RNA interferens (RNAi) -baserte genet knockdown teknikker er i kjernen av Tribolium forskning. Her gir vi en oversikt over vår larve RNAi teknikk i Tribolium castaneum. Larve RNAi er en enkel, men kraftig teknikk som gir rask tilgang til tap-av-funksjon fenotyper, slik at forskere å studere genfunksjoner i ulike sammenhenger.
Den røde mel bille, Tribolium castaneum, og tilbyr et repertoar av eksperimentelle verktøy for genetiske og utviklingsstudier, inkludert et fullt annotert genomsekvens, transposon baserte transgenesis, og effektiv RNA interferens (RNAi). Blant disse fordelene, RNAi-baserte genet knockdown teknikker er i kjernen av Tribolium forskning. T. castaneum viser en robust systemisk RNAi respons, noe som gjør det mulig å utføre RNAi på ethvert stadium i livet ved ganske enkelt å injisere dobbelt-strenget RNA (dsRNA) i billens kroppens hulrom.
I denne rapporten gir vi en oversikt over vår larve RNAi teknikk i T. castaneum. Protokollen omfatter (i) isolering av det riktige trinn i T. castaneum larvene for injeksjon, (ii) forberedelse for injeksjon innstilling, og (iii) dsRNA injeksjon. Larve RNAi er en enkel, men kraftig teknikk som gir oss rask tilgang til tap-av-funksjon phenotypes, inkludert flere genet knockdown fenotyper samt en rekke hypomorphic fenotyper. Siden nesten alle T. castaneum vev er utsatt for ekstracellulær dsRNA, tillater larve RNAi teknikken forskere for å studere et bredt utvalg av vev i forskjellige sammenhenger, inkludert den genetiske basis for organisme responser til det ytre miljø. I tillegg, enkelhet av denne teknikken stimulerer flere elev engasjement i forskning, noe som gjør T. castaneum en ideell genetisk system for bruk i et klasserom setting.
Den røde mel bille, Tribolium castaneum, blir stadig mer populært i ulike felt av biologi skyldes delvis den enkle å utføre RNA interferens (RNAi) 1-3. RNAi-baserte genet knockdown teknikker tillate forskere å utføre tap-av-funksjonen analyserer uten å benytte komplekse genetiske metoder. T. castaneum viser en robust systemisk RNAi respons, noe som gjør det mulig å utføre RNAi på ethvert trinn ved enkel injeksjon av dobbelt-trådet RNA (dsRNA) i billens kroppshulrommet 4-6. Samtidig knockdown av flere gener er også mulig i T. castaneum ved å injisere to eller flere forskjellige dsrna molekyler på samme tid 7,8. I tillegg kan en rekke hypomorphic fenotyper bli generert ved å redusere konsentrasjonen av injisert dsRNA 8. Disse funksjonene gjør RNAi-baserte omvendt genetiske teknikker attraktive alternativer til tradisjonelle termin genetikk i T. castaneum. Siden nestenalle T. castaneum vev er utsatt for ekstracellulære dsrna molekyler 9, denne teknikken gjør det mulig for forskere å undersøke et bredt utvalg av vev i forskjellige sammenhenger. I tillegg, selv om denne rapporten fokuserer på å utføre RNAi i T. castaneum, mange prosedyrer som er beskrevet her gjelder for andre insekter. Derfor er denne protokollen nyttig for de som ønsker å utføre tap-av-funksjon analyser i sine sammenhenger av interesse i T. castaneum, så vel som for forskere som ønsker å anbringe et RNAi-basert teknikk til andre insekter.
Injisering dsRNA til larver tillater funksjonell analyse på en rekke bille livsstadier, inkludert larve, pupal, og adulte stadier 4,5,10. Vi har tidligere rapportert vår generelle larve RNAi protokollen inkludert molekylærbiologi prosedyrer 11. I dagens rapport, har vi fokus på å beskrive dsrna injeksjonsprosedyrer, som er best forklares med visuelle medhjelpere. Vi tilbyrdetaljerte steg-for-trinn-injeksjon prosedyrer samt gode og dårlige injeksjon eksempler. Denne visuelle protokollen utfyller vår forrige protokoll, og kombinert, gir de en mer helhetlig syn på larve RNAi prosedyrer i T. castaneum. Videre diskuterer vi parametere for dsrna molekyler som kan påvirke suksess for RNAi, anvendelse av RNAi-baserte analyser for fysiologiske undersøkelser, så vel som anvendelsen av larve RNAi protokollen i et laboratorium undervisningen.
Det finnes en rekke viktige problemstillinger som må vurderes for å garantere suksess for RNAi, inkludert lengden og konsentrasjon av dsrna molekyler, konkurranse mellom ulike dsrna molekyler (når man prøver flere slå ned), og muligheten for Off-target Effects (OTE).
dsRNA Lengde
Lengden dsrna molekyler påvirker effektiviteten til systemisk RNAi respons, med en lengre dsRNA være mer effektiv til å utløse RNAi 7,14,15 (selv om lengre grense på dsRNA er for tiden ukjent). Den dsRNA lengde må være lenger enn 50 bp å indusere effektive RNAi i T. castaneum 7. dsRNA mellom 150 bp og 500 bp synes å være ideell for RNAi eksperimenter. Men lengre dsrna molekyler kan også brukes, vil de ha en økt sjanse for OTE og gene-kloning skritt vil bli stadig vanskeligere.
dsRNA Konsentrasjon
ve_content "> Forskjellige grader av genet knockdown kan oppnås, avhengig av konsentrasjonen av dsRNA. 1 ug / mL synes å være en rimelig utgangskonsentrasjon, noe som ofte gir en nær-null-fenotype (kan variere avhengig av gen (er) av interesse ). RNAi kan utføres med en høyere konsentrasjon (f.eks, 7-8 pg / mL) for å oppnå en sterkere RNAi fenotype. RNAi med en seriell fortynning av dsRNA kan noen ganger være fordelaktig å produsere en serie av hypomorphic fenotyper (Supplemental Data Tomoyasu et al. 2009 8, og Borras-Castells upubliserte data).RNAi Competition
Multiple genet knockdown kan oppnås i T. castaneum ved å injisere flere forskjellige dsrna molekyler samtidig. Imidlertid er det også kjent at det å ha flere forskjellige dsrna molekyler tilstede i organismen ofte resulterer i konkurranse mellom dsRNAs for tilgang til RNAi komponenter <sopp> 7,14. Det er viktig å bruke samme lengde og samme konsentrasjon for alle dsRNA når du forsøker flere genet knockdown for å unngå en dsRNA ut-konkurrerer de andre (selv om ytterligere tilpasninger av dsRNA lengde og konsentrasjon kan være nødvendig når uttrykket nivåer variere sterkt blant målet gener). Vi, så vel som andre, er med hell utført dobbelt og tredobbelt knockdown (f.eks Tomoyasu et al. 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, og Yang et al. 2.009 18). Selv om mulig, firedoble RNAi (eller mer) kan være utfordrende, ettersom det vil sannsynligvis føre til betydelig reduksjon av RNAi effektivitet for alle fire mål gener.
Off-målretting
OTE er en iboende interesse for RNAi-baserte tilnærminger. En måte å redusere OTE er å identifisere regioner i målgenet med likeartede sekvenser med andre gener og unngå disse regionene ved utformingen av dsRNA. En enkel BLAST analyse mot T. castaneum spådd genet sett kan identifisere slike regioner. Flere online-verktøy også tillate evaluering av potensielle OTE (f.eks E-RNAi 19). Utføre RNAi for to ikke-overlappende regioner av målgenet er en enkel og effektiv måte å eliminere muligheten for at observert fenotyper er forårsaket av OTE. Muligheten for OTE minimaliseres hvis RNAi i to ikke-overlappende regioner produsere de samme fenotyper (med mindre de to ikke-overlappende regioner har en tilsvarende sekvens).
Vurderer genet knockdown av andre enn fenotypiske analyser midler er ofte avgjørende for å effektivt presentere RNAi relaterte data. To store måter å evaluere genet knockdown er QRT-PCR og Western blot analyse. QRT-PCR er en praktisk måte for å måle nivået av mål-mRNA, og har vært brukt i mange RNAi-relaterte studier, inkludert de i T. castaneum (se Miller et al. 2.012 7 for eksempel). Howeveh, må man vise forsiktighet, slik vi nylig har sett noen tilfeller der målet mRNA nivå er oppregulert ved RNAi (selv om proteinproduktet er nedregulert) (Borras-Castells upubliserte data). Det er foreløpig ukjent om dette RNAi indusert mRNA oppregulering kan være utbredt eller unikt for visse gener. Western blot-analyse er en annen måte for å bekrefte genet knockdown. Denne metode er ganske pålitelig som den måler mengden av det endelige proteinprodukt. Kravet til et spesifikt antistoff mot proteinproduktet av målgenet er en ulempe for denne tilnærming. Utnytte flere uavhengige målinger i tillegg til fenotypeanalyser vil øke tilliten til de fenotypiske data innhentet av RNAi-baserte analyse.
Siden unnfangelsen i T. castaneum, RNAi har primært blitt brukt til å studere gen-funksjon i utvikling og mønster formasjon. Disse T. castaneum utviklingsstudier har vært svært vellykket i characterizing evolusjonært konservert og sin retning funksjoner av gener (anmeldt i Denell 2008 1 og Klingler 2004 2). Men RNAi-baserte studier i T. castaneum er ikke begrenset til utviklingsbiologi. For eksempel kan RNAi bli anvendt for å studere genfunksjon i et vidt spekter av fysiologiske og adferdsmessige responser, inkludert stresstoleranse, predatorer, aggresjon, mate valg, aktivitetsmønstre, og forsvarsmekanismer.
En vanskelighet for å bruke RNAi til disse sammenhenger er sannsynligheten for mitogen effekt. Ofte vil gener som er av interesse har en rekke roller i hele T. castaneum livssyklus, og dermed gjøre fjerning av gener uten utilsiktede fenotypiske effekter vanskelige. Imidlertid kan muligheten til å enkelt utføre RNAi på en rekke scener ofte være en effektiv strategi for å unngå disse mitogen effekt. For eksempel kan utføre RNAi hos voksne i stedet for larver eller pupper tillate oss å omgå unintendens dødelighet forårsaket av genet knockdown under tidlig utvikling. Fleksibiliteten av RNAi respons hos T. castaneum dermed gjør denne modellen et attraktivt valg for å tilpasse RNAi til eksperimenter av gen-funksjon i fysiologiske og atferdsmessige responser.
T. castaneum systemet er også ideell for bruk i en pedagogisk laboratorium. T. castaneum kan være enkelt dyrket på en mel / gjær blandingen ved romtemperatur (25 ° C) uten hyppig subculturing, og RNAi teknikker i T. castaneum er enkle nok til å tilpasses til et laboratorium med unge, lærings forskere. Som RNAi blir en viktig teknikk i en rekke biologiske felt, er det avgjørende at studentene blir utsatt for denne teknikken. Den rett-frem natur larve RNAi teknikk i T. castaneum også oppfordrer flere studenter til å være involvert i forskning, noe som gjør T. castaneum en førsteklasses kandidat for et klasserom orientert genetisk system. </ P>
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Senter for Bioinformatikk og Funksjonell genomforskning (CBFG) ved Miami University for teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av Miami University etablererstipend (YT), og National Science Foundation (YT: IOS 0.950.964).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Organic whole wheat flour | Heartland Mill Inc. Kansas | G1 | |
Brewer’s Yeast | MP Biomedicals | 2903312 | Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus. |
6 oz plastic Drosophila stock bottles | Fisher Scientific | 11-888 | |
Sieve | Fisher Scientific | 04-881N | 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710µm) for larvae, pupae, and adults. |
Sieve | Fisher Scientific | 04 881 10P | 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600µm) Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder. |
Sieve receiver | Fisher Scientific | 04-866B | 8 in. diameter |
1.5 quart spouted sample pan | Seedburo Equipment Co. | Model 33 | collection pan |
Incubator | BioCold Environmental Inc | BC26-IN | Keep it 30C with 70% humidity. |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374500 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | S397-500 | |
KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
Food dye | Kroger | green, blue, or red preferable | |
Microscope glass slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
Tack-It Over&Over | Aleene's | Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies. | |
Plastic CD case | Amazon | ||
Boroslilicate Glass capillary | Sutter Instrument | BF100-50-15 | O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. without filament |
Needle puller | Sutter Instrument | P-87 or P-97 | |
Silicone seal | Narishige | HI01PK01 | 2.5 mm |
Removable mounting putty | Loctite Fun-Tak | ||
Compressed gas duster | OfficeMax | OM96091 | |
Forceps | Fine Science Tool | 11231-30 | Dumoxel #3 (to manipulate beetles) |
Forceps | Fine Science Tool | 11252-20 | INOX #5 (to break needle tips) |
Ethyl ether, anhydrous | Fisher Scientific | E138-500 | |
Nylon mesh | Flystuff/Genessee Scientific | 57-102 | 120-um pore size/49% open area |
Media bootle 100-ml | VWR | 89000-926 | |
Stereomicroscope | Zeiss | SteREO Discovery V12. Injection microscope. | |
Stereomicroscope | Fisher/Zeiss | 12-070-513 | Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide. |
X-Y mechanical stage | Zeiss | 4354600000000000 | |
X-Y mechanical stage | Microscopenet.com | A512 | Inexpensive alternative |
Manipulator | Narishige | M-152 | |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
Glass capillary holder | Narishige | IM-H1 | |
30-ml disposable syringe | BD syringe | 309650 | BD Luer-Lok Tip |
Four-way stopcock | Cole-Parmer Instrument Co. | EW-30600-03 | Stopcocks with Luer Connections; 4-way; male slip |
art paint brush | Amazon | Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece | Any general paint brush will work. |