयोग करता है.
अस्थिशोषक समारोह जटिल है और अस्थि अवशोषण अस्थिकोरक और osteoclasts 19 के बीच क्रॉस-टॉक के लिए स्थानीय स्तर पर मध्यस्थता है कि एक अत्यधिक करवाया प्रक्रिया है. हड्डी संतुलन की स्थानीय नियंत्रण के अलावा, सबूत उभर अस्थिशोषक गतिविधि प्रतिरक्षा, न्यूरोनल, और अन्य व्यवस्थित कारकों 20-24 से संबंधित कारकों से प्रणालीबद्ध नियंत्रित होता है कि पता चलता है.
अस्थिशोषक जीव विज्ञान की समझ हड्डी 25-27 को कैंसर मेटास्टेसिस को विनियमित करने में उनकी भूमिका के लिए हड्डी remodeling से लेकर प्रक्रियाओं में उनके विविध भूमिका सहित, तेजी से अग्रिम करने के लिए जारी है, इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं मिलकर करने की अनुमति देगाently विट्रो में osteoclasts की बड़ी मात्रा को अलग.
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Disclosures
लेखकों में से कोई भी घोषणा करने के लिए प्रकटीकरण या ब्याज का संघर्ष है.
Acknowledgments
हम एनआईएच अनुदान R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, ओक फाउंडेशन और बाल चिकित्सा पुनर्योजी चिकित्सा के लिए Hagey प्रयोगशाला के समर्थन को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
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