Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Личинок РНК-интерференция в Red мучного жука Published: October 13, 2014 doi: 10.3791/52059
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Biology, Miami University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

РНК-интерференция (RNAi) основе методики генных нокдаун лежат в основе исследований Tribolium. Здесь мы предоставляем обзор нашей личинок РНК-интерференции техники в Tribolium castaneum. Личинок РНК-интерференции является простым, но мощная техника, которая обеспечивает быстрый доступ к с потерей функции фенотипов, что позволяет исследователям изучать функции генов в различных контекстах.

Abstract

Красный мучного жука, Tribolium castaneum, предлагает репертуар экспериментальных инструментов для генетических и эволюционных исследований, в том числе полностью аннотированной последовательности генома, транспозонов основе трансгенеза и эффективной РНК-интерференции (РНК-интерференции). Среди этих преимуществ, методы генной нокдаун РНК-интерференции, основанные лежат в основе исследований Tribolium. Т. castaneum показать надежную системный ответ RNAi, что позволяет выполнять RNAi на любом этапе жизненного просто инъекционных двухцепочечной РНК (дцРНК) в полости тела жука.

В этом докладе, мы предоставляем обзор нашей личинок РНК-интерференции техники в Т. castaneum. Протокол включает (I) выделение надлежащего стадии Т. castaneum личинки для инъекций, (II) подготовка для установки впрыска, и (III) введение дцРНК. Личинок РНК-интерференции является простой, но мощный метод, который дает нам быстрый доступ к потери части-функции phenotypES, в том числе нескольких генов нокдаун фенотипов, а также серии гипоморфных фенотипов. Поскольку практически всех T. castaneum ткани чувствительны к внеклеточной дцРНК, личинок методика позволяет RNAi исследователей изучать широкий спектр тканей в различных контекстах, в том числе генетической основы организменном ответов на внешней окружающей среды. Кроме того, простота этой техники стимулирует больше студентов участие в исследованиях, что делает Т. castaneum идеальную генетическую систему для использования в классной комнате.

Introduction

Красный мучного жука, Tribolium castaneum, набирает популярность в различных областях биологии частично благодаря легкости выполнения РНК-интерференция (RNAi) 1-3. Генные нокдаун методы РНК-интерференции на основе позволяют ученым проводить с потерей функции анализа без использования сложных генетических методов. Т. castaneum показывают надежную системную реакцию RNAi, что делает возможным выполнение RNAi на любой стадии с помощью простой инъекции двухцепочечной РНК (дцРНК) в полость тела жука 4-6. Одновременное нокдаун нескольких генов также возможно в Т. castaneum путем введения двух или более различных молекул дцРНК в то же время 7,8. Кроме того, ряд гипоморфных фенотипов могут быть получены путем снижения концентрации впрыскиваемого дцРНК 8. Эти особенности делают обратные генетические методы РНК-интерференции на основе привлекательные альтернативы традиционным генетики вперед в Т. castaneum. Поскольку практическивсе Т. castaneum ткани чувствительны к внеклеточных молекул дцРНК 9, этот метод позволяет исследователей изучать широкий спектр тканей в различных контекстах. Кроме того, хотя это докладе основное внимание на выполнение RNAi в Т. castaneum, многие процедуры, описанные здесь, применимы и к другим насекомым. Таким образом, этот протокол будет полезна для тех, кто хочет выполнить с потерей функции анализирует в своих контекстах интересов в Т. castaneum, а также для исследователей, желающих применить метод РНК-интерференции на основе других насекомых.

Инъекционных дсРНК личинки позволяет функциональный анализ в различных жук стадиях жизни, в том числе личинок, куколок и взрослых этапах 4,5,10. Ранее мы уже сообщали наше общее личинок протокол RNAi включая процедуры молекулярной биологии 11. В настоящем докладе мы фокусируемся на описании процедуры инъекции дцРНК, которые лучше всего объяснены с визуальными помощников. Мы предоставляемподробные шаг за шагом процедуры инъекции, а также хорошие и плохие примеры инъекции. Этот визуальный протокол дополняет наш предыдущий протокол, а в сочетании, они обеспечивают более полное представление о личиночной процедур RNAi в Т. castaneum. Кроме того, мы обсудим параметры молекул дсРНК которые могут повлиять на успех РНК-интерференции, применения РНК-интерференции на основе анализов для физиологических исследований, а также применимость личиночной протокола РНК-интерференции в учебном лаборатории.

Protocol

1 Т. castaneum Акции и Культивирование

  1. Принятие решения о Т. Штамм castaneum использовать для эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько лабораторного создана Т. штаммы castaneum доступны. Ga-1 (Грузия-1) является родительский штамм из Ga-2, который был использован для секвенирования генома 3. Так как Ga-1 акции большинства ДНК-полиморфизмы (такие как одиночных нуклеотидных полиморфизмов, SNP) с Ga-2, и здоровее, чем Ga-2 за счет меньшего инбридинга, он идеально подходит для РНК-интерференции экспериментов. Пу-11 еще один удобный штамм использовать , также его уникальная расширенная желтый флуоресцентный белок (EYFP) выражение в будущем крыла зачатков позволяет нам различать последний личиночного возраста от других возрастов (см рис S4 из Кларк-Hachtel др. 2013 12). Важно, чтобы документ, который жука Штамм был использован в эксперименте, как генетический фон по-видимому, значительно AFFЭСТ РНК-интерференции фенотипы 13.
  2. Подготовьте Т. castaneum культура муки, добавляя 5% (по весу) дрожжей предварительно просеивают пивных органического цельного зерна муки (после смешивания, хранения культуры муку при -20 ° С). Алиготе культуры муку (при комнатной температуре) в 6 унций пластиковых Drosophila фондовых бутылок (около 40 г / бутылка).
  3. Культура Т. castaneum при 30 ° С с 70% влажности. Используйте инкубатор с контролируемой влажностью, если это возможно. Добавить 30-40 взрослых за бутылку культура (Соотношение мужчин и женщин 1: 1), чтобы начать культуру.
    Примечание: Хотя форма редко является проблемой при 30 ° С, более низкие температуры (например, 25 ° C) 70% влажности может привести к росту плесени в культуральной муки. Опустите влажности, если это происходит.
  4. Перенесите взрослых новой бутылке культуры каждые две недели для субкультивирования (см шаг 5,2-5,5 для, как изолировать взрослых от культуры муки).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это займет около трех недель, чтобы получить последнего возраста личинок. Alternatраторов, Т. castaneum культуры могут быть при более низкой температуре (20-25 ° С), хотя и с более культивирование период времени (с развитием при 25 ° С приблизительно в два раза, что при 30 ° С).

2 Получение Решения и инструменты для личинок дсРНК инъекций

  1. Синтезировать молекулы дцРНК, гомологичные гена-мишени путем транскрипции в пробирке. Хранить при -80 ° С. Смотреть Филиппа и Tomoyasu 2011 11 для детальных процедур молекулярной биологии. Также смотрите обсуждение по ряду параметров, которые необходимо учитывать при проектировании молекулы дцРНК.
  2. Сделать 10 мл 0,1 М фосфатного буфера натрия (рН 7,6 при 25 ° С) при смешивании 8,5 мл 1 М Na 2 HPO 4 1,5 мл 1 М NaH 2 PO 4. Проверить значение рН с помощью рН-метра и регулировать соответствующим образом.
  3. Сделать 1 мл 10-кратного буфера для инъекций путем смешивания 10 мкл 0,1 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,6 при 25 ° С), 100 _6; л 0,5 М KCl, 100 мкл зеленого пищевого красителя, и 790 мкл дважды дистиллированной воды (DDh 2 O). Развести буфер 10x впрыска сделать 2x буфер впрыска (200 мкл 10х буфера впрыска + 800 мкл DDH 2 O). Храните оба 10x и 2x впрыска буферов при 4 ° С до использования.
  4. Подготовьте Sticky стеклах.
    1. Обложка весь стекло с формой перемещаемый клей для личинок инъекций. Для взрослых или куколки инъекций, сделать два тонких полосок клея вдоль длинных краев слайда.
    2. Разрешить клей сохнуть в течение нескольких дней, что обеспечивает, что клей остается достаточно липким, чтобы придерживаться жуков на слайде, а также остальные достаточно податливым, чтобы облегчить их удаление после инъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если клей остается слишком липким, использовать палец и нажмите на клей, что позволит снизить липкость. Каждый слайд может содержать до 40 или 50 жуков, и могут быть использованы повторно, пока не удается надежно удерживать животных. Alternтельно, двухсторонней ленты также могут быть использованы, хотя иногда лента не клей достаточно, чтобы удерживать личинок.
  5. Согласовать эфирным наркозом Корзина.
    1. Удалите поршень из 10 мл одноразовый шприц, и сократить шприц пополам вокруг 6 мл линии.
    2. Откажитесь нижнюю половину шприца. Вкратце нагревать поверхность разреза верхней части шприца с газовой горелкой, и быстро нажать на расплавленную пластмассу на кусок нейлоновой сеткой, чтобы склеить сетку на шприц. Обрежьте излишки сетку после того, как пластик затвердевает.
  6. Подготовьте бутылку эфира. Добавить 30 мл эфира в узкой горловиной 100 или 250 мл стеклянный флакон. Добавить несколько кусочков папиросной бумаги, чтобы добавлять испарение эфира.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эфир представляет опасность пожара и также вреден. Всегда обращайтесь эфир под вытяжкой. Закройте крышку плотно в то время не используется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лед может быть использован в качестве безопасной альтернативы (например, в классной комнате), хотя sedatioN является менее эффективным.

3 Получение личинок инъекций аппарата

  1. Разместить механическую стадию XY на вскрытии микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: XY механическая этапы доступны из основных микроскопических компаний. Кроме того, недорогие этапы микроскопа также может быть использован для большинства рассекает микроскопов с некоторыми изменениями (см таблицу материалов, например).
  2. Поместите механическую иглы манипулятор около механической стадии XY.
  3. Соберите инъекционный шприц. Используйте четыре-ходовой кран (с Luer соединений) для подключения 30 мл одноразовый шприц к держателю стекла иглы, что позволяет манипулировать шприц для инъекций, не влияя на давление в инъекционной иглой (см Филиппа и Tomoyasu 2011 11 для детального шприц для инъекций монтаж).

4. Тяговая инъекционных игл

  1. Потяните боросиликатного стекла иглы (B100-50-15, OD: 1 мм, ID: 0,5 мм, длиной 15 см) поиглы съемник.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для Саттер Р-87 или Р-97, используйте параметр "Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, время = 90" или следовать главу 2 пипетки Cookbook: приверженцем Cell, C. Элеганс, дрозофилы, и данио рерио - Рекомендуемая программ. Оптимальные параметры варьируются в зависимости от модели иглы съемник. Установка для общего Drosophila инъекционной иглы является хорошей отправной точкой.
  2. Магазин вытащил иглы в пластиковом корпусе (например, пластмассовый корпус CD) и закрепите со съемной монтажной замазкой.

5 Выделение и выбор личинок

  1. Поместите # 25 сито на сито приемника.
  2. Поместите содержимое бутылки культуры (жуков и культуры муки) на сито, просеивают и сразу же содержимое. Не оставляйте их содержимое на сито без просеивания, как личинки быстро пытаются зарыться через сито и застряли. Агрессивно просеять содержимое, чтобы мука падениеи оставить через старую личинки (как правило, 6-й и 7-й возрастной стадии личинки), куколки и взрослые (вместе с их литых выключения кутикулы, экзувии) сзади на верхней части сита.
  3. Перенесите материалы оставшиеся на сите (жуков и экзувии) к посевной кастрюлю. Продолжайте нажимать кастрюлю, чтобы предотвратить жуков от побега.
  4. Извлеките экзувии и частицы муки оставшиеся на поверхности жуков, осторожно дуть над семян сковороде.
  5. Нажмите на семенной поддон для перемещения содержимого на дно кастрюли. Тогда, оставить кастрюлю неиспользованный в течение нескольких секунд. Подождите для взрослых, которые более мобильны, чем на других этапах, чтобы выйти из кучи. Удалить взрослых с помощью арт-кисть (например, 1 см в ширину).
  6. Отдельный куколки, осторожно стучит семян кастрюлю, сохраняя при этом рот кастрюли немного вниз, как куколок, как правило, свернуть быстрее к устью. Используйте кисть, чтобы удалить куколок, оставив только личинок на семенном кастрюлю.
  7. Plтуз изолированных личинок в чистую чашку Петри. Выберите подходящий этап личинок для инъекций и поместить их в отдельный чашке Петри.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В начале прошлого личинки младших возрастов (1-2 день после окончательного личиночной линьки) часто подходит при анализе влияния RNAi на взрослых морфологии, а также на метаморфозы. Он, однако, иногда необходимо выполнить RNAi на предпоследнем (или даже раньше) этап оценить функцию раннего гена (например, рис 3E-3Н. Также Кларк-Hachtel др. 2013 12). Используйте куколок в качестве эталона размером определить возрастной стадии личинок. Последнего возраста личинки немного длиннее куколок. Кроме того, ПУ-11 может быть использован для идентификации личинок последнего возраста, а также для определения временной ход развития последней возрастной стадии личинок (рисунок S4 Кларк-Hachtel и соавт. 2013 12).
  8. Держите выбранный личинок в чашку Петри до эфирным наркозом. Поместите все остальноеличинок и других этапах жуков (например, куколок и взрослых) обратно в культуральной бутылки с мукой и вернуть его в инкубатор.

6 Получение инъекционных игл

  1. Поставьте ранее вытащил стеклянную иглу на предметное стекло микроскопа, используя либо липкий кнопки или двухсторонний скотч. Использование щипцов, проверить тушеную конец иглы, глядя через вскрытии микроскопом, чтобы увидеть, где верхушка изгибы. Захватите область чуть в сторону наконечника стороне, где игла изгибы с пинцетом и твист сломать.
  2. Ведите иглы и выбросить другим. Рассмотрим хорошую иглу как имеющий отверстие, которое не является ни слишком большим, ни слишком маленьким (около 0,05 мм в диаметре. Фиг.1А и 1В), и расположена под углом, чтобы проникновение в личиночной кутикулы проще (фиг.1В и 2A-2B). Рассмотрим плохой иглу как (I) слишком маленький, что делает поглощение раствора дсРНК в иглу Диффикульт (стадия 7) (Фигуры 1D и 2D), (II) слишком велико, в результате чего личинки травмы и, возможно, летальность при инъекции (Фигуры 1C и 2F), (III) тупым, что делает проникновение кутикулы сложной и увеличением травмы.
  3. Вставьте иглу в иглодержатель.
    1. Во-первых, открутить наконечник иглодержателя и поместите заднюю конец иглы в наконечник держателя. Затем поместите резиновую прокладку под кончиком держателя (по крайней мере, 1 см от задней части стеклянной иглы).
    2. Вставьте заднюю часть иглы в держатель, с резиновой прокладкой полностью вставленной в отверстие иглодержателя. Винт наконечник обратно на держатель.
  4. Поместите собранный держатель иглы на иглу манипулятора. Держите держатель иглы близкое к горизонтальному. Отрегулируйте положение манипулятора, так кончик иглы находится в центре поля зрения при взгляде через MICRoscope.

7 отдавая дсРНК Решение в иглу

  1. Приготовьте раствор для инъекций дсРНК только перед инъекцией путем изменения концентрации с DDh 2 O и смешивания раствора дсРНК с равными объемами 2х буфера впрыска (шаг 2.3). Держите смешанный раствор на льду. Смотреть обсуждение относительно концентрации дсРНК.
  2. Отрежьте верхушку 20 мкл одноразовый наконечник пипетки. Внесите 10 мкл раствора в подстриженной кончика пипетки. Тщательно удалить пипетки из пипетки, сохраняя при этом жидкость на конце, обеспечивая противодавление. Кроме того, тщательно удалить кончик, а затем перейти решение до конца наконечника, предоставляя давление с помощью пальца.
  3. Поместите кончик пипетки с решением дсРНК на столике микроскопа, используя липкую тактику с открытием к наконечнику иглы.
  4. Глядя в микроскоп, медленно перемещайте загруженный наконечник к игле до кончикаигла только внутри загруженного кончика пипетки и в раствор.
  5. Глядя в микроскоп, осторожно потяните назад на поршень в шприц для инъекций медленно вытяните решение дсРНК в иглу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не перегружайте иглу. В конец раствора дцРНК приближается к кончик иглы, замедлить скорость вытягивания, и остановки загрузки раствора перед кончиком иглы достигнет воздуха. Если воздух достигает наконечника, решение будет быстро всасывается в держатель иглы, что приводит к серьезным проблемам загрязнения. Подробные процедуры иглодержателе очистки описаны в Филиппа и Tomoyasu 2011 11.
  6. Снимите давление со шприца для инъекций и иглодержателя, открыв кран. Затем переместите пипетки от кончика иглы. Поднимите иглу вверх от стадии, чтобы предотвратить случайно повредить иглу при размещении личинок на сцене. Снимите опустели пипетки со сцены.
    7. 8 дсРНК впрыска

    1. Поместите личинок в корзине эфирным наркозом. Используйте меньше 10 личинок, если обучения технике. Используйте 30-40 личинок в один тур, как только удобной с техникой.
    2. Поместите корзину с личинками в бутылке эфира и закройте крышку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эфир представляет опасность пожара и также вреден. Выполните этот шаг под вытяжкой.
    3. Etherize личинки около 3 мин. Проверьте личинок для движения через 3 мин. Поместите их обратно в бутылку эфира в течение еще 30 сек, если они все еще движется. Не etherize в течение более 5 мин, так как это может увеличить летальность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время эфирным наркозом может изменяться в зависимости от температуры и влажности.
    4. Перенести etherized личинок из корзины с антипригарным краю стеклянной липкой слайде. Использование щипцов и, глядя в микроскоп, подобрать каждый личинок по одному и разместить их на предметное стекло. Положите их в стороны и слегка постучите вниз их тела Fром голова к хвосту с пинцетом, слегка растягивая их, как вы идете, чтобы убедиться, что они закреплены на слайде.
    5. Поместите клейкую слайд с личинками на столике микроскопа.
    6. Вставьте дсРНК загружалась иглу мягко в спинной стороне личинки, чтобы избежать повреждения ЦНС. Также избегайте средней линии спины, как личинки сердце находится здесь. В этом и последующих шагов, всегда использовать сцену для перемещения личинок к игле (вместо использования иглы манипулятор для перемещения иглы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: конкретное место инъекции не имеет значения, как РНК-интерференции в Т. castaneum кажется, системный характер. Тем не менее, это правило, легче всего привнести в спинной стороне грудной или брюшной сегментов.
    7. После введения иглы в личинок, вытащить иглу немного назад, чтобы места для дтРНК ввести личинок полость тела.
    8. Аккуратно нажмите на шприц для инъекций, пока личинки становятся зелеными (или цвета буфера впрыска) и посмотрите секtretched и полный.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если обучения технике, попытаться придать как можно больше, чтобы определить количество раствора, который может быть введен в личинку без существенных летальности. Это, как правило, около 0,5-0,7 мкл.
    9. Удалите иглу из личинок. При снятии иглы, слегка потяните на себя шприц для инъекций, чтобы избежать потери дсРНК (также будьте осторожны, чтобы не тянуть в воздухе).
    10. Введите весь личинок на слайде. Обязательно удалите личинки, которые не были успешно вводят. Полный впрыска до личинок проснуться (примерно 10 мин).
    11. Удалить слайд с введенного личинок из инжекционного микроскопом и оставить слайд для получения дополнительной 5 мин, пока все личинки не оправиться от эфирным наркозом.
    12. С пинцетом и под микроскопом рассекает, осторожно поднимите личинок от головы до хвоста, чтобы освободить их от липкой слайде. Поместите недавно выпущенный личинок в чистую чашку Петри. Оставьте личинок на чашку Петри в течение 10-15 мин, чтобы позволить инъекции маскруглый свернуться.
    13. Поместите личинок в новый флакон с чистой муки и соответствующим образом этикетке, включая имя штамма, тип дцРНК вводят, концентрацию дцРНК, количество впрыскиваемого личинок и дату.
    14. Культура вводили личинки при 30 ° С с 70% влажности. Соблюдайте личинок для РНК-интерференции фенотипов регулярно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: последняя возрастная стадия личинки окукливаются в течение 7 дней. Затем, куколки будет eclose во взрослых особей через 7 дней (если нет аномалии по времени, вызванные RNAi).

    9 Подтверждение нокдаун и фенотипических анализов

    1. Рассмотреть вопрос об оценке эффективности РНК-интерференции сбить несколько различных методов молекулярной биологии, таких как количественного обратной транскрипции-ПЦР (QRT-PCR) и вестерн-блоттинга. Смотреть протокол Miller и соавт. 2012 7 и Филиппа и Tomoyasu 2011 11 для детального кПЦР и вестерн-блот, соответственно.
    2. Анализ RNAi связанные фенотипы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: РНК-интерференции связанныхфенотипы могут наблюдаться при нескольких различных этапах и при различных условиях культивирования, в зависимости от генов, которые были направлены. РНК-интерференция может повлиять на жука морфология, метаморфоз, физиологию и поведение. Как часто наличие фенотипа проверяется и при каких условиях жуки воспитываемых должны быть приспособлены к конкретным вопросам, расследуется через РНК-интерференции.

Representative Results

Одним из ключевых шагов для успешного инъекции, чтобы сделать хорошую иглу. Как описано в шаге 6, кончик иглы должен быть сломан до инъекционных T. castaneum. Примеры хороших и плохих игл показаны на рисунке 1. Хороший игла имеет острый и жесткий кончик, с примерно 0,05 мм отверстие диаметром (Рисунок 1В).

Рисунок 2 представляет успешную инъекцию (2А и 2В), а также несколько случаев неудачных инъекций (Рисунки 2C-2F). С соответствующего размера инъекционной иглы, кончик иглы проникает в личиночной кутикулы с минимальным сопротивлением (Фигура 2А), и полученный раствор дцРНК (зеленый) поступает в личинок без утечки (фиг.2В). Не более залить, как это приведет к переполнению решения дсРНК даже с правильно подобранного инъекционной иглы (рис2C). Если кончик иглы слишком тонкий, кончик иглы часто не проникают в личиночной кутикулы и изгибы, делая инъекцию трудной (Рисунок 2D). Если это произойдет, обрезки кончик иглы иногда помогает. Большие иглы часто еще можно использовать, хотя и с некоторыми трудностями в проникающая личиночной кутикулы (Рисунок 2E). Однако большое количество раствора дцРНК легко вытеснены из иглы даже при небольшом давлении на шприц для инъекций, что часто приводит к переполнению раствора дцРНК (рис 2F).

При выполнении RNAi, важно, чтобы иметь положительный контроль, чтобы оценить, что RNAi работает должным образом, и отрицательный контроль, чтобы убедиться, что наблюдаемый эффект не является неспецифический эффект дцРНК или следствием процедуры инъекции (например, травмы вызваны путем инъекции, или аномалий с эфирным наркозом). Инъекция дсРНК таргетирования EYFP может служитьхороший положительный контроль при использовании штамма 5,7 пу-11. Когда EYFP дсРНК впрыскивается в последней личиночной стадии, значительное снижение EYFP сигнала в будущих крыла зачатков можно наблюдать уже через день после инъекции (Рисунок 3А). Нокдаун EYFP завершена через два дня после инъекции EYFP дцРНК (фиг.3В), и это нокдаун устранена путем (3C и 3D рисунках) куколки и в течение всей жизни жука, если концентрация дцРНК достаточно высока (например, 1 мкг / мкл) 7. EYFP дцРНК также может быть использован в качестве отрицательного контроля, так как это не-эндогенный последовательность гена, и не должен вызывать морфологические или физиологические нарушения (3А-3D).

Мы предоставили изображения личинок РНК-интерференции для рудиментарный (VG), критический ген крыла 12, в качестве другого примера, как эффективных эта инъекция основе РНК-интерференции техника в Т. castaneum. Когда дсРНК для VG впрыскивается в предпоследнем личинок (одной ступени до последней личиночной стадии), полная потеря крыла структур можно наблюдать в стадии куколки (Цифры 3E и 3F). Полученную взрослых также полностью отсутствует крыла структуры (рис 3G и 3Н). В результате РНК-интерференции для VG примером как надежность и системный характер РНК-интерференции в Т. castaneum.

Рисунок 1
Рисунок 1: (A) Примеры цельных, хороших, и плохих игл (B) Кончик хорошо сломанной хорошей иглы (C) Кончик сломанной иглы, которая является слишком большой и тупой (D) Кончик... из сломался н игла, что слишком тонкая. Шкала баров (красный) составляют 0,05 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2:... (А) соответствующего размера инъекционной иглы вставляется в последней возрастной стадии личинки (В) Личинка соответствующим образом вводят с зеленого раствора дцРНК (С) Переполнение раствора дцРНК в точке инжекции, вызванной чрезмерной инъекции (D ) тонкой иглой не в состоянии проникнуть в личиночной кутикулы. (Е) большая инъекционной иглы вставляется в последней возрастной стадии личинки. (F) Личинка вводят с большой иглы, в результате чего переполнения и утечки раствора дцРНК. Стрелки указывают на иглы.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Примеры успешного РНК-интерференции в Т. castaneum. (AD) Последнее личинок впрыска результатов EYFP дцРНК к уменьшению экспрессии EYFP. (А) Личинки через один день после инъекции. (Б) Личинки через два дня после инъекции. (С) управления куколок. (D), куколки в результате личиночной EYFP дсРНК впрыска. Отрицательные элементы управления буфером инъекции (А, В) и DsRed дцРНК инъекции (С, D). Стрелки и стрелки указывают выражение EYFP или ее отсутствие в крыло зачатков и глаз, соответственно. (EH) PenКонечная личиночной РНК-интерференции для VG. (E) дикого типа куколки. (F) В.Г. РНК-интерференции куколки. Отсутствие крыла структур уже видно на стадии куколки (стрелка). G) дикого типа взрослых. (Н) VG RNAi взрослого. Крыло связанные структуры полностью отсутствуют (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Есть ряд важных вопросов, которые необходимо рассматривать, чтобы гарантировать успех РНК-интерференции, в том числе длины и концентрации молекул дсРНК, конкуренции среди различных молекул дсРНК (при попытке кратное сбить), а также возможность и от ворот Effects (ОТЕ).

дсРНК Длина

Длина молекул дцРНК влияет на эффективность системной реакции RNAi, с более дцРНК быть более эффективным, чтобы вызвать RNAi 7,14,15 (при том, что чем дольше предел дцРНК в настоящее время неизвестно). Длина дцРНК должна быть больше, чем 50 пар оснований, чтобы вызвать эффективное RNAi в T. castaneum 7. дсРНК между 150 б.п. и 500 б.п., кажется, идеально подходит для РНК-интерференции экспериментов. Хотя длинные молекулы дцРНК может также использоваться, они будут иметь увеличенный шанс ОТЕ и шаг гена клонирования будет становиться все труднее.

дсРНК Концентрация

ve_content "> Различные степени гена нокдауна может быть достигнуто в зависимости от концентрации дцРНК. 1 мкг / мкл по-видимому, разумно начальную концентрацию, которая часто приводит к почти нуль-фенотип (может изменяться в зависимости от гена (ов), представляющие интерес ). RNAi может быть выполнена с более высокой концентрацией (например, 7-8 мкг / мкл), чтобы получить более сильный RNAi фенотип. RNAi с серийным разбавлением дцРНК иногда может быть выгодно производить серию гипоморфных фенотипов (дополнительных данных Tomoyasu др., 2009 8, и Borràs-Кастельс неопубликованные данные).

РНК-интерференции конкурс

Несколько генов нокдаун может быть достигнуто в Т. castaneum путем введения нескольких различных молекул дцРНК одновременно. Тем не менее, это также известно, что наличие нескольких различных молекул дцРНК, присутствующих в организме часто приводит к конкуренции между дцРНК для доступа к компонентам RNAi (например, Tomoyasu др. 2005 16, Tomoyasu др., 2009 17, и Ян др., 2009 18). Хотя возможно, Четырехместный RNAi (или более) может быть сложным, так как она, скорее всего, вызвать значительное снижение эффективности РНК-интерференции для всех четырех генов-мишеней.

Off-таргетинга

ОТЕ является неотъемлемой забота о подходах РНК-интерференции, основанных. Одним из способов минимизации ОТЕ является определение регионов в гене-мишени, которые разделяют сходные последовательности с другими генами и избежать этих регионов при разработке дсРНК. Простой анализ BLAST против Т. castaneum предсказал множество генов может определять такие регионы. Несколько онлайн-инструментов также можно было провести оценку потенциальной ОТЕ (например, E-РНК-интерференции 19). Выполнение RNAi в течение двух непересекающихся областей гена-мишени является простым и эффективным способом, чтобы исключить возможность того, что наблюдавшиеся фенотипы обусловлены ОТЕ. Возможность ОТЕ минимизируется, если РНК-интерференции для двух неперекрывающихся регионы дают одинаковые фенотипы (если два непересекающихся регионов не разделяют подобный последовательность).

Оценка ген нокдаун другими, чем фенотипических анализирует средств часто решающее значение для эффективного представления данных RNAi связанных. Две основные способы оценки генной нокдаун являются Qrt-ПЦР и Вестерн-блоттинга. Qrt-ПЦР является удобным способом для измерения уровня мРНК-мишени, и был использован во многих РНК-интерференции, связанных с исследованиями в том числе в Т. castaneum (см Миллер и соавт. 2012, например, 7). Howevэ-э, должны быть предприняты меры, как мы недавно видели некоторые случаи, в которых целевой уровень мРНК до-регулируется РНК-интерференции (хотя белковый продукт является подавляется) (Borràs-Castells неопубликованные данные). В настоящее время неизвестно, если это РНК-интерференции индуцированной мРНК до-регулирования может быть широко распространена или уникальными для определенных генов. Вестерн-блот анализ еще один способ, чтобы подтвердить гена нокдаун. Этот метод является достаточно надежным, насколько это измеряет количество конечного продукта белка. Требование специфических антител против белкового продукта гена-мишени и обратная сторона этого подхода. Используя несколько независимых измерений в дополнение к фенотипической анализа увеличит доверие фенотипических данных, полученных РНК-интерференции на основе анализа.

С момента своего зачатия в Т. castaneum, РНК-интерференции имеет, прежде всего, были использованы для изучения функции генов в развитии и формировании образов. Эти Т. castaneum исследования развития были весьма успешными в Characческие данные эволюционно консервативных и расходились функций генов (отзывы в Denell 2008 1 и Klingler 2004 2). Тем не менее, РНК-интерференции, основанные исследования в Т. castaneum не ограничиваются биологии развития. Например, РНК-интерференции может быть использован для изучения функции генов в широком диапазоне физиологических и поведенческих реакций, в том числе толерантности напряжения, хищников, агрессии, выборе партнера, узоры активность, и защитных механизмов.

Одна из трудностей применения RNAi в этих контекстах является вероятность плейотропных эффектов. Часто, гены интерес будет иметь разнообразные роли на протяжении всего Т. Таким образом, castaneum жизненный цикл, что делает удаление генов без непреднамеренных фенотипических эффектов сложных. Тем не менее, способность легко выполнять RNAi на различных стадиях часто может быть эффективной стратегией для предотвращения этих плейотропные эффекты. Например, выполняя RNAi у взрослых, а не личинки или куколки могут позволить нам обойти Uninкак правило летальность вызванное генной нокдаун во время раннего развития. Гибкость реагирования РНК-интерференции в Т. castaneum таким образом, делает эту модель привлекательной выбор для адаптации RNAi для экспериментов генной функции в физиологических и поведенческих реакций.

Т. Система castaneum также идеально подходит для использования в качестве учебного лаборатории. Т. castaneum могут быть легко культивируют на муки / дрожжевой смеси при комнатной температуре (25 ° С) без частого субкультивирования и методы RNAi в T. castaneum достаточно просты, чтобы быть адаптированы к лаборатории с молодыми, обучение ученых. Как РНКи становится важным методом в различных биологических полей, крайне важно, чтобы студенты подвергаются этой техники. Прямо вперед характер личиночной РНК-интерференции техники в Т. castaneum также призывает больше студентов, которые должны участвовать в исследовании, что делает Т. castaneum главным кандидатом на классе ориентированной генетическая система. </ P>

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Центр биоинформатики и функциональной геномики (CBFG) в Университете Майами в службу технической поддержки. Эта работа была поддержана Университета Майами запуска грант (УТ) и Национального научного фонда (УТ: IOS 0950964).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organic whole wheat flour  Heartland Mill Inc. Kansas G1
Brewer’s yeast MP Biomedicals 2903312 Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus.
6 oz plastic Drosophila stock bottles Fisher Scientific 11-888
Sieve Fisher Scientific  04-881N 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710 µm) for larvae, pupae, and adults. 
Sieve Fisher Scientific  04 881 10P 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600 µm)  Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder.
Sieve receiver Fisher Scientific  04-866B 8 in. diameter
1.5 Quart spouted sample pan  Seedburo Equipment Co. Model 33 collection pan
Incubator BioCold Environmental Inc BC26-IN Keep it 30 °C with 70% humidity.
Na2HPO4 Fisher Scientific  S374500
NaH2PO4 Fisher Scientific S397-500
KCl Fisher Scientific  P217-500
Food dye  Kroger green, blue, or red preferable
Microscope glass slide  Fisher Scientific  22-038-103
Tack-It Over&Over Aleene's Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies.
Plastic CD case Amazon
Boroslilicate glass capillary Sutter Instrument BF100-50-15 O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. Without filament
Needle puller Sutter Instrument P-87 or P-97 
Removable mounting putty  Loctite Fun-Tak
Compressed gas duster OfficeMax OM96091
Forceps Fine Science Tool 11231-30 Dumoxel #3 (to manipulate beetles)
Forceps Fine Science Tool 11252-20 INOX #5 (to break needle tips)
Ethyl ether, anhydrous  Fisher Scientific  E138-500
Nylon mesh Flystuff/Genessee Scientific 57-102 120 µm pore size/49% open area
Media bottle, 100 ml VWR 89000-926
Stereomicroscope Zeiss SteREO Discovery V12. Injection microscope.
Stereomicroscope Fisher/Zeiss 12-070-513  Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide.
X-Y mechanical stage  Zeiss 4354600000000000
X-Y mechanical stage  Microscopenet.com A512 Inexpensive alternative
Manipulator Narishige M-152
Magnetic stand Narishige GJ-1 
Glass capillary holder Narishige IM-H1 
30 ml Disposable syringe BD syringe 309650 BD Luer-Lok Tip
Four-way stopcock  Cole-Parmer Instrument Co. EW-30600-03 Stopcocks with Luer connections; 4-way; male slip
Art paint brush Amazon Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece Any general paint brush will work.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Denell, R. Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo. Genetics. 180, 1779-1786 (2008).
  2. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).
  3. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  4. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
  5. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  6. Tomoyasu, Y., et al. Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium. Genome biology. 9, R10 (2008).
  7. Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi. PLoS ONE. 7, e47431 (2012).
  8. Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles. Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).
  9. Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Larval RNAi in Drosophila. Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).
  10. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evolutio., & development. 1, 11-15 (1999).
  11. Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).
  12. Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle. Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).
  13. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC genomics. 14, 5 (2013).
  14. Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).
  15. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, Science. New York, NY. 2456-2459 (2002).
  16. Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
  17. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  18. Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental biology. 333, 215-227 (2009).
  19. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).

Tags

Молекулярная биология выпуск 92 РНК-интерференция РНК-интерференции ген нокдаун красный мучного жука, Инъекции двухцепочечной РНК функциональный анализ учебные лаборатории

Erratum

Formal Correction: Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum
Posted by JoVE Editors on 10/01/2015. Citeable Link.

An erratum was issued for Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

Step 4.1 was updated from:

Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.

to

Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 770, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.

Личинок РНК-интерференция в Red мучного жука<em&gt; Tribolium castaneum</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M.,… More

Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. (92), e52059, doi:10.3791/52059 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter