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Summary
RNA干渉（RNAi）は、遺伝子ノックダウン技術は、 コクヌスト研究の中核にあるベース。ここでは、 コクヌストにおける当社の幼虫のRNAi技術の概要を説明します。幼虫RNAiは、研究者が多様な文脈で遺伝子機能を研究することができ、機能喪失型の表現型への迅速なアクセスを提供する単純な、しかし強力な技術である。
Abstract
コクヌストモドキ、 コクヌストは 、完全に注釈付きのゲノム配列、トランスポゾン遺伝子導入し、効果的なRNA干渉（RNAi）を含む、遺伝学的および発生研究のための実験的なツールのレパートリーを提供しています。これらの利点の中でも、RNAiをベースの遺伝子ノックダウン技術は、 コクヌスト研究の中核にある。T.コクヌストショー堅牢な全身RNAi応答は、単に甲虫の体腔内に二本鎖RNA（dsRNA）を注入することによって、任意のライフステージでのRNAiを実行することが可能となる。
本稿では、Tにおける当社の幼虫のRNAi技術の概要を説明しますコクヌスト 。プロトコルは、Tの適切な段階は、（i）単離を含み注射のためのコクヌスト幼虫 、噴射セット用（ii）の準備、および（iii）のdsRNA注入。幼虫RNAiは、機能喪失phenotypにすばやくアクセスを提供してくれ、シンプルでありながら強力なテクニックです複数の遺伝子ノックダウン表現型だけでなく、低形質の表現型のシリーズを含むES、。事実上すべてのT.以来コクヌスト組織は細胞外dsRNAの影響を受けやすい、幼虫のRNAi技術は、研究者は外部環境への生物の応答の遺伝的基礎を含む多様な文脈での多種多様な組織を研究することができます。また、この技術の単純さは、T.を作り、研究のより学生の関与を刺激教室の設定で使用するための理想的な遺伝システムをコクヌスト 。
Introduction
コクヌストモドキ、 コクヌストは 、原因部分的には、RNA干渉（RNAi）1-3を実施するのしやすさに生物学のさまざまな分野で人気を集めています。のRNAiベースの遺伝子ノックダウン技術は、複雑な遺伝的方法を利用することなく、分析科学者が機能喪失を実行することを可能にする。T.コクヌストショー堅牢な全身RNAi応答、甲虫の体腔4-6に二本鎖RNA（dsRNA）の単純な注入を介して任意の段階でRNAiを実行することが可能となる。複数の遺伝子を同時にノックダウンTにも可能である同時に7,8に2つ以上の異なるdsRNA分子を注入しコクヌスト 。また、低形質の表現型の一連の注入されたdsRNAの8の濃度を低下させることによって生成することができる。これらの機能は、Tの伝統的なフォワード遺伝学へのRNAiベースの逆遺伝学的手法魅力的な代替案を作るコクヌスト 。以来、事実上すべてのT.コクヌスト組織は、細胞外dsRNA分子9に感受性であり、この技術は、研究者が多様な状況における多種多様な組織を研究することを可能にする。また、このレポートでは、TにRNAiを行うに焦点を当てていたがコクヌスト 、ここで説明する多くの手順は、他の昆虫にも適用可能である。したがって、このプロトコルは、Tにおける興味のコンテキストで機能喪失を実行したい人のための有用な分析をされているコクヌスト 、ならびに他の昆虫へのRNAiベースの手法を適用を希望する研究者にとって。
幼虫へのdsRNAを注入すると、幼虫、蛹および成虫期4,5,10などの甲虫のライフステージのさまざまなで機能的な分析を可能にする。私たちは、以前に分子生物学の手順11を含む当社の全体的な幼虫のRNAiプロトコルを報告している。現在のレポートでは、最高のビジュアル側近で説明されていたdsRNA注入手順を記述するに焦点を当てる。私たちは、提供する詳細なステップバイステップの注入手順だけでなく、良い面と悪い面の射出例。この視覚的なプロトコルは、これまでのプロトコルを補完するものであり、組み合わせたときに、彼らはTに幼虫のRNAi手順のより包括的なビューを提供コクヌスト 。さらに、当社は、RNAi、生理学的研究のためのRNAiベースのアッセイのアプリケーションの成功だけでなく、教育の実験室での幼虫のRNAiプロトコルの適用性に影響を与える可能性dsRNA分子のパラメータについて説明します。
Protocol
1 T.コクヌスト株式および培養
- T.を決定コクヌスト株は実験に使用する。
注：いくつかの研究室に確立T.コクヌスト株が利用可能です。 のGa-1（グルジア-1）ゲノム配列3のために使用されたのGa-2の親株である。 のGa-1（例えば、一塩基多型として、SNPの）株式最もDNA多型のGa-2であるため、と少ないため近親交配へのGa-2よりも健康的である、それは、RNAi実験に最適です。PU-11を使用するか 、別の便利な株である将来ウイング原基におけるそのユニークな強化黄色蛍光タンパク質（EYFP）の発現が他の幼虫から最後の幼虫齢を区別するために私たちを可能にするので、（クラーク·Hachtel ら 2013 12 図S4を参照）。遺伝的背景が大幅にAFFに表示されるそれは、実験で使用したカブトムシ株を文書化することが重要です電気ショック療法RNAiは13を表現型。 - T.を準備（混合した後、-20℃で培養小麦粉を保存）有機全粒小麦粉にあらかじめふるいにかけビール酵母（重量）5％を追加することでコクヌスト培養小麦粉。 6オンスプラスチックショウジョウバエストックボトル（約40グラム/ボトル）を（室温）培養小麦粉を分注し。
- 文化T.湿度70％、30℃におけるコクヌスト 。湿度制御インキュベーター可能な場合に使用します。培養ボトル当たり30-40大人追加（男性：女性比1：1）培養を開始する。
注：金型はめったに培養小麦粉中のカビの成長を引き起こす可能性があり、30℃湿度70％で、より低い温度（例えば25℃）で問題ありませんが。これが発生した場合の湿度を下げる。 - 継代培養（培養小麦粉から大人を分離する方法については、ステップ5.2〜5.5を参照）2週間毎に新しい培養ボトルに大人を転送します。
注：終齢幼虫を得るために約3週間かかります。 Alternatively、T.コクヌスト培養は、より長い培養期間ではあるが、より低い温度（20〜25℃）に維持することができる（25℃での発育時間約2倍、30℃である）。
幼虫のdsRNA注射用溶液および楽器の調製
- インビトロ転写によって標的遺伝子に相同なdsRNA分子を合成する。 -80℃で保存してください。詳細な分子生物学の手順については、フィリップと寅泰2011 11を参照してください。また、dsRNA分子を設計する際に考慮される必要があるパラメータの数のための説明を参照してください。
- 1.5ミリリットルの1MのNaH 2 PO 4で8.5 50mlの1MのNa 2 HPO 4を混合することにより（25℃でpH7.6）中0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液10mlを加える。 pH計でpHを確認し、それに応じて調整します。
- 100 _、（25℃でpH7.6）中0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液10μlを混合して10×注入緩衝液1mlを作る6;リットルの0.5MのKCl、緑の食用色素を100μl、及び二重蒸留水を790μlの（のddH 2 O）である。 2倍注入バッファー（200μlの10×注入緩衝液+800μlののddH 2 O）を作るために10倍の注入バッファーを希釈する。必要になるまで4℃で10倍と2倍の注入·バッファの両方を格納します。
- スティッキースライドガラスを準備します。
- 幼虫注射用の再配置可能な接着剤の形で全体をガラススライドをカバー。大人や蛹の注射のために、スライドの長辺に沿って接着剤の二つの薄いストリップを作る。
- また、注入後のそれらの除去を容易にするのに十分柔軟なまま接着剤は、接着剤がスライドにカブトムシを接着するのに十分な粘着性のままであることを保証し、数日間乾燥することができます。
注：接着剤があまりにも粘着性のままの場合、指を使用し、粘着性を低減れる、糊をタップします。各スライドは40または50カブトムシを保持することができ、それがしっかりと動物を保持するために失敗するまで再利用することができます。 Alternテープは、時には幼虫を保持するのに十分な接着剤ではないがatively、両面テープを使用することもできる。
- エーテル麻酔バスケットを作成します。
- 10ミリリットルの使い捨て注射器からプランジャーを外し、6ミリリットル線の周り半分に注射器を切った。
- 注射器の下半分を捨てる。簡単に説明すると、ガスバーナーで注射器の上部の切断面を加熱して、すぐに注射器の上にメッシュを接着するナイロンメッシュの部分に溶融プラスチックを押してください。プラスチックが硬化後に余分なメッシュを離れてトリミング。
- エーテルボトルを準備します。狭い口100または250mlのガラス瓶にエーテル30mlを加える。エーテルの蒸発を高めるためにティッシュペーパーのいくつかの部分を追加する。
注：エーテルは、火災の危険性を提示し、また、有害である。常にヒュームフードの下でエーテルを扱う。使用していないながら、しっかりとふたを閉めます。
注：氷はsedatioが、（そのような教室の設定のように）安全な代替として使用することができますnがあまり効果的である。
幼虫噴射装置の調製
- 解剖顕微鏡上にXYメカニカルステージを配置します。
注：XYメカニカルステージは、主要な顕微鏡の会社から提供されています。あるいは、安価な顕微鏡ステージはまた、いくつかの修正をほとんど解剖顕微鏡のために使用することができる（例えば、材料表を参照）。 - XYメカニカルステージに近い機械的針マニピュレータを配置します。
- 注射器を組み立てます。注射針内の圧力に影響を与えることなく、注射器の操作をできるように、ガラス針ホルダーに30ミリリットル使い捨て注射器を接続するために（ルアー接続を持つ）4方活栓を使用してください（詳細な注射器のためのフィリップと寅泰2011 11を参照してくださいアセンブリ）。
4。引っ張る注射針
- によるホウケイ酸ガラス針（0.5ミリメートル、長さ15cm：1ミリメートル、ID B100-50-15、OD）を引い針プラー。
注：サッターP-87やP-97は、設定に使用の場合は「熱= 70、= 45、ヴェル= 75、時間= 90を引いて」またはピペットクックブックの第2章は、次のとおりです。付着細胞を、Cを虫 、 ショウジョウバエ 、 ゼブラフィッシュ ＆ -推奨プログラム。最適な設定は、針プラーの機種によって異なります。一般的なショウジョウバエの注射針の設定が良い出発点である。 - ストア（ 例えば、プラスチックのCDケース）プラスチックケースに針を引っ張り、取り外し可能な取り付けパテで固定します。
5。単離と幼虫の選択
- ふるい受信機の上に＃25のふるいを置きます。
- ふるい上の培養瓶（カブトムシや文化粉）の内容を置き、すぐに内容をふるいにかける。幼虫はすぐにふるいを通して穴を掘ると動けなくしようとして、ふるい分けすることなく、ふるい上のコンテンツに放置しないでください。積極的に小麦粉落下させるために内容をふるいにかける通し、ふるいの上の背後にある古い幼虫（典型的には6 番目と7 番目の齢幼虫）、蛹および成人（そのキャストオフ甘皮と一緒に、脱皮殻）のままにします。
- シードパンにふるい（カブトムシや脱皮殻）上に残っている資料を転送します。逃げるのカブトムシを防ぐために鍋をタップしてください。
- 優しくシードパンの上に吹き付けることにより甲虫の表面に残った脱皮殻と小麦粉粒子を取り除きます。
- 鍋の底にコンテンツを移動するために、種パンをタップします。その後、数秒間未開発のパンを残して。山から出てくるように、他のステージよりも移動性で大人のを待ちます。芸術の絵筆（ 例えば、1cmの幅）を使用して、大人を削除します。
- 蛹が速く、口に向かって転動する傾向があるので、やや下向きにパンの口を維持しながら、静かにシードパンをノックで区切り蛹。シードパンだけ幼虫を残して、蛹を除去するために絵筆を使用してください。
- Plのきれいなペトリ皿に孤立した幼虫エース。注射のための幼虫の適切な段階を選択して、個別のペトリ皿に配置します。
注：大人の形態は上だけでなく、変態に対するRNAi効果を分析する際に早期終齢幼虫（最終幼虫脱皮後の1〜2日）は、多くの場合に適しています。しかし、時には必要（ 例えば 、3E-3Hを示します。また、クラーク·Hachtel ら 2013 12参照）は、初期遺伝子機能を評価するために、最後から二番目に（あるいはそれ以前）のステージを、RNAiを行うことである。幼虫の齢を特定するために、サイズの基準と蛹を使用してください。終齢幼虫蛹よりわずかに長い。あるいは、PU-11は、終齢幼虫を識別するだけでなく、終齢幼虫の発達（クラーク-Hachtel 図S4 ら 2013 12）の時間経過を決定するために用いることができる。 - エーテル麻酔まで、ペトリ皿内の選択された幼虫を保管してください。残りを置きます幼虫と小麦粉の背中培養ボトルに（例えば蛹と大人のような）カブトムシの他の段階の、インキュベーターに戻す。
注射針の6。準備
- 粘着性のタックや両面テープのいずれかを使用してガラス顕微鏡スライド上に、以前に引っ張らガラス針を配置します。ここで、先端湾曲部を見るために解剖顕微鏡を覗きながら、鉗子を使用して、針の引か終わりをテストします。針は鉗子で曲がるところの先端側に向かってわずかエリアをつかみ、破るねじる。
- 良い針を保持し、他のものを捨てる。それはどちらも大きすぎても小さすぎて開いた良好な針を考慮する（約0.05mm径が図1Aおよび図1B）、及び幼虫のクチクラ容易に（ 図1Bおよび2A-2B）の浸透を作るために傾斜している。 diffi針へのdsRNA液の取り込みを行う、などの悪い針（ⅰ）が小さすぎるを考えるカルト（ステップ7）（ 図1Dおよび2D）、（ⅱ）大きすぎて、注射時の幼虫の傷害および可能な致死を引き起こす（ 図1C及び2F）、（iii）の鈍い、クチクラの浸透を困難にし、怪我を増やす。
- ニードルホルダーに針を挿入します。
- まず、針ホルダの先端を外し、ホルダー先端に針の後端を置く。次に、（ガラス針の後端から少なくとも1cm）、ホルダー先端の下にゴム製のガスケットを配置します。
- 完全に針ホルダーの開口部に挿入されたゴム製のガスケットで、ホルダーに針の後部を挿入します。バックホルダーの上にチップをねじ込みます。
- 針マニピュレータ上に組み立てニードルホルダーを配置します。水平に近い針ホルダを保管してください。 MICRを通して見たときに針の先端がビューの中心に位置するように、マニピュレータの位置を調整しますoscope。
針の中に7前倒しのdsRNAソリューション
- のddH 2 Oで濃度を調整し、2倍の注入バッファー（ステップ2.3）の等容量のdsRNA溶液を混合することにより直前に注射のdsRNA注射溶液を調製する。氷上で混合溶液を保管してください。 dsRNAの濃度についての説明を参照してください。
- 20μlの使い捨てピペットチップの先端をカットします。トリミングされたピペットチップへの溶液のピペットを10μl。背圧を提供することで、先端に流体を維持しながら、慎重にピペットからピペットチップを取り外します。代わりに、慎重にヒントを削除してから、指を使って圧力を提供することにより、チップの先端にソリューションを移動します。
- 針の先端が直面している開口部と粘着性のタックを用いた顕微鏡ステージ上のdsRNA溶液でピペットチップを置きます。
- 顕微鏡で見ると、ゆっくりの先端まで、針に向けてロードされた先端部を移動させる針はちょうどロードされたピペットチップの内側で溶液中にある。
- 顕微鏡で見ながら、静かにゆっくりと針内のdsRNAソリューションを引っ張って注射器のプランジャに引き戻す。
注：針をオーバーロードしないでください。 dsRNAの溶液の端部が針の先端に近づくにつれて、針の先端が空気に到達する前に、引上げ速度を遅くし、溶液を装填停止。空気が先端に達すると、溶液は速やかに重大な汚染問題をもたらし、針ホルダ内に引き込まれる。針ホルダの詳細なクリーニング手順は、フィリップと寅泰2011 11で説明されています。 - ストップコックを開いて、注射器と針ホルダからの圧力を取り除きます。その後、針の先端から離れたピペットチップを移動します。ステージ上に幼虫を配置しながら、誤って針の損傷を防止するために、段階から針を持ち上げます。ステージからの空にピペットチップを取り外します。 8 dsRNAをインジェクション
- エーテル麻酔のバスケットに幼虫を置きます。テクニックを学ぶ場合は、10未満の幼虫を使用してください。技術に一度、快適な1ラウンドで30〜40幼虫を使用してください。
- エーテル瓶の中に幼虫をバスケットを置き、ふたを閉じます。
注：エーテルは、火災の危険性を提示し、また、有害である。ヒュームフードの下に、この手順を実行します。 - 約3分間のエーテル麻酔をかける幼虫。 3分後に移動のための幼虫を確認してください。彼らはまだ動いている場合は、別の30秒、エーテル瓶でそれらをバックに置きます。これは致死性を高めることができるように5分間以上エーテル麻酔をかけるしないでください。
注：最適なエーテル麻酔時間は、温度や湿度に応じて変化し得る。 - ガラススティッキースライドの非粘着端にバスケットからエーテル化幼虫を転送します。顕微鏡を見ながら鉗子を使用して、1ずつ幼虫1をピックアップし、スライド上に配置します。 F自分の体を下にタップそっと横にそれらを置き、あなたが行くようにピンセットで尾ロム頭、少し彼らはスライド上に固定されていることを確認するために、それらをストレッチ。
- 顕微鏡ステージ上の幼虫との粘着性のスライドを置きます。
- CNSの損傷を防ぐために、幼虫の背側に静かにdsRNAをロードされた針を挿入します。幼虫の心がここに置かれているとしても、背側正中線を避けてください。この以降では、常に（代わりに針を移動するために、針マニピュレータを使用しての）針に幼虫を移動するためのステージを使用しています。
注：特定の注射部位TのRNAiのように重要ではありませんコクヌストは、全身であるように思われる。しかし、胸部や腹部のセグメントの背側に注入することが通常最も簡単です。 - 幼虫に針を挿入した後、dsRNAは幼虫の体腔を入力するためのスペースを確保するために、少し戻って針を引く。
- 幼虫ターン緑（または注入バッファーの色）になるまで注射器を軽く押して、秒を見てtretchedとフル。
注：技術を学ぶ場合、有意な致死性なし幼虫に注入することができる溶液の量を決定するために、できるだけ多くを注入しようとする。これは、一般に約0.5〜0.7μlです。 - 幼虫から針を外します。針を除去しながら、わずかに（これも空気中に引っ張らないように注意してください）のdsRNAの損失を回避するために、注射器に引き戻す。
- スライド上のすべての幼虫を注入。成功裏に注入されていなかった幼虫を削除してください。幼虫の前に完全な注入は（約10分で）目を覚ます。
- 注射顕微鏡から注入された幼虫をスライドを削除し、すべての幼虫がエーテル麻酔から回復するまで、さらに5分間のスライドを残す。
- 鉗子でと解剖顕微鏡下で、静かに粘着性のスライドからそれらを解放するために先頭から末尾までの幼虫を持ち上げます。きれいなペトリ皿に新しくリリースされた幼虫を置きます。 W注入を可能にするために10〜15分間シャーレ上で幼虫のままにします凝固さound。
- 適切に系統名を含むクリーン小麦粉とラベルを持つ新しいボトルに幼虫を置き、dsRNAのタイプは、dsRNAの濃度、注入された幼虫の数、および日付を注入した。
- 文化70％の湿度で30℃で注入した幼虫。定期的にRNAiの表現型のための幼虫を観察します。
注：7日以内に終齢幼虫蛹になる。 （RNAiにより引き起こされるタイミングに異常がない場合）、次に、蛹は7日後に成虫に孵化するであろう。 - そのような定量的逆転写-PCR（定量RT-PCR）とウェスタンブロッティングのようないくつかの異なる分子生物学技術によってノックダウンRNAiの効率性を評価することを検討してください。それぞれ、詳細な定量PCRおよびウエスタンブロットプロトコルに対してMiller ら 2012 7とフィリップと友康2011 11を参照してください。
- RNAiの関連表現型を分析します。
注：関連するRNAi表現型は、標的とした遺伝子に応じて、いくつかの異なる段階で、異なる培養条件下で観察することができる。 RNAiは、カブトムシの形態、変態、生理学、行動に影響を与えることができる。どのくらいの頻度で表現型の存在がチェックされ、どのような条件の下でカブトムシが飼育されていることはRNAiを介して調査されて具体的な質問に合わせて調整する必要があります。
ノックダウンおよび表現型解析の9。確認
Representative Results
成功した注射のための重要なステップの一つは、良好な針を作ることです。ステップ6で説明したように、針の先端が前T.を注入により破壊される必要があるコクヌスト 。良い及び悪い針の例としては、 図1に示されている。良い針は0.05mm程度の直径の開口（ 図1B）と、鋭利な硬い先端を有する。
図2は、成功した注射（ 図2Aおよび2B）だけでなく、失敗した注射剤（ 図2C-2F）のいくつかのケースを提示します。適切なサイズの注射針と、針の先端は、最小の抵抗（ 図2A）と幼虫のクチクラを貫通し、およびdsRNA溶液（緑色）は、任意の漏れ（ 図2B）ことなく幼虫に流れ込む。それも適切なサイズの注射針とのdsRNA溶液をオーバーフロー（ 図原因になりますように、過剰注入しないでください2C）。針の先端が薄すぎると、ニードルチップは、多くの場合（ 図2D）注射が困難で、幼虫のキューティクルと屈曲部を貫通することができない。この問題が発生した場合、トリミングニードルチップは、時には役立ちます。大きな針は幼虫のクチクラ（ 図2E）を貫通するいくつかの困難はあるものの、多くの場合、まだ使用可能である。しかしながら、dsRNAの溶液を大量に容易しばしばdsRNAの溶液（ 図2F）のオーバーフローを生じるとしても注射器にわずかな圧力で針から押し出される。
RNAiを行う場合は、観察された効果は、dsRNAの非特異的効果、又は引き起こされる損傷のような注射手順（の結果ではないことを確認するためにRNAiが正常に動作していることを評価するための陽性対照、および陰性対照を有することが重要である注射、またはエーテル麻酔からの異常）による。 EYFPを標的とするdsRNAの注射は、としての役割を果たすことができる良い陽性対照PU-11株 5,7を使用した場合。 EYFP dsRNAは、最後の幼虫に注入されると、将来の翼原基におけるEYFPシグナルの有意な減少が、早くも1日後噴射（ 図3A）として観察することができる。 EYFPのノックダウンは、dsRNAの濃度は1など（十分に高い場合蛹（ 図3C及び3D）を通って、カブトムシの一生持続する二日EYFPのdsRNA（ 図3B）を注入し、このノックダウンした後に完了したμgの/μl）を、非内因性遺伝子配列であり、形態学的または生理学的混乱（ 図3A〜3D）を引き起こすべきではない7。EYFP dsRNAは、陰性対照としても使用することができる。
私たちは、どのようにEFの別の例として、 痕跡（VG）のための幼虫RNAiの画像、クリティカル翼遺伝子12を提供したこの注射ベースのRNAi技術はTにあるfective コクヌスト 。 VGのためのdsRNAは最後から二番目の段階の幼虫（最後の幼虫期の前に1段目）に注入されると、翼構造体の完全な喪失は、蛹（ 図3Eおよび3F）で観察することができる。その結果、大人にも完全に翼構造（ 図3Gおよび3H）を欠いている。 VGのためのRNAiの結果は堅牢性とT.におけるRNAiの全身の両方の性質を例示しているコクヌスト 。
図1：切れ目のない良い、悪い針の（A）（B）としてはよく壊れた良い針の先端（C）が大きすぎると鈍いです壊れた針の先端（D）の先端。損紙の薄すぎる、n個の針。スケールバー（赤色）は0.05ミリメートルである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：（A）A、適切なサイズの注射針は、終齢幼虫に挿入された（B）幼虫が適切に緑色のdsRNA溶液を注入した（C）過剰注入による注入点でのdsRNA溶液のオーバーフロー（D ）幼虫クチクラに浸透することができない細い針を。（E）終齢幼虫に挿入された大規模な注射針。（F）幼虫は、オーバーフローおよびdsRNA液の漏れ、その結果、大規模な針で注入した。矢印は、針を示している。ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：T.で成功したRNAiの例コクヌスト。（AD）EYFP 発現の減少におけるEYFPのdsRNA結果の最後の幼虫注入。から得られる（A）幼虫注射後1日である。（B）幼虫二日注射後。（C）コントロール蛹。（D）蛹幼虫EYFPのdsRNA注入。陰性対照は緩衝液インジェクション（A、B）およびDsRedの dsRNAの注入（C、D）である。矢頭および矢印は、EYFPの発現を示すか、それぞれ、翼原基と目にその欠如。（EH）ペンVGのための究極の幼虫のRNAi。（E）野生型蛹。（F）VGのRNAi蛹。翼構造の欠如は、蛹（矢印）。G）野生型の大人。（H）VGたRNAi成人ですでに表示されている。ウィング関連構造が完全に（矢印）が欠落している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
dsRNA分子の長さと濃度を含むRNAiの成功を保証するために考慮する必要がある重要な問題の数、異なるdsRNA分子間の競争（しようとした複数のノックダウン時）、およびオフターゲット効果の可能性があります（OTE）。
dsRNAは長
dsRNA分子の長さは、（dsRNAの長い上限は現在不明であるが）長いdsRNAがRNAiの7,14,15をトリガするために、より効率的であることで、全身のRNAi反応の効率に影響を与える。 dsRNAは長さがTに効果的なRNAiを誘導するために50塩基対よりも長いことが必要であるコクヌスト 7。 150 bpおよび500bpの間のdsRNAはRNAi実験のための理想的であるように思われる。長いdsRNA分子を用いることもできるが、それらはますます困難になるOTEの機会が増加し、遺伝子クローニング段階を有することになる。
dsRNAは濃度
ve_content ">遺伝子ノックダウンの程度が異なるが、dsRNAの濃度に応じて実現することができる。を1μg/μlを頻繁に近いヌル表現型を生産するための妥当な出発濃度、であるように思われる（目的の遺伝子（群）によって異なる場合があります）。RNAiは、より強いRNAiの表現型を得るために、より高い濃度（ 例えば 、7〜8μgの/μl）を用いて行うことができる。dsRNAの段階希釈したRNAiは、時には低形質の表現型のシリーズを生成するために有益であることができる（寅泰の補足データら 2009年8、Borràs-カステル未発表データ）。RNAiのコンクール
複数遺伝子ノックダウンは、T.で達成することができる同時に、いくつかの異なるdsRNA分子を注入しコクヌスト 。しかし、それはまた、生物内に存在するいくつかの異なるdsRNA分子を有することが多いのRNAiのコンポーネントにアクセスするためのdsRNA間の競争が生じることが知られている
オフターゲティング
OTEは、RNAiベースのアプローチのための固有の問題である。 OTEを最小化する一つの方法は、dsRNAを設計する際にこれらの領域を他の遺伝子と類似の配列を共有する標的遺伝子内の領域を識別し、回避することである。 T.に対する単純なBLAST分析コクヌストの予測遺伝子セットは、そのような領域を識別することができます。いくつかのオンラインツールは、潜在的なOTE（ 例えば、E-RNAiの19）の評価を可能にする。標的遺伝子の2つの非重複領域のためのRNAiの実行は、表現型がOTEによって引き起こされる観察可能性を排除するための簡単で効率的な方法である。 （二つの非重複領域に類似の配列を共有しない限り）は、2つの非重複領域のため、RNAiは、同じ表現型を生成する場合OTEの可能性が最小化される。
表現型の解析以外の手段によって遺伝子ノックダウンの評価は、多くの場合、効果的に存在するRNAi関連のデータに重要である。遺伝子ノックダウンを評価するための二つの主要な方法は定量RT-PCRおよびウエスタンブロット分析である。定量RT-PCRは、標的mRNAのレベルを測定する便利な方法であり、T.のものを含む多くのRNAi関連の研究において使用されているコクヌスト （Miller らを参照してください。2012年7など）。しかし、それが私たちは最近、標的mRNAレベルはRNAiを（タンパク質産物が下方制御されているが）（Borràs-カステル未発表データ）によってアップレギュレートされているいくつかのケースを見てきたようにER、注意が、注意しなければならない。アップレギュレーションこのRNAiを誘発されたmRNAが広範囲または特定の遺伝子に特有のものができればそれは現在不明である。ウェスタンブロット分析は、遺伝子ノックダウンを確認するための別の方法である。それは最終タンパク質産物の量を測定するため、この方法は非常に信頼性があります。標的遺伝子のタンパク質産物に対して特異的な抗体の必要性は、このアプローチの欠点である。表現型分析に加えて、複数の独立した測定値を利用するのRNAiベースの分析によって得られた表現型データの信頼性を増加させる。
Tのその構想以来、 コクヌスト 、RNAiは、主に開発し、パターン形成において遺伝子機能を研究するために使用されてきた。これらのT。コクヌスト発達研究がCHARACで非常に成功している遺伝子の進化的に保存されており、分岐した機能をterizing（Denell 2008年及び2004クリングラー2に概説されている）。 Tのしかし、RNAiをベースの研究コクヌストは発生生物学に限定されるものではない。例えば、RNAiは、ストレス耐性、捕食、攻撃性、配偶者選択、活動パターン、および防御機構を含む、生理学的および行動反応、広範囲の遺伝子機能を研究するために利用することができる。
これらのコンテキストにRNAiを適用する一つの問題は、多面的効果の可能性である。多くの場合、目的の遺伝子は、Tを通じてさまざまな役割を持つことになりますコクヌストのライフサイクルは、このように困難な意図しない表現型効果なし遺伝子の除去を行う。しかし、簡単にステージの多様でRNAiを実行する能力は、多くの場合、これらの多面的な効果を回避するための有効な戦略であることができる。たとえば、代わりに幼虫や蛹の成人でRNAiを行うことは、私たちはUNINを回避できる可能性がある初期の開発中に遺伝子ノックダウンによって引き起こされる致死性を傾向があった。 TのRNAi応答の柔軟性コクヌストは、このように 、このモデルの生理学的および行動反応における遺伝子機能の実験にRNAiを適合させるための魅力的な選択肢となります。
T.コクヌストシステムはまた、教授の研究室での使用に最適です。T.コクヌストは、頻繁な継代培養せずに室温（25℃）で小麦粉/酵母混合物に容易に培養すること、およびT.におけるRNAi技術ができるコクヌストは若い、学習科学者と研究室に適応できるほど簡単である。 RNAiは、生物学のさまざまな分野において必須の技術になってきているように、学生は、この技術にさらされていることが重要です。 Tの幼虫のRNAi技術の直接的な性質コクヌストもTを作り、研究に関与することが、より多くの学生を奨励教室指向遺伝システムのための主要な候補をコクヌスト 。</ pの>
Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
私たちは技術的なサポートのためにマイアミ大学のバイオインフォマティクスやゲノム機能研究センター（CBFG）を感謝します。この作品は、マイアミ大学の起動許可（YT）、国立科学財団（：IOS 0950964 YT）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organic whole wheat flour | Heartland Mill Inc. Kansas | G1 | |
| Brewer’s yeast | MP Biomedicals | 2903312 | Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus. |
| 6 oz plastic Drosophila stock bottles | Fisher Scientific | 11-888 | |
| Sieve | Fisher Scientific | 04-881N | 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710 µm) for larvae, pupae, and adults. |
| Sieve | Fisher Scientific | 04 881 10P | 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600 µm) Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder. |
| Sieve receiver | Fisher Scientific | 04-866B | 8 in. diameter |
| 1.5 Quart spouted sample pan | Seedburo Equipment Co. | Model 33 | collection pan |
| Incubator | BioCold Environmental Inc | BC26-IN | Keep it 30 °C with 70% humidity. |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374500 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S397-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Food dye | Kroger | green, blue, or red preferable | |
| Microscope glass slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
| Tack-It Over&Over | Aleene's | Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies. | |
| Plastic CD case | Amazon | ||
| Boroslilicate glass capillary | Sutter Instrument | BF100-50-15 | O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. Without filament |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-87 or P-97 | |
| Removable mounting putty | Loctite Fun-Tak | ||
| Compressed gas duster | OfficeMax | OM96091 | |
| Forceps | Fine Science Tool | 11231-30 | Dumoxel #3 (to manipulate beetles) |
| Forceps | Fine Science Tool | 11252-20 | INOX #5 (to break needle tips) |
| Ethyl ether, anhydrous | Fisher Scientific | E138-500 | |
| Nylon mesh | Flystuff/Genessee Scientific | 57-102 | 120 µm pore size/49% open area |
| Media bottle, 100 ml | VWR | 89000-926 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | SteREO Discovery V12. Injection microscope. | |
| Stereomicroscope | Fisher/Zeiss | 12-070-513 | Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide. |
| X-Y mechanical stage | Zeiss | 4354600000000000 | |
| X-Y mechanical stage | Microscopenet.com | A512 | Inexpensive alternative |
| Manipulator | Narishige | M-152 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Glass capillary holder | Narishige | IM-H1 | |
| 30 ml Disposable syringe | BD syringe | 309650 | BD Luer-Lok Tip |
| Four-way stopcock | Cole-Parmer Instrument Co. | EW-30600-03 | Stopcocks with Luer connections; 4-way; male slip |
| Art paint brush | Amazon | Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece | Any general paint brush will work. |
References
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- Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
- Tomoyasu, Y., et al. Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium. Genome biology. 9, R10 (2008).
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi. PLoS ONE. 7, e47431 (2012).
- Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles. Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).
- Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Larval RNAi in Drosophila. Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).
- Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evolutio., & development. 1, 11-15 (1999).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).
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- Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC genomics. 14, 5 (2013).
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- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).
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分子生物学、問題92、RNA干渉、RNAiは、遺伝子ノックダウン、コクヌストモドキ、Erratum
Formal Correction: Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum
Posted by JoVE Editors on 10/01/2015.
Citeable Link.
An erratum was issued for Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.
Step 4.1 was updated from:
Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.
to
Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 770, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.
