शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) आधारित जीन पछाड़ना तकनीक Tribolium अनुसंधान के मूल में हैं. यहाँ, हम Tribolium castaneum में हमारे लार्वा आरएनएआई तकनीक का अवलोकन प्रदान. लार्वा आरएनएआई शोधकर्ताओं विविध संदर्भों में जीन कार्यों का अध्ययन करने के लिए अनुमति हानि के समारोह phenotypes के लिए त्वरित पहुँच प्रदान करता है एक सरल, लेकिन शक्तिशाली तकनीक है.
लाल आटा बीटल, Tribolium castaneum, एक पूरी तरह से एनोटेट जीनोम अनुक्रम, transposon आधारित transgenesis, और प्रभावी शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) सहित आनुवंशिक और विकास अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक उपकरणों की एक सूची प्रदान करता है. इन फायदों के अलावा, आरएनएआई आधारित जीन पछाड़ना तकनीक Tribolium अनुसंधान के मूल में हैं. टी castaneum यह संभव बस बीटल के शरीर गुहा में डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) इंजेक्शन लगाने के द्वारा किसी भी जीवन स्तर पर आरएनएआई प्रदर्शन करने के लिए कर रही है, एक मजबूत प्रणालीगत आरएनएआई प्रतिक्रिया दिखाते हैं.
इस रिपोर्ट में, हम टी में हमारे लार्वा आरएनएआई तकनीक का अवलोकन प्रदान castaneum. प्रोटोकॉल टी का उचित मंच (i) अलगाव शामिल इंजेक्शन के लिए castaneum लार्वा, इंजेक्शन स्थापित करने के लिए (द्वितीय) तैयार करने, और (iii) dsRNA इंजेक्शन. लार्वा आरएनएआई नुकसान के समारोह phenotyp के लिए त्वरित पहुँच के साथ प्रदान करता है कि एक सरल, लेकिन शक्तिशाली तकनीक हैकई जीन पछाड़ना phenotypes के साथ ही hypomorphic phenotypes की एक श्रृंखला सहित तों. लगभग सभी टी के बाद से castaneum ऊतकों कोशिकी dsRNA लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, लार्वा आरएनएआई तकनीक शोधकर्ताओं बाहर के वातावरण को जीवधारी प्रतिक्रियाओं के आनुवंशिक आधार सहित विभिन्न संदर्भों में ऊतकों की एक विस्तृत विविधता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, इस तकनीक की सादगी टी, जिससे अनुसंधान में अधिक छात्र की भागीदारी को बढ़ावा देने एक कक्षा में स्थापित करने में इस्तेमाल के लिए एक आदर्श आनुवंशिक प्रणाली castaneum.
लाल आटा बीटल, Tribolium castaneum, कारण शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) 1-3 प्रदर्शन में आसानी से भाग में जीव विज्ञान के विभिन्न क्षेत्रों में लोकप्रिय हो रहा है. आरएनएआई आधारित जीन पछाड़ना तकनीक वैज्ञानिकों नुकसान के समारोह जटिल आनुवंशिक विधियों के उपयोग के बिना विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देते हैं. टी castaneum यह संभव बीटल के शरीर गुहा 4-6 में डबल असहाय शाही सेना (dsRNA) के सरल इंजेक्शन के माध्यम से किसी भी स्तर पर आरएनएआई प्रदर्शन करने के लिए कर रही है, एक मजबूत प्रणालीगत आरएनएआई प्रतिक्रिया दिखाते हैं. कई जीनों के एक साथ पछाड़ना भी टी में संभव है एक ही समय 7,8 में दो या दो से अधिक अलग dsRNA अणुओं इंजेक्शन द्वारा castaneum. इसके अलावा, hypomorphic phenotypes की एक श्रृंखला dsRNA 8 इंजेक्शन की एकाग्रता कम करने से उत्पन्न किया जा सकता. इन सुविधाओं टी में पारंपरिक आगे आनुवंशिकी के लिए आरएनएआई आधारित रिवर्स आनुवंशिक तकनीक आकर्षक विकल्प बना castaneum. चूंकि लगभगसभी टी castaneum ऊतकों इस तकनीक शोधकर्ताओं विविध संदर्भों में ऊतकों की एक विस्तृत विविधता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, कोशिकी dsRNA अणुओं 9 के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. इसके अलावा, इस रिपोर्ट टी में आरएनएआई प्रदर्शन पर केंद्रित है, हालांकि castaneum, यहाँ वर्णित कई प्रक्रियाओं अन्य कीड़ों के लिए लागू कर रहे हैं. इच्छा के नुकसान के समारोह टी में उनके हित के संदर्भों में विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए इसलिए, इस प्रोटोकॉल उपयोगी है castaneum, साथ ही अन्य कीड़ों के लिए एक आरएनएआई आधारित तकनीक को लागू करने के इच्छुक शोधकर्ताओं के लिए.
लार्वा में dsRNA इंजेक्शन लार्वा, पोटा संबंधी सहित बीटल जीवन चरणों की एक किस्म पर कार्य विश्लेषण की अनुमति देता है, और वयस्क 4,5,10 चरणों. हम पहले से आणविक जीव विज्ञान प्रक्रियाओं 11 सहित हमारी समग्र लार्वा आरएनएआई प्रोटोकॉल की सूचना दी है. वर्तमान रिपोर्ट में, हम सबसे अच्छा दृश्य सहयोगियों के साथ व्याख्या कर रहे हैं जो dsRNA इंजेक्शन प्रक्रियाओं का वर्णन पर ध्यान केंद्रित. हम प्रदान करते हैंविस्तृत कदम दर कदम इंजेक्शन प्रक्रियाओं के साथ ही अच्छे और बुरे इंजेक्शन उदाहरण हैं. इस दृश्य प्रोटोकॉल हमारे पिछले प्रोटोकॉल का पूरक है, और जब संयुक्त, वे टी में लार्वा आरएनएआई प्रक्रियाओं के एक अधिक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान castaneum. इसके अलावा, हम आरएनएआई, शारीरिक अनुसंधान के लिए आरएनएआई आधारित assays के आवेदन की सफलता के साथ ही एक शिक्षण प्रयोगशाला में लार्वा आरएनएआई प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता प्रभावित हो सकता है कि dsRNA अणुओं के लिए मानकों पर चर्चा की.
वहाँ (नीचे दस्तक कई प्रयास करते समय) अलग dsRNA अणुओं के बीच की लंबाई और एकाग्रता dsRNA अणुओं की, प्रतियोगिता सहित आरएनएआई की सफलता की गारंटी करने के लिए विचार किया जाना चाहिए कि महत्वपूर्ण मुद्दों के एक नंबर रहे हैं, और बंद लक्ष्य प्रभाव की संभावना (OTE).
dsRNA की लंबाई
dsRNA अणुओं की लंबाई एक लंबी dsRNA (dsRNA की लंबी सीमा वर्तमान में अज्ञात है, हालांकि) आरएनएआई 7,14,15 ट्रिगर करने के लिए और अधिक कुशल होने के साथ, प्रणालीगत आरएनएआई प्रतिक्रिया की दक्षता प्रभावित करता है. dsRNA लंबाई टी में प्रभावी आरएनएआई प्रेरित करने के लिए 50 बीपी से अधिक समय होने की जरूरत castaneum 7. 150 बीपी और 500 बीपी के बीच dsRNA आरएनएआई प्रयोगों के लिए आदर्श होना प्रतीत होता है. अब dsRNA अणुओं का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, वे तेजी से मुश्किल हो जाएगा OTE का एक बढ़ा मौका और जीन क्लोनिंग कदम होगा.
dsRNA एकाग्रता
ve_content "> जीन पछाड़ना के विभिन्न डिग्री dsRNA की एकाग्रता के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है. 1 माइक्रोग्राम / μl (ब्याज की जीन (एस) के आधार पर भिन्न हो सकते हैं अक्सर एक के पास शून्य phenotype पैदा करता है जो एक उचित प्रारंभिक एकाग्रता, प्रतीत होता है ). आरएनएआई कभी कभी hypomorphic phenotypes (Tomoyasu के पूरक डेटा की एक श्रृंखला का उत्पादन करने के लिए फायदेमंद हो सकता है dsRNA के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने के साथ एक मजबूत आरएनएआई फेनोटाइप. आरएनएआई प्राप्त करने के लिए एक उच्च एकाग्रता (जैसे, 7-8 माइक्रोग्राम / μl) के साथ किया जा सकता है एट अल. 2009 8, और BORRAS-Castells अप्रकाशित डेटा).आरएनएआई प्रतियोगिता
एकाधिक जीन पछाड़ना टी में पूरा किया जा सकता है एक साथ कई अलग dsRNA अणुओं इंजेक्शन द्वारा castaneum. हालांकि, यह भी जीव के भीतर मौजूद कई अलग dsRNA अणुओं वाले अक्सर आरएनएआई घटकों के लिए उपयोग के लिए dsRNAs के बीच प्रतियोगिता में यह परिणाम है कि जाना जाता है <s> 7,14 अप. यह एक dsRNA (दूसरों बाहर प्रतिस्पर्धा से बचने के लिए कई जीन पछाड़ना का प्रयास करते समय सभी dsRNA के लिए एक ही लंबाई और एक ही एकाग्रता का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, हालांकि, अभिव्यक्ति के स्तर बहुत बीच मतभेद है जब dsRNA लंबाई और एकाग्रता के आगे समायोजन आवश्यक हो सकता है लक्ष्य जीन). हम, साथ ही दूसरों को सफलतापूर्वक (जैसे, Tomoyasu एट अल. 2005 16, Tomoyasu एट अल. 2009 17, और यांग एट अल. 2009 18) दोहरे और तिहरे पछाड़ना प्रदर्शन किया है. यह सभी चार लक्ष्य जीन के लिए आरएनएआई दक्षता का महत्वपूर्ण कमी के कारण होने की संभावना के रूप में होगा, चौगुनी आरएनएआई संभव (या अधिक) है, चुनौतीपूर्ण हो सकता है.
बंद को लक्षित
OTE आरएनएआई आधारित दृष्टिकोण के लिए एक अंतर्निहित चिंता का विषय है. OTE कम करने के लिए एक तरह से dsRNA डिजाइनिंग जब इन क्षेत्रों अन्य जीन के साथ इसी तरह के दृश्यों का हिस्सा है कि लक्ष्य जीन में क्षेत्रों की पहचान और बचने के लिए है. टी के खिलाफ एक साधारण ब्लास्ट विश्लेषण castaneum भविष्यवाणी जीन सेट ऐसे क्षेत्रों की पहचान कर सकते हैं. कई ऑनलाइन उपकरण भी संभावित OTE (जैसे, ई आरएनएआई 19) के मूल्यांकन की अनुमति. लक्ष्य जीन के दो गैर अतिव्यापी क्षेत्रों के लिए आरएनएआई प्रदर्शन phenotypes OTE की वजह से कर रहे हैं मनाया कि संभावना को खत्म करने के लिए एक आसान और कारगर तरीका है. आरएनएआई दो गैर अतिव्यापी क्षेत्रों में एक ही phenotypes उत्पादन के लिए अगर (दो गैर अतिव्यापी क्षेत्रों में एक समान अनुक्रम साझा जब तक) OTE की संभावना कम से कम है.
विश्लेषण करती प्ररूपी के अलावा अन्य माध्यम से पछाड़ना जीन का मूल्यांकन प्रभावी रूप से उपस्थित आरएनएआई से संबंधित डेटा को अक्सर महत्वपूर्ण है. जीन पछाड़ना का मूल्यांकन करने के लिए दो प्रमुख तरीके QRT- पीसीआर और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण कर रहे हैं. QRT- पीसीआर लक्ष्य mRNA के स्तर को मापने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है, और टी में उन सहित कई आरएनएआई से संबंधित अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है castaneum (मिलर एट अल देखें. उदाहरण के लिए 2012 7). Howevहम हाल ही में (प्रोटीन उत्पाद नीचे विनियमित है, हालांकि) लक्ष्य mRNA स्तर (BORRAS-Castells अप्रकाशित डेटा) को विनियमित आरएनएआई द्वारा होता है जिसमें कुछ मामलों को देखा है के रूप में एर, सावधानी, लिया जाना चाहिए. ऊपर विनियमन इस आरएनएआई प्रेरित mRNA व्यापक या कुछ जीनों के लिए अद्वितीय हो सकता है अगर यह वर्तमान में अज्ञात है. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण जीन पछाड़ना पुष्टि करने के लिए एक और तरीका है. यह अंतिम प्रोटीन उत्पाद की राशि के उपाय के रूप में यह विधि काफी विश्वसनीय है. लक्ष्य जीन के प्रोटीन उत्पाद के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता इस दृष्टिकोण के लिए एक नकारात्मक पहलू है. प्ररूपी विश्लेषण के अलावा कई स्वतंत्र माप का उपयोग आरएनएआई आधारित विश्लेषण द्वारा प्राप्त प्ररूपी डेटा के आत्मविश्वास में वृद्धि होगी.
टी में अपनी अवधारणा के बाद castaneum, आरएनएआई मुख्य रूप से विकास और पैटर्न गठन में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. ये टी castaneum विकास अध्ययन चरित्र में अत्यधिक सफल रहे हैंजीन की evolutionarily संरक्षित और भिन्न कार्यों terizing (Denell 2008 1 और Klingler 2004 2 में समीक्षा). टी में हालांकि, आरएनएआई आधारित पढ़ाई castaneum विकासात्मक जीव विज्ञान तक सीमित नहीं हैं. उदाहरण के लिए, आरएनएआई तनाव सहिष्णुता, लूटमार, आक्रामकता, दोस्त विकल्प, गतिविधि पैटर्न, और सुरक्षा तंत्र सहित शारीरिक और व्यवहार प्रतिक्रियाओं, की एक विस्तृत श्रृंखला में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.
इन संदर्भों को आरएनएआई आवेदन करने के एक कठिनाई pleiotropic प्रभाव की संभावना है. अक्सर, ब्याज की जीन टी भर में भूमिकाओं की एक किस्म होगा castaneum जीवन चक्र, इस प्रकार कठिन अनायास ही प्ररूपी प्रभाव के बिना जीन को हटाने बना रही है. हालांकि, आसानी चरणों की एक किस्म पर आरएनएआई प्रदर्शन करने की क्षमता अक्सर इन pleiotropic प्रभाव से बचने के लिए एक प्रभावी रणनीति हो सकती है. उदाहरण के लिए, बजाय लार्वा या pupae के वयस्कों में आरएनएआई प्रदर्शन कर हमें unin नाकाम करने के लिए अनुमति दे सकते हैंप्रारंभिक विकास के दौरान जीन पछाड़ना के कारण मारक हो जाती थी. टी में आरएनएआई प्रतिक्रिया के लचीलेपन castaneum इस प्रकार शारीरिक और व्यवहार प्रतिक्रियाओं में जीन समारोह के प्रयोगों के लिए आरएनएआई आदत डाल के लिए इस मॉडल एक आकर्षक विकल्प बनाता है.
टी castaneum प्रणाली भी एक शिक्षण प्रयोगशाला में प्रयोग के लिए आदर्श है. टी castaneum टी में आरएनएआई तकनीक लगातार subculturing बिना कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर एक आटा / खमीर मिश्रण पर आसानी से संवर्धित किया जा सकता है, और castaneum काफी सरल युवा, सीखने वैज्ञानिकों के साथ एक प्रयोगशाला के लिए अनुकूलित किया जाना है. आरएनएआई जैविक क्षेत्र की एक किस्म में एक आवश्यक तकनीक होता जा रहा है के रूप में, यह छात्रों को इस तकनीक को उजागर कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. टी में लार्वा आरएनएआई तकनीक का सीधा आगे प्रकृति castaneum भी टी, जिससे अनुसंधान में शामिल होने के लिए और अधिक छात्रों को प्रोत्साहित करती है आनुवंशिक प्रणाली उन्मुख एक कक्षा के लिए एक प्रमुख उम्मीदवार castaneum. </ P>
The authors have nothing to disclose.
हम तकनीकी समर्थन के लिए मियामी विश्वविद्यालय में जैव सूचना विज्ञान और कार्यात्मक जीनोमिक्स के लिए केंद्र (CBFG) धन्यवाद. इस काम के मियामी विश्वविद्यालय शुरू हुआ अनुदान (YT), और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (: IOS 0950964 YT) द्वारा समर्थित किया गया.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Organic whole wheat flour | Heartland Mill Inc. Kansas | G1 | |
Brewer’s Yeast | MP Biomedicals | 2903312 | Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus. |
6 oz plastic Drosophila stock bottles | Fisher Scientific | 11-888 | |
Sieve | Fisher Scientific | 04-881N | 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710µm) for larvae, pupae, and adults. |
Sieve | Fisher Scientific | 04 881 10P | 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600µm) Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder. |
Sieve receiver | Fisher Scientific | 04-866B | 8 in. diameter |
1.5 quart spouted sample pan | Seedburo Equipment Co. | Model 33 | collection pan |
Incubator | BioCold Environmental Inc | BC26-IN | Keep it 30C with 70% humidity. |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374500 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | S397-500 | |
KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
Food dye | Kroger | green, blue, or red preferable | |
Microscope glass slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
Tack-It Over&Over | Aleene's | Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies. | |
Plastic CD case | Amazon | ||
Boroslilicate Glass capillary | Sutter Instrument | BF100-50-15 | O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament |
Needle puller | Sutter Instrument | P-87 or P-97 | |
Silicone seal | Narishige | HI01PK01 | 2.5 mm |
Removable mounting putty | Loctite Fun-Tak | ||
Compressed gas duster | OfficeMax | OM96091 | |
Forceps | Fine Science Tool | 11231-30 | Dumoxel #3 (to manipulate beetles) |
Forceps | Fine Science Tool | 11252-20 | INOX #5 (to break needle tips) |
Ethyl ether, anhydrous | Fisher Scientific | E138-500 | |
Nylon mesh | Flystuff/Genessee Scientific | 57-102 | 120-um pore size/49% open area |
Media bootle 100-ml | VWR | 89000-926 | |
Stereomicroscope | Zeiss | SteREO Discovery V12. Injection microscope. | |
Stereomicroscope | Fisher/Zeiss | 12-070-513 | Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide. |
X-Y mechanical stage | Zeiss | 4354600000000000 | |
X-Y mechanical stage | Microscopenet.com | A512 | Inexpensive alternative |
Manipulator | Narishige | M-152 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
Glass capillary holder | Narishige | IM-H1 | |
30-ml disposable syringe | BD syringe | 309650 | BD Luer-Lok Tip |
Four-way stopcock | Cole-Parmer Instrument Co. | EW-30600-03 | Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip |
art paint brush | Amazon | Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece | Any general paint brush will work. |