RNA-interferens (RNAi) -baserede gen knockdown teknikker er kernen i Tribolium forskning. Her giver vi et overblik over vores larvestadiet RNAi teknik Tribolium castaneum. Larve RNAi er en enkel, men kraftfuld teknik, der giver hurtig adgang til tab af funktion fænotyper, som giver forskerne at studere genfunktioner i forskellige sammenhænge.
Den røde mel bille, Tribolium castaneum tilbyder et repertoire af eksperimentelle værktøjer til genetiske og udviklingsmæssige undersøgelser, herunder en fuldt kommenteret genom sekvens, transposon-baserede transgenese og effektiv RNA-interferens (RNAi). Blandt disse fordele, RNAi-baserede gen knockdown teknikker er kernen i Tribolium forskning. T. castaneum viser en robust systemisk RNAi reaktion, hvilket gør det muligt at udføre RNAi enhver livsfase ved blot at injicere dobbeltstrenget RNA (dsRNA) i bille kropskavitet.
I denne rapport giver vi en oversigt over vores larvestadiet RNAi teknik i T. castaneum. Protokollen omfatter (i) isolering af den korrekte fase af T. castaneum larver til injektion, (ii) forberedelse for indstillingen injektion, og (iii) dsRNA injektion. Larve RNAi er en enkel, men kraftfuld teknik, der giver os hurtig adgang til tab af funktion phenotypes, herunder flere gen knockdown fænotyper samt en række hypomorphic fænotyper. Da næsten alle T. castaneum væv er modtagelige for ekstracellulært dsRNA larvestadiet RNAi teknik gør det muligt for forskerne at studere en lang række væv i forskellige sammenhænge, herunder genetiske grundlag for organismal svar på det udendørs miljø. Desuden enkelhed denne teknik stimulerer mere studerendes engagement i forskning, hvilket gør T. castaneum en ideel genetisk system til brug i et klasseværelse indstilling.
Den røde mel bille, Tribolium castaneum, er stigende popularitet i forskellige områder af biologi dels på grund af den lethed udføre RNA-interferens (RNAi) 1-3. RNAi-baserede gen knockdown teknikker gør det muligt for forskerne at udføre tab af funktion analyser uden anvendelse af komplekse genetiske metoder. T. castaneum viser en robust systemisk RNAi respons, hvilket gør det muligt at udføre RNAi på noget tidspunkt gennem simpel indsprøjtning af dobbeltstrenget RNA (dsRNA) ind billen kropskavitet 4-6. Samtidig knockdown af multiple gener er også muligt i T. castaneum ved at injicere to eller flere forskellige dsRNA-molekyler samtidigt 7,8. Derudover kan en række hypomorphic fænotyper genereres ved at reducere koncentrationen af injiceret dsRNA 8. Disse funktioner gør RNAi-baserede reverse genetiske teknikker attraktive alternativer til traditionelle fremadrettede genetik i T. castaneum. Da næstenalle T. castaneum væv er modtagelige for ekstracellulære dsRNA molekyler 9, denne teknik gør det muligt for forskere at undersøge en lang række væv i forskellige sammenhænge. Hertil kommer, at selv om denne betænkning fokuserer på at udføre RNAi i T. castaneum, mange her beskrevne procedurer finder anvendelse på andre insekter. Derfor er denne protokol er nyttig for dem, der ønsker at udføre tab af funktion analyser i deres kontekst af interesse i T. castaneum, samt for forskere, der ønsker at anvende en RNAi-baseret teknik til andre insekter.
Injektion dsRNA til larver, tillader funktionel analyse på en række bille livsstadier, herunder larve, puppe og voksne stadier 4,5,10. Vi har tidligere rapporteret vores overordnede larve RNAi forsøgsprotokol inklusive molekylærbiologiske procedurer 11. I den aktuelle rapport, fokuserer vi på at beskrive de injektionsprocedurer dsRNA, der er bedst forklares med visuelle hjælpere. Vi levererdetaljerede trin-for-trin injektion procedurer samt gode og dårlige injektion eksempler. Denne visuelle protokol supplerer vores tidligere protokol, og når de kombineres, giver de en mere omfattende visning af larvernes RNAi procedurer i T. castaneum. Derudover diskuterer vi parametre for dsRNA molekyler, der kan påvirke succes RNAi, anvendelsen af RNAi-baserede analyser for fysiologisk forskning, samt anvendeligheden af larvestadiet RNAi-protokollen i en undervisningssituation laboratorium.
Der er en række vigtige spørgsmål, der skal tages i betragtning for at sikre succes for RNAi, herunder længden og koncentrationen af de dsRNA molekyler, konkurrence mellem forskellige dsRNA-molekyler (når de forsøger flere banke ned), og muligheden for ikke-tilsigtede effekter (OTE).
dsRNA Længde
Længden af dsRNA molekyler påvirker effektiviteten af den systemiske RNAi reaktion med et længere dsRNA er mere effektive til at udløse RNAi 7,14,15 (selvom længere grænse for dsRNA er i øjeblikket ukendt). DsRNA længde skal være længere end 50 bp til at inducere effektiv RNAi i T. castaneum 7. dsRNA mellem 150 bp og 500 bp synes at være ideelt for RNAi eksperimenter. Selvom der også kan anvendes længere dsRNA molekyler, vil de have en øget chance for OTE og gen-kloning trin bliver stadig vanskeligere.
dsRNA Koncentration
ve_content "> Forskellige grader af gen knockdown kan opnås afhængigt af koncentrationen af dsRNA. 1 pg / pl synes at være en rimelig startkoncentration, som ofte frembringer en nær-nul fænotype (kan variere afhængigt af genet (generne) af interesse ). RNAi kan udføres med en højere koncentration (fx 7-8 pg / pl) for at opnå en stærkere RNAi fænotype. RNAi med en seriel fortynding af dsRNA kan undertiden være fordelagtigt at producere en række hypomorphic fænotyper (Supplemental Information Tomoyasu et al. 2009 8, og Borràs-Castells upublicerede data).RNAi Konkurrence
Multiple gen knockdown kan opnås i T. castaneum ved at injicere flere forskellige dsRNA molekyler samtidigt. Imidlertid er det også kendt at have flere forskellige dsRNA-molekyler til stede i organismen ofte resulterer i konkurrence mellem dsRNAs for adgang til RNAi komponenter <sop> 7,14. Det er vigtigt at bruge den samme længde, og den samme koncentration for alle dsRNA'et når de forsøger flere gen knockdown at undgå en dsRNA'et udkonkurrerer de andre (selv om, kan der kræves yderligere justeringer af dsRNA'et længde og koncentration, når ekspressionsniveauerne meget forskellig blandt målgenerne). Vi, såvel som andre, med succes har udført dobbelt og tredobbelt knockdown (f.eks Tomoyasu et al. 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, og Yang et al. 2009 18). Selv om det er muligt, firedobbelt RNAi (eller flere) kan være udfordrende, da det sandsynligvis vil medføre en betydelig reduktion af RNAi effektivitet for alle fire målgener.
Off-målretning
OTE er en iboende bekymring for RNAi-baserede tilgange. En måde at minimere OTE at identificere regioner i målgenet, der deler lignende sekvenser med andre gener og undgå disse regioner ved udformningen dsRNA. En simpel BLAST analyse mod T. castaneum forudsagt gen sæt kan identificere sådanne regioner. Flere online værktøjer giver også evaluering af potentielle OTE (fx e-RNAi 19). Udførelse RNAi til to ikke-overlappende regioner af målgenet er en nem og effektiv måde at fjerne muligheden for, at observerede fænotyper er forårsaget af OTE. Muligheden for OTE minimeres, hvis RNAi til to ikke-overlappende regioner producere de samme fænotyper (medmindre de to ikke-overlappende regioner deler en lignende sekvens).
Evaluering gen knockdown af andre end fænotypiske analyser midler er ofte kritisk for effektivt stede RNAi-relaterede data. To store måder at evaluere gen knockdown er QRT-PCR og Western blot-analyse. QRT-PCR er en bekvem måde at måle niveauet af mål-mRNA, og er blevet anvendt i mange RNAi-relaterede undersøgelser, herunder dem i T. castaneum (se Miller et al. 2.012 7 for eksempel). Howevis, skal der udvises forsigtighed, da vi for nylig har set nogle tilfælde, hvor mål-mRNA-niveau er opreguleret af RNAi (selvom det protein produkt er nedreguleret) (Borràs-Castells upublicerede data). Det er i øjeblikket uvist, om dette RNAi inducerede mRNA opregulering kan være udbredt eller unikke for bestemte gener. Western blot-analyse er en anden måde at bekræfte gen knockdown. Denne fremgangsmåde er helt pålidelig som den måler størrelsen af det endelige protein-produkt. Kravet om et specifikt antistof mod proteinet produkt af målgenet er en ulempe ved denne fremgangsmåde. Ved hjælp af flere uafhængige målinger foruden fænotypeanalyse vil øge tilliden hos de fænotypiske data opnået ved RNAi-baseret analyse.
Siden sin undfangelse i T. castaneum, RNAi er primært blevet brugt til at studere genfunktion i udvikling og mønster-dannelse. Disse T. castaneum udviklingsmæssige undersøgelser har været en stor succes i karakterizing evolutionært bevaret og afveg funktioner af gener (revideret i Denell 2008 1 og Klingler 2004 2). Men RNAi-baserede studier i T. castaneum er ikke begrænset til udviklingsmæssige biologi. For eksempel kan RNAi anvendes til at undersøge genfunktion i en lang række fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner, herunder stress tolerance, rovdyr, aggression, valg af mage, aktivitetsmønstre og forsvarsmekanismer.
Et vanskeligt at anvende RNAi til disse sammenhænge er sandsynligheden for, pleiotropiske effekter. Ofte vil gener af interesse har en række roller hele T. castaneum livscyklus, hvilket gør fjernelse af gener uden utilsigtede fænotypiske virkninger vanskelig. Imidlertid kan evnen til nemt at udføre RNAi på forskellige stadier ofte være en effektiv strategi til at undgå disse pleiotrope virkninger. For eksempel kan udføre RNAi hos voksne i stedet for larver eller pupper tillade os at omgå util-tendens dødelighed forårsaget af gen knockdown under tidlig udvikling. Fleksibiliteten af RNAi respons T. castaneum således gør denne model til et attraktivt valg for at tilpasse RNAi til eksperimenter af genfunktion i fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner.
T. castaneum system er også ideel til brug i en undervisningssituation laboratorium. T. castaneum kan let dyrkes på et mel / gær blandingen ved stuetemperatur (25 ° C) uden hyppige subkultur og RNAi teknikker i T. castaneum er enkle nok til at blive tilpasset til et laboratorium med unge, læring forskere. Da RNAi er ved at blive en vigtig teknik i en række biologiske områder, er det afgørende, at de studerende er udsat for denne teknik. Den ligetil karakter larvestadiet RNAi teknik i T. castaneum opfordrer også flere studerende til at blive involveret i forskning, hvilket gør T. castaneum en oplagt kandidat til et klasseværelse orienteret genetisk system. </ P>
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Center for Bioinformatik og Functional Genomics (CBFG) på Miami University for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af Miami University opstart tilskud (YT), og National Science Foundation (YT: IOS 0.950.964).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Organic whole wheat flour | Heartland Mill Inc. Kansas | G1 | |
Brewer’s Yeast | MP Biomedicals | 2903312 | Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus. |
6 oz plastic Drosophila stock bottles | Fisher Scientific | 11-888 | |
Sieve | Fisher Scientific | 04-881N | 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710µm) for larvae, pupae, and adults. |
Sieve | Fisher Scientific | 04 881 10P | 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600µm) Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder. |
Sieve receiver | Fisher Scientific | 04-866B | 8 in. diameter |
1.5 quart spouted sample pan | Seedburo Equipment Co. | Model 33 | collection pan |
Incubator | BioCold Environmental Inc | BC26-IN | Keep it 30C with 70% humidity. |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374500 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | S397-500 | |
KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
Food dye | Kroger | green, blue, or red preferable | |
Microscope glass slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
Tack-It Over&Over | Aleene's | Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies. | |
Plastic CD case | Amazon | ||
Boroslilicate Glass capillary | Sutter Instrument | BF100-50-15 | O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament |
Needle puller | Sutter Instrument | P-87 or P-97 | |
Silicone seal | Narishige | HI01PK01 | 2.5 mm |
Removable mounting putty | Loctite Fun-Tak | ||
Compressed gas duster | OfficeMax | OM96091 | |
Forceps | Fine Science Tool | 11231-30 | Dumoxel #3 (to manipulate beetles) |
Forceps | Fine Science Tool | 11252-20 | INOX #5 (to break needle tips) |
Ethyl ether, anhydrous | Fisher Scientific | E138-500 | |
Nylon mesh | Flystuff/Genessee Scientific | 57-102 | 120-um pore size/49% open area |
Media bootle 100-ml | VWR | 89000-926 | |
Stereomicroscope | Zeiss | SteREO Discovery V12. Injection microscope. | |
Stereomicroscope | Fisher/Zeiss | 12-070-513 | Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide. |
X-Y mechanical stage | Zeiss | 4354600000000000 | |
X-Y mechanical stage | Microscopenet.com | A512 | Inexpensive alternative |
Manipulator | Narishige | M-152 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
Glass capillary holder | Narishige | IM-H1 | |
30-ml disposable syringe | BD syringe | 309650 | BD Luer-Lok Tip |
Four-way stopcock | Cole-Parmer Instrument Co. | EW-30600-03 | Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip |
art paint brush | Amazon | Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece | Any general paint brush will work. |