Summary
Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro.
Abstract
Os osteoclastos são células altamente especializadas que são derivados a partir da linhagem monócito / macrófago de medula óssea. A sua capacidade única para reabsorver tanto as matrizes orgânicas e inorgânicas de osso significa que eles desempenham um papel fundamental na regulação da remodelação esquelética. Juntos, osteoblastos e osteoclastos são responsáveis pelo processo de acoplamento dinâmico que envolve tanto a reabsorção óssea e formação óssea agindo em conjunto para manter o esqueleto normal durante a saúde e na doença.
À medida que a célula de reabsorção óssea principais no corpo, alterações na diferenciação de osteoclastos ou a função pode resultar em efeitos profundos no corpo. Doenças associadas com a função dos osteoclastos alterada pode variar em gravidade de doença neonatal letal devido a falha para formar um espaço de medula para a hematopoiese, a patologias como a osteoporose, na qual excessiva reabsorção óssea osteoclástica predispõe à fratura formação mais comumente observada.
ent "> A capacidade de isolar os osteoclastos em números elevados in vitro tem permitido avanços significativos na compreensão do ciclo de remodelação óssea e abriu o caminho para a descoberta de novas estratégias terapêuticas que combatam essas doenças.Aqui, nós descrevemos um protocolo para isolar e cultivar osteoclastos da medula óssea do rato que irá produzir um grande número de osteoclastos.
Introduction
A remodelação óssea é dinâmico e envolve o acoplamento de formação óssea com reabsorção óssea 1. Este processo fortemente regulado é responsável por manter o esqueleto durante a homeostase normal, e em resposta a lesões e doenças.
Os osteoclastos são células únicas, multinucleadas, que são capazes de reabsorção ambas as matrizes orgânicos e inorgânicos dos ossos. Os osteoclastos são derivadas da linhagem monócito / macrófago de medula óssea 2-5. As anormalidades na função ou a formação de osteoclastos pode resultar numa variedade de patologias, incluindo condições clínicas comuns, como a osteoporose.
A capacidade de gerar osteoclastos in vitro tem permitido avanços significativos em nossa compreensão da biologia óssea 6. Como resultado, os novos agentes terapêuticos estão a emergir para tratar doenças relacionadas com osteoclastos que são responsáveis pela morbilidades e mortalidades significativas 7 8,9. Homeostase óssea é modificado de uma série de doenças, incluindo a osteoporose pós-menopausa, em que o aumento da actividade de osteoclastos levando à perda de massa óssea patogénico e densidade de 10. Com o aumento da disponibilidade de modelos murinos transgénicos de doença humana, há mais oportunidade para decifrar o papel dos osteoclastos na doença óssea humana 11-13.
Inúmeros protocolos para técnicas de cultura de osteoclastos aparecem na literatura, com muitas variações descritas 9,12,14. Xing e colegas descrevem uma metodologia semelhante para o protocolo descrito abaixo, na descrição de ensaios osteoclastogênicos a partir de células de medula óssea de murino. No entanto, para libertar as células de medula óssea seguintes colheita de osso longo, Xing et al. Lave a cavidade da medula com α-MEM meio completo14. Catalfamo examina o efeito da hiperglicemia em função dos osteoclastos e descreve um método em que todas as células mobilizadas pela lavagem da medula óssea são cultivadas durante 24 horas, altura em que as células não-aderentes são descartados 12, uma técnica também usada por Boyle et ai . 9 Estes protocolos previamente publicados exigem a prática de lavagem da medula óssea, uma prática tedioso, que também introduz o risco de um ferimento por picada de agulha e perda de medula óssea valiosa, pois é necessário cortar ambas as extremidades do osso. O protocolo, que descrevemos, implementa a utilização de um almofariz e pilão para isolar os osteoclastos, que é semelhante ao processo de isolamento descrito por macrófagos Weischenfeldt et al 15.
A nossa experiência, contudo, é que o isolamento dos osteoclastos e da cultura in vitro usando técnicas de resultados anteriormente publicados nos resultados variáveis em termos de produção de osteoclastos, muitas vezes resultandona impossibilidade de cultivar osteoclastos. Por conseguinte, temos desenvolvido um protocolo que permite o isolamento consistente de medula óssea de ratinho para produzir um grande número de osteoclastos in vitro, multinucleadas, com um rendimento aproximado de 70-80% das células plaqueadas inicialmente formando macrófagos e, subsequentemente, osteoclastos, na presença de meio de indução de osteoclastos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Declaração de Ética: Toda pesquisa envolvendo animais vertebrados foi realizada em termos dos protocolos aprovados pelo Painel Administrativo Stanford em Laboratory Animal Care (APLAC).
1. Preparação
- Permitir 10 ml de disponíveis comercialmente meios de separação de gradiente de densidade celular (que contém polissacarose e diatrizoato de sódio, ajustada a uma densidade de 1,077 g / ml) de vir até à temperatura ambiente num tubo de 50 ml.
- Prepare a citometria de fluxo (FACS) com tampão fosfato solução salina tamponada 1x (PBS) e 2% de soro fetal de vitelo (FCS). Tomar uma aliquota de 50 ml e manter esta aliquota à temperatura ambiente para uso durante o passo de gradiente de densidade media de separação de células.
- Possui um balde de gelo pronto para manter o tecido isolado e em células durante o procedimento de isolamento.
2. Prepare Meios de Cultura
- Prepare meios basais: MEM (Meio Essencial Mínimo), sem vermelho de fenol (500 ml), glutamato (1x), FCS (10x), 10.000 unidades / ml penicillin (1x).
- Filtre meio basal com um filtro de 0,22 um.
- Prepare osso mídia indução de macrófagos de medula:
- Introduzir 50 ml de mídia basais preparada no passo 2.1.
- Adicionar prostaglandina E2 (PGE2, Sr. 352,465 g / mol) a 10 -7 M de concentração final.
- Adicionar Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF) a 10 ng / ml.
- Não filtrar a solução final de macrófagos da medula óssea estimulando mídia.
- Prepare a mídia de indução de osteoclastos:
- Introduzir 50 ml de mídia basais preparada no passo 2.1.
- Adicionar prostaglandina E2 (PGE2, Sr. 352,465 g / mol) a 10 -7 M concentração final
- Adicionar Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF) a 10 ng / ml.
- Adicionar RANKL a 10 ng / ml.
- Não filtrar a solução final dos meios de comunicação de indução dos osteoclastos.
3. Isolamento de Medula Óssea
- Euthanize um C57BL / 6 do mouseutilizando o método de inalação de dióxido de carbono, seguido por deslocação cervical.
NOTA: Os roedores devem ser sacrificados por pessoal treinado usando técnica adequada, equipamentos e agentes. - Posicione e fixe o mouse em uma placa de dissecação e pulverize com álcool 70%.
- Dissecar os fémures, tíbias, úmeros e coluna vertebral.
- Comece com o mouse na posição supina. Realizar uma incisão na vertical ao longo do membro inferior e começar por dissecação ao longo do comprimento do fémur e da tíbia dividindo anexos tecidos moles. Finalmente, deslocar ossos da articulação do joelho e do quadril para liberar ossos totalmente a partir do esqueleto.
- Avance para fazer uma incisão ao longo do comprimento do membro superior para isolar o úmero. Deslocar o úmero no ombro e cotovelo dissecando fixação capsular tecidos moles.
- Finalmente, vire o mouse sobre, para que o mouse se encontra propenso. Adicione uma incisão na pele ao longo do comprimento da coluna vertebral, na linha média. Observe a paravertebral suavetecido de cada lado da coluna vertebral e inciso ao longo da borda óssea da coluna vertebral, dissecando através da massa do tecido mole paravertebral. Utilizando uma tesoura, fazer um corte horizontal ao longo da coluna vertebral, na base do pescoço, e no final da coluna vertebral, apenas proximal para a inserção da cauda, libertando a coluna vertebral de fixação do tecido mole.
- Uma vez que os ossos são colhidas, mantê-los em tampão de FACS em gelo.
- Use lenço de papel para limpar o músculo e tecido macio a partir dos ossos.
- Colocar os ossos limpos em um pilão e almofariz com 3 ml de tampão de FACS.
- Esmagar os ossos delicadamente no pilão.
- Aspirar o fluido manchada de sangue e transferência para um tubo cónico de 50 ml fazendo passar a solução através de um filtro de células de 70 mm.
- Adicionar 5 ml de tampão de FACS para o osso esmagado e esmagar ainda mais. Mais uma vez, remover o fluido, utilizando uma pipeta e transferir para o tubo de 50 ml através de uma peneira de 70? M.
- Normalmente esmagar o twi ossosce a três vezes em tampão de SCAF fresco, utilizando um almofariz e pilão, cada vez que a adição de mais 5 ml de tampão FACS fresco, até que o fluido não mancha vermelha.
- Centrifuga-se a solução de medula óssea a 200 xg durante 5 min a 4 ° C, para produzir um sedimento celular.
4. Separação Gradiente de Células da Medula Óssea
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 10 ml de tampão FACS (mantido à temperatura ambiente).
- Tirar o tubo de 50 ml contendo 10 ml de meios de comunicação disponíveis comercialmente separação de gradiente de densidade celular (RT).
- A camada de solução de medula óssea para a mídia de separação celular gradiente de densidade. Faça isto lentamente usando uma pipeta elétrica. Ângulo a ponta da pipeta contra a superfície interior, perto da parte superior do tubo cónico e inclinar o tubo cónico de cerca de 30 °. Usando uma configuração de baixa velocidade na pipeta, expulsar suavemente a solução de medula óssea, de modo a não perturbar os meios de separação de células por gradiente de densidade.
NOTA: Em última análise, haveráser uma definição clara entre as duas soluções (solução celular e solução de mídia de separação de células em gradiente de densidade). - Utilizando uma centrífuga RT, centrifugar os meios de separação de gradiente de densidade das células e solução de células em uma centrífuga equilibrada a 200 xg durante 15 min. Além disso, remover a aceleração e desaceleração na centrífuga para garantir a separação de fases adequada utilizando o gradiente de densidade de gradiente de meios de separação de células.
- Após centrifugação, aspirar para fora da camada intermédia nebulosa que contém as células da medula óssea de interesse.
- Transferir essas células para um novo tubo cónico. Adicionar 20 ml de tampão FACS adicional (mantidos em gelo) para lavar as células.
- Centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C, para produzir um sedimento celular.
- Ressuspender o sedimento final de células em 1 ml de macrófago estimulador meios de comunicação para permitir a contagem de células utilizando um hemocitómetro.
Contando 5. celular
- Tomar 10 ul da solução de células e misturarcom 10 ul de azul de tripano. Carga de 10 ul da mistura resultante para um hemocitómetro e obter a contagem de células por ml de solução.
A cultura 6. celular
- Coloque 2 ml de meio de estimulação de macrófagos em cada poço de uma placa de 24 poços.
- Adicionar 200.000 células de cada poço.
NOTA: Em nossa experiência, densidade de células-revestimento é um dos requisitos mais importantes para o adequado cultivo in vitro dos osteoclastos. - Agitar suavemente a placa e colocar numa incubadora normal a 37 ° C.
- Não altere os meios de comunicação durante 3 dias.
- Após 3 dias em media macrófagos estimulante, mudar a mídia para mídia osteoclastos.
- A partir de agora, alterar a mídia diariamente por 5-7 dias, altura em que, grande, osteoclastos multinucleados devem ser visíveis na placa de cultura.
7. A coloração com fosfatase ácida tartarato resistente (TRAP)
- Depois de 5-7 dias de in vitro cultura, aspirar a mídia da cultura também.
- Lavar os poços cuidadosamente com 1x PBS três vezes.
- Fixar as células por adição de solução de paraformaldeído a 4% e deixar durante 1 hora a 4 ° C.
- Durante este tempo, preparar a mancha TRAP (que está comercialmente disponível) por pré-aquecimento a 37 ° C.
- Depois de 1 hora em paraformaldeído, aspirar fora paraformaldeído e lavar cuidadosamente 3 vezes com PBS 1x.
- Adicionar 1 ml de pré-aquecido mancha TRAP em cada poço da placa de serem coradas.
- Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C durante 1 h, protegida da luz.
- Depois de 1 hora, aspirar fora da mancha TRAP.
- Lavar os poços três vezes com água desionizada pré-aquecida.
- Contracorante o bem com hematoxilina de Gill (CUIDADO) para 1-2 min.
- Osteoclastos imagem usando microscopia de campo claro.
- Lavar os poços com água desionizada até uma intensidade de cor adequada da mancha é conseguida, normalmente aparecem quando núcleos blue.
8. Osteoclasto reabsorção Ensaio
- Usar um de 24 poços de poliestireno prato de cultura disponíveis comercialmente que é pré-revestido com qualquer substrato de osso ou um revestimento de fosfato de cálcio cristalino inorgânico.
- Coloque 2 ml de meio de estimulação de macrófagos em cada poço.
- Adicionar 200.000 células da medula óssea recentemente isolados obtidos no final da etapa 2 para cada poço.
- Agitar suavemente a placa antes de colocá-lo em uma incubadora a 37 ° C durante 3 dias.
- No dia 3, mudar a mídia para mídia diferenciação dos osteoclastos.
- Realizar mudanças de mídia diários com mídia diferenciação dos osteoclastos por 5-7 dias.
9. Quantificação de reabsorção de osteoclastos de Actividade
- Após 5-7 dias de cultura in vitro em meios de diferenciação dos osteoclastos sobre um substrato mineralizada, analisar a superfície mineralizada, como descrito abaixo, para avaliar a capacidade dos osteoclastos para formar resorptiem poços, um indicador da atividade osteoclástica.
- Aspirar a partir de meios de comunicação a placa de ensaio a reabsorção e adicionar 100 ul de solução de lixívia a 10% a cada poço.
- Incubar as células com a solução de lixívia a 10% durante 15 min à TA.
- Lavar os poços três vezes com água destilada.
- Aspirar fora de todo o restante da água e sacuda o excesso de água da placa e deixar secar ao ar para 5/3 horas.
- Contracoloração a placa com um kit de coloração de Von Kossa disponível comercialmente para permitir a fácil visualização do substrato reabsorvido-un.
- Use microscopia de campo claro de tomar imagens de peças representativas da superfície reabsorvida.
- Usando software de análise de imagem, calcule a percentagem da superfície reabsorvida para permitir a quantificação da atividade de reabsorção osteoclástica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O objectivo deste método foi isolar facilmente um grande número de osteoclastos in vitro, tipicamente em uma semana. Isolamento bem sucedido de um grande número de osteoclastos foi confirmada utilizando a coloração da fosfatase ácida resistente ao tartarato (Figura 1A). Grandes osteoclastos são visualizados como grandes células roxas com múltiplos núcleos (tipicamente ≥ 3 núcleos). Usando este protocolo, é comum para isolar osteoclastos com até 30 núcleos por osteoclastos (Figura 1B).
Usando uma superfície mineralizada é considerado o método padrão de ouro de avaliar a actividade de reabsorção dos osteoclastos in vitro. Usando este método, a percentagem de superfície mineralizada, ou "poços" de reabsorção que permite ter formado para a determinação da capacidade de reabsorção de osteoclastos (Figura 2).
_upload / 52056 / 52056fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figura 1. (A) Tartarato fosfatase ácida resistente a coloração de medula óssea cultivadas seguinte 10 dias em cultura, sob condições indutivas de osteoclastos. Micrografia de campo claro em aumento de 10x demonstra vários osteoclastos grandes, multinucleadas que são TRAP (coloração roxa) positivo. Um exemplo de um grande, osteoclastos multinucleados é delineada por uma linha tracejada vermelha. (B) micrografia de campo brilhante na ampliação 10X demonstrando um grande multinucleadas, osteoclastos TRAP, positiva. Um exemplo de um núcleo dentro de um dos osteoclastos multinucleados é mostrado pela seta vermelha. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Micrografia de campo claro em aumento de 10x demonstra poços de reabsorção formados pela atividade de reabsorção osteoclástica. Matriz mineralizada está manchado com Von Kossa mancha para permitir a visualização. O preto linhas pontilhadas delinear um exemplo de áreas reabsorvidas de matriz. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uma habilidade para isolar facilmente e cultivar um grande número de osteoclastos in vitro tem sido responsável por ajudar a avançar na compreensão da biologia óssea e doenças mediadas por osteoclastos. Foi a identificação de RANKL que levam a este, quando foi recentemente identificado como o principal regulador da formação de osteoclastos, diferenciação e sobrevivência de 16-18.
Tem sido nossa experiência que o cultivo in vitro de osteoclastos de medula óssea é altamente dependente da densidade de semeadura. Observou-se que a falha deste protocolo para produzir osteoclastos é normalmente devido a uma densidade de semeadura abaixo da ideal ao cultivo de células derivadas da medula óssea. Assim, neste protocolo, recomenda-se semear 200.000 células por placa de 24 poços também. Além disso, a fim de conseguir o máximo de sucesso com esta técnica, é recomendado para preparar os meios de indução de osteoclastos precisamente como descrito acima e para alterar o material na stempo ame a cada dia, após os primeiros três dias, quando não é preciso perturbar as placas de cultura. Isto pode permitir que uma concentração constante dos factores de indução dos meios de osteoclastos. Além disso, verificou-se que a utilização de reagentes específicos também permite um maior potencial para a cultura de grandes números de osteoclastos multinucleadas.
Esta técnica é limitada pela disponibilidade de uma centrifugadora de RT, em que se pode alterar de aceleração e desaceleração e parâmetros de aquisição de reagentes específicos. É diferente de um protocolo muito simples, com o qual temos tido muito sucesso, em um intervalo de camundongos de diferentes idade e herança genética (por exemplo, C57BL / 6, CD1, NOD SCID, Lep db - / -).
Esta técnica oferece um método de confiança para gerar osteoclastos in vitro e para determinar a sua capacidade para reabsorver matriz mineralizada. Usando este protocolo, é possível isolar um grande número de osteoclastos multinucleadas em VITRo tipicamente em uma semana. Nossa experiência é que o isolamento dos osteoclastos e cultivo in vitro utilizando previamente publicados técnicas resulta em resultados altamente variáveis em termos de produção de osteoclastos, muitas vezes resultando em uma incapacidade de cultivar osteoclastos 9,12,14.
Função dos osteoclastos é complexo e reabsorção óssea é um processo altamente orquestrado que é mediada em nível local por cross-talk entre osteoblastos e osteoclastos 19. Além do controle local do equilíbrio osso, a evidência emergente sugere que a atividade dos osteoclastos é regido sistemicamente por fatores relacionados à imunológico, neuronal, e outros fatores sistemáticos 20-24.
Como a compreensão da biologia dos osteoclastos continua a avançar rapidamente, incluindo o seu papel diversificado em processos que vão desde a remodelação óssea ao seu papel na regulação de metástases do câncer de osso 25-27, este protocolo vai permitir aos pesquisadores consistemtemente isolar grandes quantidades de osteoclastos in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nenhum dos autores tem divulgação ou conflito de interesses a declarar.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio do NIH concede R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, a Fundação Oak eo Laboratório Hagey Pediátrica Medicina Regenerativa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue. Nature. 258, 325-327 (1975).
- Walker, D. G. Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells. Science. 190, 784-785 (1975).
- Burger, E. H., et al. In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes. The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast. The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).
- Brown, J. E., Coleman, R. E. Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast. Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).
- Khosla, S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).
- Boyle, D. L., et al. Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss. PloS one. 9, (2014).
- Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).
- Teramachi, J., et al. Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).
- Catalfamo, D. L., et al. Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function. Oral diseases. 19, 303-312 (2013).
- Schueler, J., et al. Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies. PloS one. 8, (2013).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH protocols. , (2008).
- Yamamoto, Y., et al. Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand. Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. Genetic regulation of osteoclast development and function. Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).
- Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. Endocrine disruptors and bone metabolism. Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).
- Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease. Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).
- Martin, T. J., Udagawa, N. Hormonal regulation of osteoclast function. Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130, 811-823 (2007).
- Bellido, T., et al. Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor. The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).
- Roato, I. Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases. Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).
- Autio, K. A., Morris, M. J. Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer. Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).
- Sottnik, J. L., Keller, E. T. Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases. Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).
