Summary
وقد تم تطوير طريقة لقياس حجم فموي وجهي وشكل الضفدع الأجنة المورق. في هذا البروتوكول، ويتم الجمع بين قياسات حجم التقليدية مع morphometrics الهندسية للسماح لتحليلات أكثر تطورا التنمية الوجهية والعيوب.
Abstract
أصبح القيطم أداة هامة لتشريح الآليات التي تحكم تطوير القحفي والعيوب. وهناك طريقة لقياس تطور الوجهية تسمح لتحليل أكثر دقة من الظواهر الوجهية على إلغاء مع المواد التي يمكن وراثيا أو جزيئيا التلاعب التعبير الجيني أو وظيفة البروتين. باستخدام اثنين من صور ثلاثية الأبعاد من رؤساء الجنينية، يتم قياس حجم الأبعاد التقليدية مثل فموي وجهي العرض والطول ويتميز بتصميم داخلي متطور. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام مقياس استدارة من فتحة الفم الجنينية لوصف شكل الفم. يتم تنفيذ morphometrics هندسية من هذه الصور ثنائية الأبعاد أيضا لتقديم وجهة نظر أكثر تعقيدا من التغيرات في شكل المنطقة الوجهية. يتم تعيين المعالم إلى نقاط محددة في المنطقة الوجهية ويتم إنشاؤها الإحداثيات. ويستخدم تحليل المكون الرئيسي للحد من إحداثيات تاريخية لمكونات المبدأ الذي يميز ثم العلاجالمجموعات. يتم عرض هذه النتائج على أنها مؤامرة مبعثر فيه الأفراد مع الأشكال الوجهية مماثلة العنقودية معا. ومن المفيد أيضا إجراء تحليل التمايز وظيفة، مقارنة إحصائية مواقف المعالم بين مجموعات العلاج اثنين. يتم عرض هذا التحليل على شبكة التحول حيث ينظر التغيرات في المركز التاريخي كما ناقلات. تم فرضه شبكة على هذه النواقل بحيث يتم عرض نمط تزييفها لإظهار حيث تغيرت مواقف تاريخية كبيرة. وتستند التغييرات في شكل تحليل التمايز وظيفة على مقياس إحصائي، وبالتالي يمكن تقييمها من قبل ذات القيمة ص. هذا التحليل هو بسيط ويمكن الوصول إليها، والتي تتطلب فقط المجسام والبرامج مجانية، وبالتالي سيكون البحث والتدريس المورد الثمين.
Introduction
من بين الأنواع الأكثر انتشارا وتدميرا من العيوب الخلقية الإنسان هي تلك التي تؤثر على الفم والوجه، مثل الشقوق الوجهية 1. الأطفال الذين يعانون من الهياكل الوجهية تالف الخضوع لعمليات جراحية متعددة طوال حياتهم والنضال مع تشوهات الوجه، والكلام والسمع ومشاكل تناول الطعام. وبالتالي، تسهيل البحوث العلمية الجديدة في تطوير والقحف الوجهية أمر بالغ الأهمية للوقاية والعلاج من هذه الأنواع من العيوب الخلقية في الإنسان. وقد برز القيطم المورق كأداة جديدة لتشريح الآليات التي تحكم تطوير القحفي (تشمل بعض الأمثلة 2،3،4 -11). وبالتالي، يمكن لطريقة الكمي لتحليل حجم وشكل التغييرات خلال تنمية الرأس والوجه من هذا النوع أن تكون قوية جدا 3.
هنا، نقدم مثل هذا الأسلوب. الجمع بين القياسات التقليدية الحجم مع morphometrics الهندسية مقتبسة من دراسة القيطم 12 13-15. الهدف من هذا البروتوكول هو السماح للباحثين لقياس حجم الوجه وأشكال التمييز بين الظواهر الوجهية المختلفة أثناء التطور العادية وغير العادية. وهذا التحليل يسمح للتمايز بين أفضل العيوب القحفي خفية مثل تلك الناشئة عن الآثار المستمرة للجينات و / أو العوامل البيئية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا الأسلوب الكمي أيضا تكشف حتى تحسن طفيف أو إنقاذ عيب فموي وجهي. وبالتالي هذا يجعله دليلا مفيدا في تحليل العلاجات المحتملة.
مزيج من قياسات الوجه وmorphometrics الهندسية التي نقدمها هنا يسمح للتحليل الإحصائي أشمل من كل من حجم وشكل المنطقة الوجهية من البروتوكولات الحالية التي تستخدم إلى حد كبير واحد فقط أو 15-18 الآخرين. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم طريقة بسيطة لتقييم كل من الإنسي والجانبية للطائراتوجه دون الحاجة إلى معدات التصوير المتطورة ثلاثية الأبعاد المستخدمة في الدراسات الحالية 13،19.
نحن لشرح هذا البروتوكول على القيطم المورق الأجنة تعامل مع مثبط مستقبلات حمض الريتينويك أن يدفع تنمية الوجهية غير طبيعية والحنك المشقوق متوسط 2،3. وقد كشفت الكمي لأبعاد وشكل المنطقة الوجهية في هذه الأجنة التغيرات في midface التي هي مماثلة للبشر مع الشقوق الحنكية مماثلة ونماذج الماوس 20،21. ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتقييم آثار المركبات الأخرى على التنمية الوجهية مثل المواد الطبيعية، ومبيدات الأعشاب، أو بروتينات مثل عوامل النمو. وعلاوة على ذلك، حجم وشكل التغييرات الوجهية الناجمة عن اضطراب في التعبير الجيني عن طريق الخسارة أو الربح من التجارب وظيفة (باستخدام morpholinos العقاقير أو Crispers / Talens) كما يمكن كميا باستخدام هذا البروتوكول. أخيرا، قمنا بتطوير هذه الطريقة specificaLLY لتقييم القيطم التشكل. ومع ذلك، يتم تعديله بسهولة لتحليل أي الفقاريات. ويمكن أن تشمل أيضا تطبيقات أخرى باستخدام هذا البروتوكول لمقارنة وثيقي الصلة للدراسات تطورية أو بيئية. في حين أن المثال نحن نقدم هنا يستخدم هذا البروتوكول لوصف تحليل المنطقة الوجهية، يمكن بسهولة تعديله لتحليل مناطق أخرى، أجهزة، أو الهياكل.
وهذا البروتوكول الكمي فموي وجهي أصبح مصدرا قيما للمجتمع البحوث، وكذلك أداة تعليمية ممتازة للطلاب الجامعيين كدليل الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع التجارب التي أجريت باستخدام القيطم المورق من قبل IACUC (بروتوكول # AD20261).
1. إعداد الكواشف والمواد المطلوبة
- الكواشف:
- جعل 1 لتر من 10X MBS (المالحة تعديل بارت) حل 22. إضافة كلوريد الصوديوم (880 ملم)، وبوكل (10 ملم)، MgSO 4 (10 ملم)، HEPES (50 ملي، ودرجة الحموضة 7.8)، وNaHCO 3 (25 ملم) إلى 1 لتر من الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 مع هيدروكسيد الصوديوم.
- جعل 1 لتر من 1X MBS عن طريق تمييع 100 مل من 10X MBS حل في 900 مل من الماء المقطر. إضافة 0.7 مل من 1 M CaCl 2 الحل.
- جعل 1 لتر من 0.1X MBS عن طريق تمييع 100 مل من محلول 1X MBS في 900 مل من الماء المقطر. ل1 لتر من 0.1X MBS حل، إضافة 1 مل من 10 ملغ / مل حل الجنتاميسين للاستخدام في الثقافة الجنين.
- جعل MBS عالية الملح عن طريق إذابة 4 مل من 5 M كلوريد الصوديوم في 100 مل من 10X MBS. ثم إضافة الماء المقطر حتى الحجم الكلي هو 1 L.
- جعل 70٪ من الإيثانول عن طريق تمييع 100٪ هthanol إلى 70٪ من الإيثانول باستخدام الماء المقطر.
- جعل BMS-543 عن طريق إعداد محلول المخزون 10 ملي في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO).
- جعل بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) وذلك بإضافة 4 جم من مسحوق امتصاص العرق إلى 50 مل من الماء المقطر. الحرارة على طبق ساخن لحوالي 65 درجة مئوية، وعند هذه النقطة إضافة 5 M هيدروكسيد الصوديوم قطرة من الحكمة حتى يزيل الحل.
- مرة واحدة يزيل الحل، وإزالة من الحرارة وإضافة 50 مل 2X PBS و 100 ميكرولتر توين-20. السماح لتبرد لRT على الجليد. ضبط درجة الحموضة ما بين 7.2 و 7.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك.
- جعل الفوسفات مخزنة محلول ملحي مع توين (PBT) عن طريق إذابة 8 جم كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام بوكل، 1.44 غرام من نا 2 هبو 4 و 0.24 غرام من KH 2 PO 4 في 800 مل من الماء المقطر. باستخدام حمض الهيدروكلوريك، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4. إضافة 2 مل من توين-20. ضبط الحجم النهائي مع الماء المقطر ليساوي 1 L.
- جعل حل السيستين عن طريق إذابة 1 غرام من السيستين في 50 مل من الماء المقطر أو 0.1X MBS. إضافة 1.5 مل من هيدروكسيد الصوديوم 5 M لالثانية ضبط درجة الحموضة إلى 7.8.
- جعل 10٪ بنزوكاين حل سهم من خلال إضافة 10 غرام من مسحوق بنزوكاين إلى 100 مل 100٪ ETOH. القتل الرحيم لمن الذكور البالغين والأجنة جاهزة للتثبيت، وتمييع للحل 0.05٪.
- تقديم حلول التخزين الخصيتين وذلك بإضافة 1 مل من مصل العجل إلى 9 مل من العازلة L15.
- أدوات والمعدات المطلوبة:
- الحصول على المعدات المدرجة في جدول المواد والمعدات، كما هو موضح في الشكل رقم 1.
- تعديل اداة ماصة. وضع غيض من الزجاج ماصة باستور في اللهب من موقد بنسن. تدوير غيض ماصة حتى يذوب ويشكل نهاية مختومة مدورة.
- تتسطح النمذجة الطين في قاع طبق بتري البلاستيك، وتذليل لتغطية لوحة كاملة (أي حجم يمكن استخدامها) (الشكل 1Aiv).
- اضغط برفق إبرة مستقيمة إغاظة في طبق مبطنة الطين في زاوية 45 درجة. عقد إبرة هناك، وببطء تحريك بيتريطبق أفقيا لإنشاء خط الاكتئاب (الشكل 1Bi). تكرار للعدد المطلوب من الصفوف.
- استخدام نهاية أداة الزجاج ماصة لجعل الضحلة، منخفضات دائرية في كل صف من طبق مبطنة الطين لوضع رؤساء الجنين (الشكل 1Bii) والمساعدة في تنظيم الأجنة في حين التصوير.
- للتصوير الفوتوغرافي، وملء الطبق مع PBT (الشكل 1Biii). بين الاستخدامات، ويغسل جيدا في طبق وسطح الطين مع الماء المعقم، تليها 70٪ من الإيثانول.
2. القيطم المورق الأجنة الثقافة والمانع العلاجات
- التخصيب في المختبر وثقافة البيض القيطم:
- الحصول على وثقافة القيطم المورق أجنة باستخدام معيار نشرت وسائل 22،23.
- باختصار، الموت ببطء ذكر بالغ من قبل الانغمار في حل بنزوكاين 0.05٪. تشريح الخصيتين وتخزينها في المخزن التخزين الخصيتين. حقنالإناث البالغات مع موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (HCG)، وجمع البيض في MBS عالية الملح، وإخصاب في المختبر مع الخصيتين تشريح (الشكل 2A، B).
- الأجنة الثقافة في 0.1X MBS عند 15 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى المرحلة المطلوبة (مرحلة الأجنة وفقا للجدول عادي من القيطم المورق من قبل Nieuwkoop وفابر 24،25).
- هنا، ثقافة الأجنة حتى المرحلة 22 (24 ساعة بعد الإخصاب (HPF))، وإزالة الغشاء المحي تحت stereomicroscope باستخدام اثنين من أزواج من ملقط شحذ. نقل الأجنة مع المعيار، يمكن التخلص منها نقل ماصة لطبق بيتري نظيفة (100 ملم في القطر) التي تحتوي على 30-40 مل من 0.1X MBS.
- العلاج المانع للأجنة القيطم (موضح في الشكل 2):
- ملء الآبار اللازمة من صحن الثقافة 24-جيدا مع 1 مل من 0.1X MBS باستخدام ماصة رجل واحد معايرة. ترسيم خارج جيدا مع علامة نقطة غرامةإيه (الشكل 2D، أقحم). استخدام علامة تسمية أيضا محتويات تضاف إلى كل بئر على 24 طبق جيدا الثقافة الغطاء. نسخ هذه المعلومات على صفحة انشاء 24 بئر في دفتر المختبر.
- نقل الأجنة 5-10 في كل بئر باستخدام المعيار، يمكن التخلص منها نقل ماصة (الشكل 2C). وضع نفس العدد من الأجنة في كل بئر.
- أعلى الصفحة أعلى أو إزالة MBS 0.1X بحيث يكون مستوى مع 1 مل خط ملحوظ (الشكل 2D). إضافة حجم مناسب من DMSO (بحيث الحجم النهائي من DMSO هو 1٪) ودوامة بلطف. يجب الحرص على عدم إضافة DMSO قريبة جدا من الأجنة، وتجنب الاتصال من الأجنة مع سطح المخزن المؤقت.
- إضافة كمية مناسبة من المواد الكيميائية إلى الآبار المعينة ودوامة بلطف مرة أخرى. هنا، إضافة 1 ميكرولتر من 10 ملي BMS-453 (حمض الريتينويك مستقبلات) و 9 ميكرولتر من DMSO إلى 1 مل من 0.1X MBS.
- إذا كانت المادة الكيميائية الخفيفة حساسة، والتفاف فضفاضة طريق مسدودطبق البنية في رقائق الألومنيوم. ثقافة الأجنة في الحاضنة 15 درجة مئوية حتى المرحلة المرغوبة. في هذا المثال، لعلاج الأجنة 16-18 ساعة.
- غسل الأجنة من العلاج وحتى مراحل تربية الشرغوف:
- إزالة نصف إلى ثلاثة أرباع حل مع ماصة نقل القابل للتصرف. يجب الحرص على عدم تعكير صفو الأجنة. باستخدام ماصة نقل جديدة، وإعادة ملء البئر مع 0.1X MBS. كرر هذه 3-6 مرات.
- نقل الأجنة إلى طبق بتري كبير (150 ملم في القطر) تحتوي على 100 مل من 0.1X MBS مع الجنتاميسين (1 مل / لتر). احتضان الأجنة عند 15 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة 42-45 (82-100 HPF).
- تغيير MBS 0.1X محلول يحتوي على جنتاميسين يوميا، وإزالة الأجنة الميتة على الفور لمنع التلوث أو وفاة الأجنة الأخرى. تسجيل عدد من الأجنة الميتة في دفتر المختبر.
- تحديد الأجنة في بارافورمالدهيد (PFA):
- إصلاح الأجنة بين المراحل 42 و 45 (82 و 100HPF، على التوالي) من خلال نقلهم في طبق ثقافة 24 بئر جديدة تحتوي على 1-2 مل من MBS 0.1X. تسمية غطاء مع نفس المعلومات كما وصف العلاج انشاء اعلاه (القسم 2.2.1).
- إزالة أكبر قدر ممكن من MBS 0.1X من كل جانب ممكن، في حين لا تزال تترك الأجنة مغطاة وضمان الحد الأدنى من الاتصال لمنع الإصابة. إضافة 1-2 مل من 0.05٪ بنزوكاين في حل 0.1X MBS واحتضان حتى الأجنة لم تعد تستجيب للمؤثرات.
- إضافة 1-2 مل من 4٪ PFA. بدلا من ذلك، وضع الأجنة في أنابيب microcentrifuge المسمى لتثبيت، إذا كان يفضل.
- احتضان الأجنة في منهاج العمل لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية على شاكر الدورية. إزالة PFA عن طريق أداء 3-4 يغسل مع PBT على مدى فترة 3-5 ساعة.
3. تصوير المنطقة الوجهية من الشراغف القيطم
- إعداد قبل التصوير (هذا هو موضح في الشكل 3):
- وضع الأجنة ثابتة في طبق بتري كبير (150مم في القطر) التي تحتوي على ما يقرب من 100 مل من PBT.
- جعل اثنين من الشقوق بقطع الرأس عن الجسم (الشكل 3A، خطوط سوداء صلبة). أولا، مع الاستمرار على الجنين مع زوج من ملقط وجعل شق على الجانب الخلفي من القناة الهضمية مع مشرط معقم (الشكل 3B). جعل الشق الثاني على الجانب الأمامي من القناة الهضمية، بالقرب من القلب، لإزالة الرأس (الشكل 3C).
- قطع ماصة رؤساء الجنين في طبق مبطنة الطين (الجزء 1.2.2) باستخدام المعيار، يمكن التخلص منها نقل ماصة.
- لمشاهدة الأمامية، استخدام اثنين من أزواج من الملقط لوضع رؤساء الجنين الجانب الخلفي أسفل داخل منخفضات دائرية. باستخدام ملقط للتلاعب كل من رأس الجنين والطين المحيطة بها، والأجنة الموقف بحيث أنهم يواجهون الكاميرا، ولا يميل إلى الخلف أو إلى أي من الجانبين (الشكل 3D). دفع بلطف الطين المحيطة حول الرأس باستخدام ملقط و / أو الزجاجأداة ماصة لتأمين الرأس في المكان.
- لمشاهدة الجانبية، واستخدام الملقط لوضع رؤساء الجنين داخل المنخفضات الدائرية بحيث تكون على جانبها، تواجه نفس الاتجاه، وتكون مسطحة على الملاعب الرملية. التلاعب الرأس الجنين والطين المحيطة بحيث يتم وضع الغدد الاسمنت من جميع الأجنة الهبوط في نفس الزاوية (الشكل 3E). استخدام الصفوف تعادل مع الإبرة إغاظة كدليل لضمان الدقة عند أخذ القياسات الجانبية.
- التقاط الصور من الرأس الشرغوف:
- تصوير رئيس الشرغوف باستخدام أي تشريح المجهر مع الكاميرا الرقمية المرفقة وبرنامج الكاميرا المقابلة. استخدام أعلى التكبير التي يمكن أن تبقى ثابتة لجميع الأجنة.
- تركز الأجنة ومواجهتها جميعا في نفس الاتجاه. التقاط الصور باستخدام أفضل ظروف الإضاءة التي تسمح للصورة أدق من المنطقة الوجهية. موقفأضواء لتجنب الظلال الزائدة. حفظ الصور كما .tiff الملفات مع أعلى دقة ممكنة.
4. قياس وتحليل الوجه الأبعاد الحجم في الشراغف القيطم
- قياس أبعاد الوجهية (ملخصة في الشكل 4):
- تحديد عرض الوجه. تحديد النقاط التي الجزء البطني من كل عين يجتمع أطرافها من الوجه (الشكل 4A، السهام)، وقياس المسافة بين هذه النقاط (الشكل 4A، خط أحمر).
- تحديد ارتفاع الوجه. أولا، تحدد خط الوسط عن طريق قياس المسافة بين كل عين واحتساب علامة منتصف الطريق. المقبل، ورسم الخطوط الأفقية التي تميز معظم الظهرية حواف العينين وظهري معظم نقطة للغدة الاسمنت (الشكل 4B، وخطوط بيضاء). في خط الوسط، وقياس المسافة بين الخطوط الأفقية (الشكل 4B، خط أحمر).
- تحديد رانه منطقة الوجهية. استخدام نفس خطوط أفقية بمناسبة حواف الظهرية من العين والغدة الاسمنت لتوجيه قياس المساحة (الشكل 4C، وخطوط بيضاء). تبدأ عند النقطة التي الخط الأفقي بمناسبة رأس الغدة الأسمنت يلبي هامش الجانب الأيسر من الوجه (الشكل 4Ca).
- تتبع على طول حافة مواجهة شاملة العين حتى نقطة حيث الخط الأفقي بمناسبة رأس العين يلتقي محيط الوجه (الشكل 4Cb). مواصلة تعقب على طول هذا الخط الأفقي ظهري معظم حتى النقطة التي يلتقي هامش الجانب الأيمن من الوجه (الشكل 4CC).
- تتبع نزولا على طول حافة مواجهة شاملة العين حتى نقطة حيث بطني خط أفقي الأكثر بمناسبة رأس الغدة الأسمنت يلبي هامش الجانب الأيمن من الوجه (الشكل 4CD). مواصلة تعقب على طول هذا الخط السفلي الاتحاد الوطني للعمال الأفقيايل تجتمع النقطة التي بدأ البحث عن المفقودين. استخدام برامج تحرير الصور لحساب مساحة داخل تتبع.
- تحديد طول الخطم. على الصور الجانبية، وجعل الخط العمودي الذي يمثل الجزء الأمامي من العين. المقبل، وقياس المسافة الأفقية من معظم نقطة الأمامية حيث يلتقي وجها حافة الظهري للغدة الاسمنت إلى الخط العمودي بمناسبة الأمامي من العين (الشكل 4D).
- تحديد عرض الفم. قياس المسافة الأفقية بين النقاط الأيمن والأيسر حيث العلوية والسفلية "الشفاه" لفتح الفم لقاء (الشكل 4E). ويمكن اعتبار هذه يعادل ضفدع من الملتقيات الشفوية.
- تحديد استدارة الفم. حساب الفم الاستدارة باعتبارها نسبة الارتفاع عكسية حيث (4 × [مساحة]) / (π × [المحور الرئيسي] (2) >).
- استخدام أداة لاسو في صورة محرر لتتبع حواف فتحة الفم كما هو مبين في الشكل 4F. حدد تحليل في شريط الأدوات الرئيسي، واختيار قياس. بدلا من ذلك، وحساب استدارة من قياس المنطقة وقطر فتحة الفم.
- تحليل البيانات من أبعاد الوجه:
- إدخال قياسات أبعاد الوجه في برنامج تحليل البيانات للمقارنة بين مجموعة العلاج مع السيطرة. تحديد متوسط كل قياس لكلا المجموعتين التجريبية والضابطة لخلق الرسوم البيانية. تحديد الانحراف المعياري من أجل إنشاء أشرطة الخطأ. أداء تي اختبارات الطالب لمقارنة إحصائية المجموعات.
ملاحظة: هذه البيانات يمكن أن يكون متغير تماما نظرا لمعدلات مختلفة قليلا التنمية بين الأجنة.
- إدخال قياسات أبعاد الوجه في برنامج تحليل البيانات للمقارنة بين مجموعة العلاج مع السيطرة. تحديد متوسط كل قياس لكلا المجموعتين التجريبية والضابطة لخلق الرسوم البيانية. تحديد الانحراف المعياري من أجل إنشاء أشرطة الخطأ. أداء تي اختبارات الطالب لمقارنة إحصائية المجموعات.
5. التحليل الكمي من الوجهية الشكل وMorphometrics
- معالم المكان وبجمعية العقاراتالشركة المصرية للاتصالات معلما تنسيق ملف (موضح في الشكل 5A).
- اختيار معالم تلك التي كانت التقاط شكل صورة الهدف، ويمكن وضعها مرارا وتكرارا في نفس الموقع النسبي في جميع العينات التي تم تحليلها. حالة عدم وجود هيكل في جميع العينات، لا تضع علامة بارزة على هذا الهيكل.
- هنا، ضع 24 المعالم لتمثيل midface مع علامات مميزة مثل العيون والأنف والفم. من أجل التناسق، معالم المكان في منتصف الطريق بين المعالم وضعت سابقا (على سبيل المثال، معالم الفم، الشكل 5Ai).
- التقاط الإحداثيات معلما وخلق "معلما تنسيق الملف". فتح الصورة الأولى لمواجهة الشرغوف (على سبيل المثال، أول السيطرة الجنين).
- حدد علامة التبويب الإضافات على شريط الأدوات الرئيسي واختيار Pointpicker من القائمة المنسدلة. حدد معالم التبويب إضافة نقاط وضعها في الأماكن المطلوبة كما المعالم ستظهر كما الصلبان متعددة الألوان (
- الانتقال مواقع تاريخية بعد التنسيب من خلال اختيار الأداة الصلبان نقل. عندما وضعت كل المعالم في الصورة، حدد علامة التبويب عرض النتائج على شريط الأدوات الرئيسي واختر إظهار (الشكل 5Aii) لعرض الإحداثيات معلما ونسخها في برنامج جداول البيانات (الشكل 5Aiii).
- عند لصق هذه الإحداثيات من هذا الجنين الأول في برنامج جداول البيانات، وترك صف فارغ فوق البيانات. في العمود B من هذا الصف الفارغ (الصف 1)، نوع "LM =" مع عدد من المعالم في العينة. هنا، أدخل "LM = 24" منذ تم إنشاؤها 24 معالم (الشكل 5Aiii، مربع أحمر).
- في الصف أقل من نقاط البيانات، اكتب "ID =" مع تحديد اسم العينة. هنا في الشكل 5Aiii، أدخل "ID = CON1" لأن هذا هو المعلم تنسيق البيانات للسيطرة أول جنين (الشكل 5Aiii، السهم الأحمر).
- نسخ الأعمدة الثانية والثالثة كلها في نص الوثيقة وحفظها كملف .txt.
- حدد علامة التبويب الإضافات على شريط الأدوات الرئيسي واختيار Pointpicker من القائمة المنسدلة. حدد معالم التبويب إضافة نقاط وضعها في الأماكن المطلوبة كما المعالم ستظهر كما الصلبان متعددة الألوان (
- اختيار معالم تلك التي كانت التقاط شكل صورة الهدف، ويمكن وضعها مرارا وتكرارا في نفس الموقع النسبي في جميع العينات التي تم تحليلها. حالة عدم وجود هيكل في جميع العينات، لا تضع علامة بارزة على هذا الهيكل.
- إعداد برنامج حاسوبي لتحليل البيانات المظهرية (موضح في الشكل 5B).
- هنا، حدد إنشاء مجموعة بيانات جديدة في القائمة الرئيسية في البرنامج المظهرية. اسم الملف والبيانات المنصوص عليها في المربعات المناسبة (على سبيل المثال، "حمض الريتينويك المنع" و "معالم الوجه"، على التوالي) في المنبثقة الشاشة (الشكل 5Bi). استيراد الملف كملف TPS، وSELإلخ ملف نص الإحداثيات لإنشاء مجموعة البيانات (الشكل 5Bi، السهم الأحمر).
- محاذاة البيانات وبروكرست صالح:
- أداء نوبة بروكرست والمحاذاة. تسليط الضوء على البيانات المنصوص عليها في التبويب شجرة مشروع، واختيار التمهيدات على شريط الأدوات الرئيسي، ونيو بروكرست صالح في القائمة المنسدلة.
- اختر محاذاة من قبل المحور الرئيسي وحدد تنفيذ بروكرست صالح في الجزء السفلي من مربع (الشكل 5Bii، السهم الأحمر). العودة إلى التمهيدات القائمة المنسدلة، حدد توليد مصفوفة التغاير (الشكل 5Biii)، واختر تنفيذ.
- عرض الارتباطات مصفوفة التغاير في علامة التبويب نتائج.
- إنشاء "ملف المصنف" عن طريق تعيين كل عينة في مجموعة البيانات لمتغير المصنف المناسب للتمييز سواء كان ينتمي في المجموعة التجريبية أو المجموعة الضابطة.
- تسمية عمودين في جدول بيانات. تسمية رأس كولوم الأولن مع "ID" والمدخلات في نفس معرف تعطى لكل عينة (على سبيل المثال، CON1، RARINHIB1، وهلم جرا. 5Biv الشكل). تسمية رأس العمود الثاني مع "المعاملة" ومساهمة في كل خلية مجموعة العلاج الذي يتوافق مع عينة المدرجة في الخلية معرف المجاورة.
- هنا، استخدام تسميات "السيطرة وRAR مثبط" على المصنفات (الشكل 5Biv). نسخ في ملف نصي وحفظه كملف .txt. المتغيرات استيراد مصنف في برنامج حاسوبي المظهرية. اختيار المباراة من قبل معرف، وفتح ملف نصي (الشكل 5Bv).
- إنشاء تحليل المكون الرئيسي (PCA) مؤامرة مبعثر عن طريق اختيار القائمة المنسدلة التغيير واختيار مدير تحليل المكون (الشكل 6Ai). بعد ذلك، حدد علامة التبويب الرسومات لرؤية ثلاث علامات تبويب إضافية: تغيير شكل الكمبيوتر، والقيم الذاتية، وعشرات PC (الشكل 6Aii). تعرض علامة التبويب عشرات PC وبivariate الرئيسية مخطط التشتت المكون من بروكرست بيانات تاريخية تناسب (الشكل 6Aii).
- لتغيير التي يتم رسم المكونات الرئيسية، وإظهار القائمة المنبثقة في الفضاء مؤامرة وحدد محور المطلوب لتغيير (الشكل 6Aiii، السهم الأحمر).
- حدد نقاط بيانات أداة اللون (الشكل 6Aiii). اختر المصنفات المستوردة سابقا (القسم 5.2.2) في القائمة المنبثقة التي تظهر الثانية لتحديد لون لكل فئة (الشكل 6Aiv).
- عرض مقدار التباين استولت عليها كل مكون رئيسي في علامة التبويب نتائج (الشكل 6Av). الرسم البياني تصدير كملف. BMP.
- إنشاء وظيفة تحليل التمايز (DFA) شبكة التحول في البرنامج المظهرية باختيار تحليل التمايز وظيفة تحت علامة التبويب القارن (الشكل 6Bi). في القائمة المنبثقة، تأكد من أن مجموعة البيانات المناسب هو SELECTED ونوع البيانات هو الإحداثيات بروكرست-مناسبة.
- تسليط الضوء على أزواج من المجموعات أن تقارن، وتشغيل 1000 اختبارات التقليب (الشكل 6Bii).
- تحت الرسومات، عرض خريطة متجه للإحداثيات في علامة التبويب الفرق الشكل (الشكل 6Biii). إذا كانت الصورة معكوسة، إظهار القائمة المنبثقة في الفضاء مؤامرة لقلب الرسم في الاتجاه الصحيح (الشكل 6Biii).
- اتجاه ناقلات يعكس اختلاف شكل من المجموعة الأولى بالمقارنة مع الثانية، والتي يتم عرضها في القائمة وظيفة التمايز قبل إلى تشغيل تحليل (الشكل 6Bii). لعكس اتجاه ناقلات، إظهار القائمة المنبثقة في الفضاء المؤامرة وتغيير علامة على عامل الحجم بحيث يكون سلبيا (الشكل 6Biii، والرابع). يتم تعيين القيمة قيمة النطاق إلى عامل من أفضل عشرة التي تمثل فروق ذات دلالة إحصائية في موقف تاريخي بين:ن المجموعتين دون تحريف، وعادة ما يتم ترك في الافتراضي (الشكل 6Biv).
- أيضا في القائمة المنبثقة، تغيير الرسم البياني لشبكة التحول إلى ركب ناقلات على شبكة (الشكل 6Biii، والخامس).
- تحديد عدد الخطوط الأفقية والرأسية للشبكة في القائمة المنبثقة (الشكل 6Biii، والخامس).
- تصدير الرسم كملف. BMP.
- عرض بروكرست وMahalinobis المسافات والقيم ص تحت علامة التبويب نتائج (الشكل 6Bvi).
- التحليلات المورفولوجية الإضافية التي هي مفيدة لتقييم مجموعة العلاج أكثر من واحد
- إنشاء عنصر التحول الرئيسية تحليل الشبكة. وشكل الكمبيوتر تغييرات التبويب يعرض خريطة متجه يتغير شكل يمثل التباين داخل كل مجموعة عينة. استخدام القائمة المنبثقة في منطقة مؤامرة لتوجيه الصورة بشكل صحيح ويطغى على شبكة ناقلات التحول. ضبط عامل مقياسإلى القيمة على المحور السيني من الرسم البياني عشرات PC المتوافق مع مركز التقديرية للمجموعة المراقبة. تصدير الصورة كملف. BMP.
- إنشاء مخطط التشتت CVA. تحت علامة التبويب مقارنة على شريط الأدوات الرئيسي، حدد الكنسي تحليل VARIATE، وتسليط الضوء على مجموعة متغيرة المصنف التي تم استيرادها سابقا (انظر القسم 5.2.3). حدد 1000 التكرارات للاختبارات التقليب، ثم اختر تنفيذ. حدد علامة التبويب عشرات CV لعرض CVA مخطط التشتت ثنائي المتغيرات. ومن ونا مميزا هذا بناء على المصنفات التي تم تحميلها. تغيير نظام الألوان من خلال تنشئة القائمة المنبثقة في الفضاء مؤامرة (انظر القسم 5.3.3). تصدير كملف. BMP.
- إنشاء شبكة التحول CVA. يمكن إنشاء شبكة تحويل نتائج CVA عند المقارنة بين أكثر من فريقين. ضمن علامة التبويب الرسومات، واختيار يتغير شكل السيرة الذاتية لتصور شبكة تحويل الإحداثيات معلما. إظهار قائمة منبثقة في الفضاء مؤامرة لتغييراتجاه متجه، ركب النتائج على شبكة التحول، وتحديد عدد خطوط الشبكة. تصدير الرسم كملف. BMP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا، وقد أظهر تحليل كمي لحجم وشكل فموي وجهي لمقارنة الأجنة تعامل مع مستقبلات حمض الريتينويك المانع (RAR المانع) لضوابط غير المعالجة. وعولج الأجنة مع تركيز 1 ميكرومتر من هذا المانع الكيميائية من المرحلة 24 إلي 30 (26-35 HPF)، جرفت، وثابتة في المرحلة 42 (82 HPF). ثم تم معالجتها وتحليلها كما هو موضح في البروتوكول. النتائج هي البيانات الأصلية، ولكن بما يتفق مع الملاحظات في المنشورات السابقة 2،3. وعولج الأجنة السيطرة مع السيارة، DMSO، وتطورت بشكل طبيعي (الشكل 7Ai والثاني). وأظهرت الأجنة تعامل مع تركيز 1 ميكرومتر من المانع RAR تضييق طفيف في الوجه، وتشوهات في العين، وكان فم الجنين مشوه فتح أن المزيد على شكل مثلث (الشكل 7Aiii، والرابع).
أولا، تم قياس أبعاد الوجهية التقليدية وتتلخص في الشكل 7B. S تم تحديد أهمية tatistical عن طريق إجراء اختبار t الطالب على افتراض عدم تكافؤ التباين بين المانع الأجنة وضوابط التعامل لكل قياس. وجدنا أن كلا من طول وعرض الوجه خطم وقد انخفضت بشكل ملحوظ في RAR المانع تعامل الأجنة مقارنة مع الضوابط (P = 0.0062 القيم و 0.0058 على التوالي؛ الشكل 7Bi والثاني). بينما ارتفاع استدارة الوجه والفم وزادت بشكل ملحوظ (قيم ص = 3.7772 × 10 -6، 1.4812 × 10 -7)، وقد انخفض عرض الفم معنويا (P = 2.5175 القيمة × 10 -10، الشكل 7Biii-V). و وأظهرت النتائج عدم وجود فرق كبير في المنطقة الوجهية الشاملة بين المجموعتين (P = 0.3754 القيمة، الشكل 7Bvi). وتشير هذه البيانات إلى أن فقدان الإشارات حمض الريتينويك في وقت محدد في نتائج التنمية في خطم أقصر، وتضييق طفيف للمنطقة midface، وتشوه من فتحة الفم الجنينية.
الإقليم الشمالي "> لتقديم وجهة نظر متطورة من التغييرات شكل المنطقة الوجهية الجنينية في استجابة لانخفاض إشارات حمض الريتينويك، فإننا تستخدم بجوار كيمونسيجيا الهندسي تحليلات، وبعد تحديد ومواءمة المعالم الوجهية باستخدام برامج التحليل المورفولوجية، ثم نحن فحص التباين داخل كل مجموعة عبر تحليل المكون الرئيسي (PCA)، وعندما تم التخطيط اثنين من المكونات الرئيسية الأولى ضد بعضهم البعض والأجنة RAR المانع تعامل تميزوا بشكل واضح من الضوابط على طول محور PC1 (الشكل 7C). وأظهر هذا الاختبار أيضا القيم المتطرفة في العينة مجموعة- يتضح من اثنين المانع تعامل الأجنة التي لم تتجمع مع باقي المجموعة (الشكل 7C، السهام).بعد ذلك، تم تقييم الاختلافات الإحصائية في شكل المنطقة الوجهية بين RAR المانع تعامل الأجنة والضوابط وتصور عن طريق إجراء تحليل التمايز وظيفة (DFA). وبروكرست المسافة بإلى صف كانت المجموعتين اختلافا كبيرا (المسافة = 0،2665، ص القيمة <0.0001، الشكل 7D)، مما يشير إلى تغيير في شكل فموي وجهي عندما تعطلت إشارات حمض الريتينويك. في الواقع، والتحولات الدراماتيكية في موقف المعالم الجانبية في المنطقة الوجهية تشير إلى وجود تضييق على شكل الوجه منها إلى الارتفاع في الأجنة المانع المعالجة (الشكل 7D). وبالإضافة إلى ذلك، فإن التحول نحو الخارج طفيف في الموقف من معالم الأنف (الشكل 7D، السهام) يكشف شذوذ في موقف الأنف في هذه الأجنة التي تنسجم مع ثمرة انخفضت من الخطم. التحولات في المعالم التي تحدد حواف فتحة الفم التغييرات أظهر الموقف الذي يعكس تشكيل الثلاثي على شكل فم فتح التي تنسجم مع الشق متوسط عنها في دراساتنا السابقة 2،3. بالإضافة إلى التحولات ناقلات، ونمط تزييفها من الشبكة التحول يوضح أيضا تغييرات في الشكل أوالمنطقة ofacial. تزييفها في المنطقة midface يتفق مع نقص تنسج midface وتضييق الوجه العام ينظر في الأجنة مع إشارات انخفض حمض الريتينويك (الشكل 7D).
نتائج تحليل التمايز وظيفة (DFA) تظهر تغيرات الشكل التي كانت تتفق مع التحليل النوعي لدينا، وكذلك الكشف عن بعض التغييرات التي لم تكن القبض على نحو كاف بواسطة قياسات حجم التقليدية وحدها. على سبيل المثال، في حين كانت المنطقة الوجهية لا تختلف كثيرا بين الضوابط والمانع تعامل الأجنة (الشكل 7Bvi)، كشفت عن تحول شبكة DFA تغييرات جذرية في هذه المنطقة تتفق مع تضييق الوجه ينظر في المانع الأجنة المعالجة (الشكل 7A، D). وعلاوة على ذلك، توضح تزييفها نمط وتحولات بارزة من فتح فمه، بالإضافة إلى تغير كبير رأينا في الفم استدارة، وتشوه شكل الفم فتح في المانع تعامل امبري السراج. باختصار، مجموعة من القياسات التقليدية للأبعاد الوجه والتحليل كيمونسيجيا هندسي يوضح التغيرات في شكل وحجم المنطقة الوجهية عندما تتعطل إشارات حمض الريتينويك.
الشكل 1. المواد المطلوبة. (أ) أدوات لتحليل البيانات. (ط) 24 لوحة جيدا، (ب) نقل القياسية المتاح ماصة، (ج) دومون # 5 ملقط انوكس، (د) مبطنة الطين طبق بتري، (ت) إغاظة التوالي إبرة، (السادس) أداة ماصة الزجاج، (السابع ) معقمة، يمكن التخلص منها مشرط. (ب) إعداد الطبق مبطنة الطين. (ط) ويستخدم إبرة إغاظة على التوالي لرسم خطوط أفقية في الطين. (ب) يستخدم أداة ماصة الزجاج لجعل منخفضات دائرية على طول كل صف. (ج) يتم ملء الطبق مع PBT للتصوير.
صفحة = "دائما"> 
الشكل 2. التخصيب في المختبر وثقافة البيض القيطم. (A) وبعد حقن HCG، والكبار القيطم المورق والتي يسببها الإناث لوضع البيض. وتجمع (ب) بيض في MBS عالية الملح، المخصبة مع الخصيتين المستخرجة من الذكور، ومثقف باستخدام الأساليب القياسية. يتم نقل (C) إلى الأجنة 24-الطبق جيدا تحتوي على 0.1X MBS باستخدام المعيار، يمكن التخلص منها نقل ماصة. ويستخدم (D) رجل ماصة معايرة لقياس 1 مل في بئر فارغة، ويستخدم علامة لترسيم هذا المستوى من الخارج من جميع الآبار تحتوي على أجنة (الشكل). ثم يضاف 0.1X MBS أو تؤخذ بعيدا بحيث يكون مستوى هذه العلامة.
highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 3. إعداد رؤساء الجنين للتصوير. (A) رسم تخطيطي لاثنين من الشقوق المطلوبة لإزالة الرؤوس، خطوط سوداء صلبة. شريط النطاق = 400 ميكرومتر. (ب) ويتكون الشق الأول في نهاية الخلفي من القناة الهضمية لإزالة الذيل والإفراج ضغوط من مشرط. مقياس شريط = 400 ميكرون. مصنوع (C) والشق الثاني في نهاية الأمامية للامعاء، وبالقرب من القلب، لقطع الرأس تماما. شريط النطاق = 400 ميكرومتر. (D) وجهات النظر الأمامية من صف من رؤساء الجنين المتمركزة في الطين. شريط النطاق = 650 ميكرومتر. (E) وجهات النظر الجانبي من صف من رؤساء الجنين الموقف في الطين. مقياس شريط = 500 ميكرون CG: الغدة الاسمنت.
الشكل 4. قياسات حجم التقليدية الأبعاد الوجهية. (A) عرض الوجه. السهام تشير إلى نقطة حيث الجزء البطني من العين يلتقي محيط الوجه. الخط الأحمر هو عرض الوجه، كما تقاس المسافة بين هذه النقاط. خطوط شريط النطاق = 210 ميكرومتر. (ب) الوجه الارتفاع. الأبيض هي أدلة رسمها قبل القياس على حافة الظهرية للعيون والحافة الظهرية للغدة الاسمنت. الخط الأحمر هو ارتفاع الوجه وقياس والمسافة بين هذين الدليلين في خط الوسط من الوجه. شريط النطاق = 210 ميكرومتر. (C) المنطقة الوجهية. خطوط بيضاء هي أدلة رسمها قبل القياس. (أ) نقطة حيث يلتقي دليل أسفل حافة بطني من العين اليسرى. يظهر خط أحمر تعقب حول العين اليسرى. (ب) نقطة حيث الحافة الظهرية من العين تجتمع دليل العلوي. يظهر الخط الأزرق على الحدود الظهري من المنطقة الوجهية، تتبعت على طول دليل كبير على حافة الظهرية للعيون. (ج) نقطة حيث يلتقي دليل كبير على محيط الوجه الصحيح. يظهر الخط الأخضرتعقب حول العين اليمنى. (د) نقطة حيث حافة بطني من العين اليمنى تجتمع دليل السفلي. يظهر خط أصفر الحدود بطني من منطقة الوجهية، تتبعت على طول القاع دليل على حافة الظهري للغدة الاسمنت. شريط النطاق = 210 ميكرومتر (D) طول الخطم. الخط الأبيض هو الحافة الأمامية من العين ويتم رسم كدليل قبل القياس. الخط الأحمر هو طول الخطم، ويقاس من هذا الخط إلى نقطة حيث الحافة الظهرية للغدة الاسمنت تجتمع محيط الجانبي للوجه. شريط النطاق = 300 ميكرومتر. العرض (E) الفم. السهام هي النقاط التي ظهري وبطني الشفاه الوفاء. الخط الأحمر هو عرض الفم، كما تقاس المسافة بين هاتين النقطتين. مقياس شريط = 200 ميكرومتر. (F) استدارة الفم. وتتبعت محيط فتحة الفم وأظهرت باللون الأحمر. CG: الغدة الاسمنت. مقياس شريط = 200 ميكرومتر.
الرقم 5. التقاط معالم والتصفيات لتحليل كيمونسيجيا الهندسي. (A) باستخدام برنامج تحرير الصور وبرنامج جداول البيانات لوضع المعالم والإحداثيات الالتقاط. (ط) تقاطعات متعددة الالوان هي المعالم وضعت على الصورة باستخدام أداة إضافة نقطة في يماغيج لتمثيل شكل المنطقة الوجهية. (ب) يتم عرض لاندمارك البيانات باستخدام أداة عرض النتائج. (ج) يتم نسخ البيانات ولصق لاندمارك في جدول بيانات. فوق العمود الثاني هو رأس تحديد عدد من المعالم والرمز بواسطة "LM = 24" (المربع الأحمر). تحت العمود الثاني للبيانات، يتم إعطاء عينة اسما فريدا ويرمز له "ID = CON1" (السهم الأحمر). ويتكرر هذا بالنسبة لجميع الصور في مجموعة العينة ويتم حفظ البيانات على شكل ملف نصي. (ب) تحليل البيانات الأولية في كيمونسيجيا تحديثات برامج المزود الهندسيهي البرنامج. (ط) التي تم إنشاؤها في ملف نصي من برنامج تحرير الصور يتم استيرادها إلى البرنامج المظهرية، MorphoJ، كملف TPS. يشار الملف عن طريق السهم الأحمر. (الثاني) هو الانحياز لاندمارك تنسيق البيانات بواسطة بروكرست صالح من قبل المحاور الرئيسية. السهم الأحمر يشير إلى إعدام المحاذاة. (ج) يتم إنشاء مصفوفة التغاير من المعالم تناسب بروكرست في القائمة التمهيدات. (د) يتم إنشاء ملف المصنف في جدول. وتعطى العمود A و B رؤوس "ID" و "المعاملة"، على التوالي. بالنظر إلى كل عينة في جمع بيانات تاريخية لإدخال معرف تحت العمود A، ومجموعة العلاج التي تنتمي إليها كل عينة من المدخلات في العمود B. (V) يتم استيراد ملف المصنف في البرنامج المظهرية كمجموعة متغير المصنف والمتطابقة بواسطة معرف لمجموعة البيانات المختارة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر منهذا الرقم.
الشكل 6. التحليل الإحصائي في البرنامج المظهرية. يتم تحديد (A) مدير تحليل المكون (PCA) (ط) PCA من علامة التبويب الاختلاف. (ب) يتم عرض اثنين من المكونات الرئيسية الأولى من معالم بروكرست بمثابة مخطط التشتت في علامة التبويب حسابات الكمبيوتر. (ج) يتم إحضارها والقائمة المنبثقة حتى في الفضاء المؤامرة. وتستخدم هذه القائمة لتغيير المكونات الرئيسية التي يتم رسم مقابل كل (السهم الأحمر) وغيرها لتلوين نقاط البيانات (الضوء الأزرق). (د) يتم تلوين النقاط البيانات وفقا لمتغيرات المصنف في القائمة المنبثقة. ينظر (V) نسبة التباين التي استولت عليها كل مكون رئيسي في علامة التبويب نتائج. تحليل (DFA) يتم اختيار (ب) وظيفة التمايز (ط) DFA من علامة التبويب مقارنة. (ب) يتم تحديد مجموعة من البيانات بروكرست إحداثيات زارة الشؤون الخارجية، ويتم اختيار المصنفات التي تم تحميلها سابقا لتجميع. ويتم اختيار المجموعات المراد مقارنة وتشغيل الاختبارات التقليب. (ج) يتم عرض نتائج DFA كخريطة متجه في التبويب الشكل الفرق. والقائمة المنبثقة في الفضاء مؤامرة يمكن استخدامها لتوجيه الصورة بشكل صحيح. (د) عن طريق اختيار علامة التبويب تعيين عامل المقياس في القائمة المنبثقة، علامة عامل المقياس يمكن تغييرها. (ت) يتم تغيير خريطة متجه لشبكة التحول مع العدد المرغوب فيه من خطوط الشبكة عن طريق اختيار تغيير نوع الرسم البياني في القائمة المنبثقة من خريطة النواقل. (VI) ويتم النظر Mahalanobis وبروكرست المسافات وما يقابلها من القيم ص تحت علامة التبويب نتائج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أصبح القيطم المورق أداة مفيدة لتشريح آليات تطوير الوجهية التنموية الأساسية. ومع ذلك، هناك حاليا أي بروتوكولات واصفا حجم وشكل التغييرات في هذه المنطقة في الضفادع. فإن الطريقة الموصوفة هنا تسهم إسهاما كبيرا في مجال التنمية الوجهية عن طريق السماح للالكمي أكثر صرامة من الظواهر الوجهية في القيطم والفقاريات الأخرى.
أول جانبا، أهم من تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح هو القدرة على قياس أبعاد الوجه وتحديد وضع المعلم على حد سواء بدقة وبتكاثر. لهذه الغاية، فإنه من الأهمية بمكان أن يتم تصويره وجوه الجنينية في نفس الزاوية والتوجيه والتكبير. ويجب اتخاذ عناية خاصة للحصول على قياسات دقيقة لطول الخطم، كما أنه من الصعب التعامل مع الأجنة أفقيا وتحقيق وضع ثابت. وجود شخص واحد القيام بجميع القياسات على ليالييوم AME يقلل هذا النوع من الخطأ، مع تعظيم استنساخ النتائج. الجانب الثاني الأكثر أهمية لضمان نتائج جيدة هو الحد من التقلبات غير ضرورية، مثل الفروق التنموية أو الخلفية الوراثية. هذا مهم بشكل خاص عند تقييم دلالة إحصائية بين عيوب خفية. الأجنة، لذلك، تحتاج إلى أن تكون في نفس المرحلة عندما تعامل وتصويرها. وعلاوة على ذلك، ينبغي توخي الحذر لضمان معدلات النمو تعادل بين وبين مجموعات العلاج. لتقليل هذه المشاكل مع تقلب، تأكد من أن جميع الأجنة من نفس الوالدين وهي مرحلة المطابقة في بداية التجربة. يقلل أيضا من مصادر خارجية مثل تقلب مصادر مختلفة العازلة وكميات وأرقام مختلفة من الأجنة، والتوزيعات في أطباق ثقافة (على سبيل المثال، منع الازدحام).
والخطوة الرئيسية في تقييم التغييرات الشكل من خلال morphometrics هندسية هي alignmenطن من المعلم ينسق عبر بروكرست مناسبا. من خلال تطبيق هذه الخوارزمية الرياضية، تتم إزالة أي معلومات حول حجم أو الاختلافات في دوران الصورة. تحدد مصفوفة التغاير ولدت في وقت لاحق من الارتباطات unstandardized معلما ينسق بين جميع الأجنة في مجموعة البيانات، والتي techniques- متعدد المتغيرات الإحصائية مثل المكون الرئيسي أو التمايز وظيفة analyses- لا يمكن أن يؤديها.
تحليل المكون الرئيسي (PCA) يقلل عينة معقدة لمجموعة أصغر من المتغيرات تسمى المكونات الرئيسية 26. ويمثل المكون الأول لمعظم التباين داخل مجموعة عينة، مع كل مكون لاحق يمثل بقية. من خلال التآمر على عنصرين الأولى ضد بعضهم البعض باستخدام برنامج المورفولوجية، والعينات التي هي الأكثر مماثلة عنقودية معا. في هذه الطريقة، PCA يميز الجماعات داخل مجموعة عينة، مع تحديد وقت واحد الاختلاف داخلها. في سومحالة البريد والمجموعات قد لا تكون مميز بوضوح عن بعضها البعض وتتداخل على طول أحدهما أو كليهما محاور. في هذه الحالة، فإنه من المفيد لرسم المكونات الأخرى (على سبيل المثال، PC3) من أجل الكشف عن ملامح خفية التي يتم من خلالها تمييز المجموعات. وهذا هو ذات الصلة وخصوصا عندما يكون التباين الكلي يتوزع بشكل متساو بين أول عدة متغيرات.
يحدد تحليل التمايز وظيفة (DFA) من بروكرست البيانات مناسبا سواء في عينات مجموعة من البيانات وتميز بفعالية في مجموعات من المتغيرات المستمرة التي تحدد لهم. لذا يتم تصنيف العينات إلى مجموعات السابقة للتحليل، ويتم تحويل المتغيرات إلى مكونات دعا ظائف تنطوي على تمييز لتحديد العلاقة الإحصائية بين المجموعتين 27. قبل تشغيل هذا التحليل، من المهم الإشارة إلى عدد من الاختبارات التقليب. هذه الاختبارات التقليب بطريقة عشوائية البيانات مثل أن أي افتراضات حول التوزيع هي eliminaتيد. المزيد من الاختبار التقليب التكرار زيادة دقة للقيمة ص. عندما تصور في شكل شبكة التحول، تغييرات كبيرة في الموقف التاريخي بين الجماعات يجري مقارنة يتم عرضها. وعلاوة على ذلك، فإن نمط تزييفها من الشبكة يكشف حيث تحدث تغيرات الشكل. والعيب من هذا التحليل هو أنه لا يمكن استخدامها للمقارنة بين مجموعتين. إذا كان هناك ثلاثة أو أكثر من المجموعات في مجموعة عينة للمقارنة، فمن الأفضل لإجراء تحليل VARIATE الكنسي. هذا هو مماثل لDFA في أنه يولد الإحصائية ف القيمة؛ ومع ذلك، فإنه يظهر التغييرات التي تحدث على عينة كاملة في مجموعة بالإضافة إلى تلك التي تحدث بين المجموعات الفردية ضمن تلك المجموعة.
القيد الرئيسي لهذا البروتوكول الكمي فموي وجهي هو أنه لا يمكن إلا أن تطبق على البيانات ثنائية الأبعاد. وتشمل أهدافنا المستقبلية يستخدم الفحص بالاشعة المقطعية أو متحد البؤر المجهري لتطوير أساليب مماثلة لتحليل البيانات ثلاثية الأبعاد. من ناحية أخرى،العمل مع الصور ثنائية الأبعاد هي أيضا واحدة من نقاط القوة الرئيسية لهذا البروتوكول. وهناك حاجة المجسامات الأساسية الوحيدة المجهزة بكاميرات لالتقاط صور للوجه الجنينية. وOpenware المستخدمة لهذا التحليل البيانات أيضا يزيد من إمكانية الوصول إلى هذه الطريقة، في حين خفض التكلفة. وعلاوة على ذلك، لا يشترط معرفة متقدمة من التصوير سفسطائي، والتحليلات الإحصائية، أو برمجة الكمبيوتر لاستخراج نتائج ذات مغزى وكبيرة من البيانات. في الواقع، يجري حاليا تدرس هذه التقنية كجزء من دورة المختبرات الجامعية في قسم علم الأحياء من جامعة فرجينيا كومنولث. وبالتالي، فإن بروتوكول الكمي فموي وجهي المقدمة هنا من السهل تعلم وتطبيق في فترة قصيرة من الزمن. كما تمثيل الفيديو، ويسلط الضوء على الخطوات الهامة مثل تحديد المواقع والملاحة الأجنة البرنامج لضمان بروتوكول يمكن استخدامها بنجاح حتى الطلاب غير مدربين والباحثين. وباختصار، فإن هذا البروتوكول يوفر مصدرا قيمابالنسبة للمجتمع البحث وكأداة تعليمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
دعمت بدء الأموال إلى A. ديكنسون من جامعة فرجينيا كومنولث في هذا العمل.
الكتاب نود أن نعترف دان Nacu لموهبته الفنية في خلق الشكل التخطيطي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm x 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15 °C or 20 °C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co. | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
References
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
- Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
- Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
- Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
- Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
- Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
- Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
- Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
- Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
- Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
- Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
- Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
- Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
- Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. (1967).
- Nieuwkoop, P. D. aF. J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , Garland Publishing Inc. (1994).
- Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
- Hill, T. L. P. STATISTICS: Methods and Applications. , StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).
