Summary
破骨細胞は、体内の主要な骨吸収細胞である。大量に破骨細胞を単離する能力は、破骨細胞の生物学の理解における大きな進歩をもたらした。このプロトコルでは、培養し、インビトロで破骨細胞活性を定量化する、単離するための方法を記載する。
Abstract
破骨細胞は骨髄の単球/マクロファージ系統から誘導された高度に特殊化した細胞である。骨の有機および無機マトリックスの両方を再吸収する独自の能力は、それらが骨リモデリングの調節において重要な役割を果たしていることを意味する。一緒に、骨芽細胞および破骨細胞は骨吸収と健康と病気の間、正常な骨格を維持するために一緒に働く骨形成の両方を伴う動的結合プロセスに関与している。
体内の主要な骨吸収細胞としては、破骨細胞の分化または機能の変化は、体内で顕著な効果をもたらすことができる。改変された破骨細胞の機能に関連する疾患は、より一般的に過剰な破骨細胞骨吸収が形成を破砕するために罹りやすくする骨粗鬆症などの病態を観察することにより、造血のための骨髄空間を形成する失敗に致死性新生児疾患の重症度の範囲とすることができる。
ENT "> in vitroで高い数字で破骨細胞を単離する能力は、骨リモデリングサイクルを理解する上で大きな進歩を可能にしたこれらの疾患と闘う新たな治療戦略の発見のための道を開いてきた。ここでは、隔離し、破骨細胞の多数が得られるマウス骨髄からの破骨細胞を育成するためのプロトコルを記述します。
Introduction
骨リモデリングは動的であり、骨吸収の1骨形成のカップリングを含む。この緊密に調節されたプロセスは、通常の恒常性の間に、そして怪我や病気に応じて骨格を維持する責任がある。
破骨細胞は、骨の有機および無機マトリックスの両方を再吸収することができるユニークな多核細胞である。破骨細胞は、骨髄2-5の単球/マクロファージ系統に由来するものである。破骨細胞の機能または形成の異常は、骨粗しょう症のような一般的な条件を含む臨床病理、さまざまな可能性があります。
in vitroで破骨細胞を生成する能力は、骨の生物学6の我々の理解における大きな進歩を可能にした。その結果、新たな治療薬は、かなりの罹患率および死亡率の原因である破骨細胞関連疾患を治療するために出現している7 8,9の協調行動が必要です。骨ホメオスタシス、骨質量および密度10の病原性の喪失をもたらす破骨細胞活性を増加させた閉経後骨粗鬆症を含む多くの疾患、変更される。ヒト疾患のトランスジェニックマウスモデルの利用の増加に伴い、人間の骨疾患11-13における破骨細胞の役割を解読するためのより多くの機会がある。
多くのバリエーションが9,12,14を記載して破骨細胞培養技術のための多数のプロトコルが、文献に現れる。興らは、マウスの骨髄細胞からの破骨細胞形成アッセイの彼らの説明では、以下に記載されるプロトコルに類似した方法論を説明します。しかし、長骨の収穫次骨髄細胞を解放するために、興ら α-MEM完全培地で骨髄腔をフラッシュ14。Catalfamoは破骨細胞機能における高血糖の影響を調べ、骨髄フラッシングによって動員され、すべての細胞は、非接着細胞を12に廃棄され、その時点で24時間、また、ボイルらによって使用される技術のために培養される方法が記載されている9これらの以前に公表されたプロトコルは、1つの骨の両端を切断しなければならないように、また、貴重な骨髄の針刺し損傷および損失の危険を誘発退屈練習を、骨髄をフラッシュするの練習を必要とする。我々が説明するプロトコルは、Weischenfeldt らによって記載マクロファージの単離方法と同様である破骨細胞を単離するための乳鉢と乳棒の使用を実装しています。15
我々の経験では、しかし、多くの場合、その結果、破骨細胞の産生の点で可変転帰における以前に公表された技法の結果を使用して、その破骨細胞の単離およびインビトロ培養物中に存在する破骨細胞を育てることができないことで。したがって、我々は、最初の存在下で、マクロファージ、続いて破骨細胞を形成するメッキされた細胞の70〜80％のおおよその収率で、in vitroで多核破骨細胞の多数を生成するために、マウス骨髄の一貫した分離を可能にするプロトコルを考案した破骨細胞誘導培地。
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Protocol
注：倫理声明：脊椎動物に関わるすべての研究は実験動物管理（APLAC）にスタンフォード紛争処理パネルにより承認に従ってプロトコルで実施した。
1.準備
- （1.077グラム/ mlの密度に調整したポリスクロースおよびジアトリゾ酸ナトリウムを含んでいる）市販の密度勾配細胞分離培地10mlを50mlコニカルチューブにRTに来ることを可能にする。
- フローサイトメトリー（FACS）は、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、2％ウシ胎児血清（FCS）を用いて緩衝液を準備。の50mlアリコートを取り、密度勾配細胞分離培地工程の間に使用するために、RTで、このアリコートを維持する。
- 単離手順の間に単離された組織や細胞を維持する準備ができた氷のバケツを持っている。
2.文化メディアを準備します
- 基礎培地を準備します。MEM（最小必須培地）、フェノールレッド（500ミリリットル）、グルタミン酸（1×）、FCS（10倍）、10,000単位/ mlのpenicilliなしn個（1×）。
- 0.22μmのフィルターで基本培地をフィルタリングします。
- 骨髄マクロファージ誘導培地を準備します。
- ステップ2.1で調製した基礎培地の50ミリリットルを取る。
- 10 -7 Mの最終濃度で、プロスタグランジンE2（PGE2、ミスター352.465グラム/モル）を追加します。
- を10ng / mlでマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を追加します。
- メディアを刺激骨髄マクロファージの最終的な解決をフィルタリングしないでください。
- 破骨細胞誘導培地を準備します。
- ステップ2.1で調製した基礎培地の50ミリリットルを取る。
- 追加10 -7 Mの最終濃度で、プロスタグランジンE2（PGE2氏352.465グラム/モル）
- を10ng / mlでマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を追加します。
- を10ng / mlでRANKLを追加します。
- 破骨細胞誘導培地の最終的な解決をフィルタリングしないでください。
3.骨髄の単離
- 1 C57BL / 6マウスを安楽死させる頸椎脱臼に続く二酸化炭素吸入法を用いて。
注：げっ歯類は、適切な技術、機器や薬剤を使用訓練を受けた者が安楽死させなければなりません。 - 位置及び解剖ボード上でマウスを固定し、70％アルコールで噴霧する。
- 大腿骨、脛骨、上腕骨と背骨を解剖する。
- 仰臥位でマウスで始まる。縦に下肢に沿って切開を行い、軟部組織の添付ファイルを分割することによって大腿骨と脛骨の長さに沿って切開することから始めます。最後に、スケルトンから完全に自由な骨に膝と股関節から骨を脱臼。
- 上腕骨を分離するために上肢の長さに沿って切開を作るために進んでください。軟組織の莢添付ファイルを解剖することによって、肩と肘の関節での上腕骨を脱臼。
- マウスが発生しやすい位置するように最後に、マウスを裏返します。正中線で、背骨の長さに沿って皮膚切開を行います。傍脊椎ソフトを観察脊椎の骨縁に沿って脊椎および切開の各側の組織、傍脊椎軟組織塊を通って解剖する。はさみを使って、首の付け根に背骨全体に水平カットを行い、背骨の終わりに、テール挿入のすぐ近位、軟組織の添付ファイルから背骨を解放する。
- 骨が収穫された後、氷上でFACS緩衝液中にそれらを保つ。
- 筋肉と骨から軟部組織をきれいにティッシュペーパーを使用してください。
- FACS緩衝液3mLで乳棒と乳鉢にきれいに骨を置きます。
- 乳棒と乳鉢で静かに骨をつぶす。
- 吸引除去血まみれ流体オフと70μmのセルストレーナーに溶液を通すことにより、50ミリリットルコニカルチューブに移す。
- 5ミリリットルのFACSを粉砕骨にバッファに追加し、さらにつぶす。再び、ピペットを用いて流体を除去し、70μmのストレーナーを50ミリリットルコニカルチューブに移す。
- 一般的に骨のTWIをつぶす新鮮なFACS緩衝液中で3回、流体が赤に染色しなくなるまで、乳鉢と乳棒、新鮮なFACS緩衝液をさらに5ミリリットル追加するたびに使用するCE。
- 細胞ペレットを得るために、4℃で5分間、200×gでの骨髄液を集める。
骨髄細胞の4勾配分離
- FACS緩衝液10ml中に再懸濁上清を吸引（RTで維持される）。
- 市販の密度勾配細胞分離培地（RT）10 mlを含む50mlコニカルチューブを取る。
- 密度勾配細胞分離媒体に骨髄液レイヤ。ゆっくり電動ピペットを用いてこれを行います。角度ピペット円錐管の上部付近内面に先端部とは約30°にコニカルチューブを傾け。ピペット上の低速設定を用いて、密度勾配細胞分離媒体を妨害しないように静かに骨髄液を排出する。
注：最終的にはそこに意志二つの溶液（細胞溶液および密度勾配細胞分離培地溶液）との間の明確な定義である。 - RT遠心機を用いて、15分間、200×gでバランスのとれた遠心分離器で密度勾配細胞分離培地および細胞溶液を遠心する。また、密度勾配細胞分離媒体勾配を用いて、適切な相分離を確実にするために遠心分離機に加減速を除去。
- 遠心分離後、関心の骨髄細胞を含む濁った中間層をオフに吸引除去する。
- 新しいコニカルチューブにこれらの細胞を移す。細胞を洗浄するために、（氷上で保持）追加のFACS緩衝液20ミリリットルを追加します。
- 4℃で5分間、200×gで遠心分離して細胞ペレットを得た。
- 血球計数器を用いて細胞計数を可能にするためにメディアを刺激するマクロファージを1mlの最終細胞ペレットを再懸濁する。
5.細胞の計数
- 細胞液10μlを取り、混ぜるパンブルー10μlのと。負荷られたミックス10μlの血球計算板の上に、溶液の1ml当たり細胞数を得る。
6.細胞培養
- 24ウェルプレートの各ウェルにマクロファージ刺激培地2mlを置く。
- 各ウェルに200,000細胞を追加します。
注：我々の経験では、細胞プレーティング密度は破骨細胞の体外培養において十分なために最も重要な要件の一つである。 - 静かに37℃での定期的なインキュベーター内でプレートと場所を攪拌する。
- 3日間のメディアを変更しないでください。
- マクロファージ刺激媒質中で3日後、破骨細胞のメディアにメディアを変更します。
- 以下、大、多核破骨細胞は、培養プレート上で表示されている必要があり、その時点で、5-7日間、毎日メディアを変更。
7.染色と酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP）
- インビトロ CULの5-7日後トゥーレは、培養ウェルから培地を吸引除去する。
- 1×PBSで3回優しく井戸を洗ってください。
- 4％パラホルムアルデヒド溶液を添加することによって細胞を固定し、4℃で1時間放置する。
- この間、37℃に予備温暖化（市販されている）、TRAP染色を準備します。
- ホルムアルデヒド中で1時間後、パラホルムアルデヒドをオフに吸引し、1×PBSで穏やかに3回洗浄する。
- 染色されるプレートの各ウェルに予め温めTRAP染色の1ミリリットルを追加します。
- 遮光し1時間37℃のインキュベーターでプレートを置きます。
- 1時間後、TRAP染色をオフに吸引除去する。
- 予め温めておいた脱イオン水でウェルを3回洗浄する。
- 1-2分間ギルのヘマトキシリン（注意）とよく対比。
- 明視野顕微鏡を用いた画像破骨細胞。
- 核はブルーレイを出るときに汚れの十分な色強度は、一般的に、達成されるまで脱イオン水でウェルを洗ってください電子メール。
8.破骨細胞再吸収アッセイ
- 骨基質または無機結晶リン酸カルシウムコーティングのいずれかでプレコートされている市販の24ウェルのポリスチレン培養皿を使用する。
- 各ウェルにマクロファージ刺激メディアの2ミリリットルを置きます。
- 各ウェルに、ステップ2の終了時に得られた20万新たに単離した骨髄細胞を加える。
- 穏やかに3日間37℃のインキュベーター内に配置する前にプレートを攪拌する。
- 3日目に、破骨細胞分化メディアにメディアを変更。
- 5〜7日間破骨細胞分化培地毎日メディアの変更を行います。
破骨細胞再吸収活動9.定量
- 以下に説明するように鉱化基板上に破骨細胞分化培地中でインビトロ培養の5~7日後、resorpti形成する破骨細胞の能力を評価するために、石灰化した表面を分析ピット上、破骨細胞活性の指標。
- 吸収アッセイプレートから培地を吸引し、各ウェルに10％の漂白剤溶液100μlを加える。
- RTで15分間、10％の漂白剤溶液で細胞をインキュベートする。
- 蒸留水でウェルを3回洗浄する。
- 残りの水を吸引し、プレートから余分な水分を振り払うと、3-5時間、空気乾燥させ。
- 非再吸収基板のより容易な可視化を可能にするために、市販のフォン·コッサ染色キットでプレート対比。
- 再吸収面の代表部分の画像を取るために明視野顕微鏡を使用してください。
- 画像解析ソフトウェアを使用して、破骨細胞の吸収活性の定量化を可能にするために再吸収表面の割合を計算する。
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Representative Results
この方法の目的は、容易に、典型的には1週間で、in vitroで破骨細胞の多数を単離することであった。破骨細胞の多数の正常な分離は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色（ 図1A）を用いて確認した。大破骨細胞は、複数の核（通常は≥3核）を持つ大規模な紫色の細胞として可視化される。このプロトコルを使用して、破骨細胞あたり最大30核（ 図1B）で破骨細胞を単離することが一般的である。
鉱化表面を使用することで、in vitroで破骨細胞吸収活性を評価するゴールドの標準的な方法と考えられている。この方法では、鉱化表面の割合、または形成されている「再吸収ピット」を使用して破骨細胞骨吸収容量（ 図2）の決定を可能にする。
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破骨細胞の誘導条件下での培養液中で10日間培養し、以下の骨髄の図1（A）の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色。 10Xの倍率で明視野顕微鏡写真は、正（紫染色）TRAPである複数の大、多核破骨細胞を示しています。大きな多核破骨細胞の例は赤い破線で概説されている。（B）明視野顕微鏡写真を大、多核、TRAP陽性破骨細胞を示す10×倍率で。多核破骨細胞内の核の例は、赤い矢印で示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
10X倍率で図2.明視野顕微鏡写真は、破骨細胞吸収活性によって形成された吸収ピットを示しています。鉱化マトリックスは、可視化を可能にするために、フォン·コッサ染色で染色されている。黒い線がマトリックスの再吸収領域の例を概説破線。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
簡単にin vitroで破骨細胞の多数を隔離し、育成する能力は、骨の生物学および破骨細胞媒介性疾患の理解を進めるために支援を担当してきました。それが最近、破骨細胞の形成、分化および生存16-18の主要な調節因子として同定されたときには、これにつながるRANKLの同定だった。
それは、骨髄からの破骨細胞のin vitro栽培は播種密度に大きく依存している私たちの経験をされています。我々は、骨髄由来の細胞をプレーティング時に破骨細胞を得るためのこのプロトコルの障害は、典型的には、次善の播種密度によるものであることを観察した。したがって、このプロトコルでは、24ウェルプレート当たり200,000細胞をシードすることをお勧めします。さらに、この技術では、最大の成功を達成するためには、上記のsでメディアを変更するように正確に破骨細胞誘導培地を準備することが推奨されるAME時間は毎日は、最初の3日後のいずれかの培養プレートを妨害する必要がないとき。これは破骨細胞誘導培地因子の一定濃度を可能にすることができる。さらに、我々は、特定の試薬の使用はまた、多核破骨細胞の多数の培養のための大きな可能性を可能にすることを見出した。
この手法は、1つの加減速パラメータおよび特定の試薬の調達を変えることができるRT遠心分離機の入手可能性によって制限される。それはそうでなければ私たちは年齢や遺伝的背景の異なるマウスの範囲で、多くの成功を持っていると非常に簡単なプロトコルで、（ 例えば 、C57BL / 6、CD1、NOD SCID、LEPデシベル- / - ）。
この技術は、in vitroで破骨細胞を生成し、鉱化マトリックスを再吸収する能力を決定するために、信頼性の高い方法を提供する。このプロトコルを使用して、vitrにおける多核破骨細胞の多数を単離することが可能であるO通常は一週間で。私たちの経験は、破骨細胞の分離と体外培養では 、多くの場合、破骨細胞9,12,14を育成することができないことで、その結果、破骨細胞生産の面で非常に可変成果で以前に発表された技術の結果を用いていることである。
破骨細胞の機能は複雑であり、骨吸収が骨芽細胞と破骨細胞19の間のクロストークによって、地域レベルで媒介される、高度に組織化プロセスです。骨のバランスの局所制御に加えて、新たな証拠は、破骨細胞活性は、免疫、神経、および他のシステム上の要因20-24に関連する要因により全身支配されることを示唆している。
破骨細胞生物学の理解が骨リモデリングからの骨25-27に癌転移の調節におけるそれらの役割に至るまでのプロセスにおいて、その多様な役割を含む、急速に前進し続けると、このプロトコルは、研究者が構成されてできるようになりますently in vitroで破骨細胞を大量に分離する。
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Disclosures
著者のどれも宣言する開示や利害の対立を持っていません。
Acknowledgments
私たちは、NIHの助成金R01 DE021683、DE019434 R01、U01 HL099776、オーク財団と小児再生医療のためのHagey研究所の支援を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
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