RNA-interferens (RNAi) -baserade gen knockdown tekniker är kärnan i Tribolium forskning. Här ger vi en översikt över vår larver RNAi teknik Tribolium castaneum. Larvernas RNAi är en enkel, men kraftfull teknik som ger snabb åtkomst till förlust-of-funktion fenotyper, där forskarna att studera genfunktioner i olika sammanhang.
Den röda mjölbagge, Tribolium castaneum, erbjuder en repertoar av experimentella verktyg för genetiska och utvecklingsstudier, inklusive ett fullt kommenterad genomsekvens, transposon-baserade genmodifiering, och effektiv RNA-interferens (RNAi). Bland dessa fördelar, RNAi-baserade gen knockdown tekniker är kärnan i Tribolium forskning. T. castaneum visa en robust systemisk RNAi svar, vilket gör det möjligt att utföra RNAi helst livsfas genom att helt enkelt spruta in dubbelsträngat RNA (dsRNA) i skalbaggen kroppshålan.
I denna rapport ger vi en översikt över vår larver RNAi teknik T. castaneum. Protokollet omfattar (i) isolering av den riktiga etappen av T. castaneum larver för injektion, (ii) förberedelse för inställningen injektion, och (iii) dsRNA injektion. Larvernas RNAi är en enkel, men kraftfull teknik som ger oss snabb tillgång till förlust av funktions phenotypes, däribland flera gen knockdown fenotyper samt en serie hypomorphic fenotyper. Eftersom så gott som alla T. castaneum vävnader är känsliga för extracellulärt dsRNA tillåter larver RNAi-tekniken forskare att studera en mängd olika vävnader i olika sammanhang, bland annat den genetiska grunden för organism svar på den yttre miljön. Dessutom enkelheten i denna teknik stimulerar fler studentengagemang i forskning, vilket gör T. castaneum en idealisk genetiskt system för användning i ett klassrum.
Den röda mjölbagge, Tribolium castaneum, ökar i popularitet inom olika områden av biologin beror delvis på hur lätt utföra RNA-interferens (RNAi) 1-3. RNAi-baserade gen knockdown tekniker hjälper forskarna att utföra förlorad funktionsanalyser utan att använda komplexa genetiska metoder. T. castaneum visa en robust systemisk RNAi svar, vilket gör det möjligt att utföra RNAi i något skede genom enkel injektion av dubbelsträngat RNA (dsRNA) i skalbaggen kroppshålan 4-6. Samtidig knockdown av flera gener är också möjlig i T. castaneum genom insprutning av två eller flera olika dsRNA molekyler samtidigt 7,8. Dessutom kan en rad hypomorphic fenotyper genereras genom att minska koncentrationen av injicerat dsRNA 8. Dessa funktioner gör RNAi-baserade omvända genetiska tekniker attraktiva alternativ till traditionella termins genetik i T. castaneum. Eftersom så gott somalla T. castaneum vävnader är känsliga för extracellulära dsRNA molekyler 9, denna teknik gör det möjligt för forskare att studera en mängd olika vävnader i olika sammanhang. Även om denna rapport är inriktad på att utföra RNAi i T. castaneum, många procedurer som beskrivs här gäller för andra insekter. Därför är detta protokoll användbar för dem som vill utföra förlorad funktionsanalyser i sina sammanhang av intresse i T. castaneum, liksom för forskare som vill tillämpa en RNAi-baserad teknik för att andra insekter.
Injektion dsRNA till larver gör funktionsanalys på en mängd olika skalbaggar levnadsstadier, inklusive larver, pupal och vuxna stadier 4,5,10. Vi har tidigare rapporterat vår övergripande larv RNAi-protokollet inklusive molekylärbiologiska förfaranden 11. I den aktuella rapporten fokuserar vi på att beskriva dsRNA injektion rutiner vilka bäst förklaras med visuella medhjälpare. Vi tillhandahållerdetaljerade steg-för-steg-injektion förfaranden samt goda och dåliga insprutnings exempel. Denna visuella protokoll kompletterar vår tidigare protokollet och när de kombineras, de ger en mer heltäckande bild av de larver RNAi förfaranden T. castaneum. Dessutom diskuterar vi parametrarna för dsRNA molekyler som kan påverka framgången för RNAi, tillämpning av RNAi-baserade analyser för fysiologisk forskning, samt tillämpligheten av larver RNAi-protokollet i en undervisningslaboratorium.
Det finns ett antal viktiga frågor som måste övervägas för att säkerställa framgång för RNAi, inklusive längd och koncentration av dsRNA molekyler, konkurrens mellan olika dsRNA molekyler (vid försök multipel slå ner), och möjligheten att ej åsyftade effekter (OTE).
dsRNA Längd
Längden på dsRNA molekyler påverkar effektiviteten av den system RNAi svaret, med en längre dsRNA är mer effektivt att utlösa RNAi 7,14,15 (även om längre gränsen för dsRNA är för närvarande okänt). Den dsRNA längd måste vara längre än 50 räntepunkter till framkalla effektiva RNAi i T. castaneum 7. dsRNA mellan 150 bp och 500 bp verkar vara perfekt för RNAi-experiment. Även längre dsRNA molekyler kan också användas, kommer de att ha en ökad risk för OTE och genen-kloning steg kommer att bli allt svårare.
dsRNA Koncentration
ve_content "> Olika grader av genen knockdown kan uppnås beroende på koncentrationen av dsRNA. 1 ug / ul tycks vara en rimlig startkoncentration, vilket ofta ger en nära-noll-fenotyp (kan variera beroende på den gen (er) av intresse ). RNAi kan utföras med en högre koncentration (t.ex., 7-8 ng / ^ il) för att erhålla en starkare RNAi fenotyp. RNAi med en serieutspädning av dsRNA kan ibland vara fördelaktigt att producera en serie av hypomorphic fenotyper (Supple Data av Tomoyasu et al. 2009 8, och Borràs-Castells opublicerade data).RNAi Konkurrens
Flera gen knockdown kan åstadkommas på T. castaneum genom injicering av ett flertal olika dsRNA molekyler samtidigt. Emellertid är det också känt att ha flera olika dsRNA molekyler i organismen resulterar ofta i konkurrensen mellan dsRNAs för tillträde till RNAi komponenterna <supp> 7,14. Det är viktigt att använda samma längd och samma koncentration för alla dsRNA vid försök flera gen knockdown för att undvika en dsRNA ut-konkurrerar andra (även om ytterligare justeringar av dsRNA längd och koncentration kan behövas när uttrycksnivåer varierar stort målgenerna). Vi, liksom andra, har framgångsrikt utfört dubbel och trippelknockdown (t.ex. Tomoyasu et al. 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, och Yang et al. 2009 18). Även möjligt, fyrdubbla RNAi (eller flera) kan vara en utmaning, eftersom det sannolikt skulle leda till betydande minskning av RNAi effektivitet för alla fyra mål gener.
Off-inriktning
OTE är en inneboende oro för RNAi-baserade metoder. Ett sätt att minimera OTE är att identifiera områden i målgenen som delar liknande sekvenser med andra gener och undvika dessa regioner vid utformningen dsRNA. En enkel BLAST-analys mot T. castaneum förutspådde gen set kan identifiera sådana områden. Flera online verktyg kan också utvärdera potentiella OTE (t.ex. E-RNAi 19). Performing RNAi för två icke-överlappande regioner av målgenen är ett enkelt och effektivt sätt att eliminera möjligheten att observerade fenotyper orsakas av OTE. Möjligheten att OTE minimeras om RNAi för två icke-överlappande regioner producerar samma fenotyper (om inte de två icke-överlappande områden delar en liknande sekvens).
Utvärdera gen knockdown av andra än fenotypisk analys medel ofta är avgörande för att på ett effektivt sätt presentera RNAi-relaterade uppgifter. Två viktiga sätt att utvärdera gen knockdown är QRT-PCR och Western blot-analys. QRT-PCR är ett bekvämt sätt att mäta graden av mål-mRNA, och har använts i många RNAi relaterade studier inklusive de i T. castaneum (se Miller et al. 2012 7 till exempel). However, ska försiktighet iakttas, eftersom vi nyligen har sett några fall där mål-mRNA nivån är uppregleras av RNAi (även om protein produkten nedregleras) (Borràs-Castells opublicerade data). Det är för närvarande okänt om detta RNAi inducerade mRNA uppreglering kan vara omfattande eller unikt för vissa gener. Western blot-analys är ett annat sätt att bekräfta gen knockdown. Denna metod är ganska tillförlitliga eftersom den mäter mängden av den slutliga proteinprodukten. Kravet på en specifik antikropp mot proteinet produkten av målgenen är en nackdel med detta tillvägagångssätt. Använda flera oberoende mätningar utöver fenotypisk analys kommer att öka förtroendet för de fenotypiska data som erhålls genom RNAi-baserade analyser.
Sedan dess utformning i T. castaneum, har RNAi främst använts för att studera geners funktion i utvecklingen och mönsterbildning. Dessa T. castaneum utvecklingsstudier har varit mycket framgångsrika i känneterizing evolutionärt bevarade och avvek funktioner gener (översikt i Denell 2008 1 och Klingler 2004 2). Men RNAi-baserade studier i T. castaneum är inte begränsade till utvecklingsbiologi. Till exempel kan RNAi utnyttjas för att studera genfunktion i ett brett spektrum av fysiologiska och beteendemässiga reaktioner, inklusive stresstolerans, predation, aggression, partnerval, aktivitetsmönster, och försvarsmekanismer.
En svårighet att tillämpa RNAi till dessa sammanhang är sannolikheten för pleiotropa effekter. Ofta kommer gener av intresse att ha en mängd olika roller i hela T. castaneum livscykel, vilket gör avlägsnandet av gener utan oavsedda fenotypiska effekter svåra. Däremot kan möjligheten att enkelt utföra RNAi på en mängd olika stadier ofta vara en effektiv strategi för att undvika dessa pleiotropiska effekter. Till exempel kan utföra RNAi hos vuxna istället för larver eller puppor tillåta oss att kringgå unintenderade dödlighet orsakad av gen knockdown under tidig utveckling. Flexibiliteten i RNAi respons i T. castaneum gör därför den här modellen ett attraktivt val för att anpassa RNAi experiment av geners funktion i fysiologiska och beteendemässiga reaktioner.
The T. castaneum systemet är också idealisk för användning i en undervisningslaboratorium. T. castaneum lätt kan odlas på ett mjöl / jäst blandningen vid rumstemperatur (25 ° C) utan frekvent subodling och RNAi-tekniker i T. castaneum är enkla nog att kunna anpassas till ett laboratorium med unga, lärande forskare. Eftersom RNAi blir en viktig teknik i en mängd olika biologiska områden, är det viktigt att eleverna utsätts för denna teknik. Den rättfram karaktär larver RNAi-tekniken i T. castaneum uppmuntrar också fler studenter att delta i forskning, vilket gör T. castaneum en utmärkt kandidat för ett klassrum orienterat genetiskt system. </ P>
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Centrum för bioinformatik och funktionsgenomik (CBFG) vid Miami University för teknisk support. Detta arbete stöddes av Miami University startbidrag (YT) och National Science Foundation (YT: IOS 0.950.964).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Organic whole wheat flour | Heartland Mill Inc. Kansas | G1 | |
Brewer’s Yeast | MP Biomedicals | 2903312 | Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus. |
6 oz plastic Drosophila stock bottles | Fisher Scientific | 11-888 | |
Sieve | Fisher Scientific | 04-881N | 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710µm) for larvae, pupae, and adults. |
Sieve | Fisher Scientific | 04 881 10P | 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600µm) Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder. |
Sieve receiver | Fisher Scientific | 04-866B | 8 in. diameter |
1.5 quart spouted sample pan | Seedburo Equipment Co. | Model 33 | collection pan |
Incubator | BioCold Environmental Inc | BC26-IN | Keep it 30C with 70% humidity. |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374500 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | S397-500 | |
KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
Food dye | Kroger | green, blue, or red preferable | |
Microscope glass slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
Tack-It Over&Over | Aleene's | Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies. | |
Plastic CD case | Amazon | ||
Boroslilicate Glass capillary | Sutter Instrument | BF100-50-15 | O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament |
Needle puller | Sutter Instrument | P-87 or P-97 | |
Silicone seal | Narishige | HI01PK01 | 2.5 mm |
Removable mounting putty | Loctite Fun-Tak | ||
Compressed gas duster | OfficeMax | OM96091 | |
Forceps | Fine Science Tool | 11231-30 | Dumoxel #3 (to manipulate beetles) |
Forceps | Fine Science Tool | 11252-20 | INOX #5 (to break needle tips) |
Ethyl ether, anhydrous | Fisher Scientific | E138-500 | |
Nylon mesh | Flystuff/Genessee Scientific | 57-102 | 120-um pore size/49% open area |
Media bootle 100-ml | VWR | 89000-926 | |
Stereomicroscope | Zeiss | SteREO Discovery V12. Injection microscope. | |
Stereomicroscope | Fisher/Zeiss | 12-070-513 | Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide. |
X-Y mechanical stage | Zeiss | 4354600000000000 | |
X-Y mechanical stage | Microscopenet.com | A512 | Inexpensive alternative |
Manipulator | Narishige | M-152 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
Glass capillary holder | Narishige | IM-H1 | |
30-ml disposable syringe | BD syringe | 309650 | BD Luer-Lok Tip |
Four-way stopcock | Cole-Parmer Instrument Co. | EW-30600-03 | Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip |
art paint brush | Amazon | Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece | Any general paint brush will work. |