Summary
アフリカツメガエル胚の顔面サイズおよび形状を定量化する方法が開発されている。このプロトコルでは、従来の大きさの測定は、口腔顔面開発や欠陥のより高度な分析を可能にするために、幾何学的形態計測と組み合わされる。
Abstract
アフリカツメガエルは、頭蓋顔面の開発や欠陥を支配するメカニズムを解剖するための重要なツールとなっています。口腔顔面開発を定量化する方法は、遺伝的または分子的遺伝子発現またはタンパク質機能を操作することができる物質と廃止時顔面表現のより厳密な分析を可能にする。胚の頭部の二次元画像を用いて、従来のサイズの寸法を、そのような口顔の幅、高さ及び面積 - を計測する。また、胚口開口部の真円度測定は、口の形状を説明するために使用される。これらの二次元画像の幾何学的形態計測はまた、口腔顔面領域の形状の変化をより洗練されたビューを提供するために行われる。ランドマークは、口腔顔面領域内の特定のポイントに割り当てられ、座標が作成されます。主成分分析は、その後の処置を判別主成分にランドマークの座標を低減するために使用されるグループ。これらの結果は、類似した口腔顔面形状の個人が一緒にクラスター化した散布図として表示されます。これは、統計的に両群間のランドマークの位置を比較し、判別関数分析を実行することも有用である。この分析は、ランドマークの位置の変化は、ベクトルとして見られる変換グリッドに表示される。グリッドはワーピングパターンがかなりのランドマークの位置が変更されている場所を示すために表示されるように、これらのベクターに重畳される。判別関数分析における形状の変化は、統計的尺度に基づいており、したがって、p値によって評価することができる。この分析は、唯一のステレオスコープやフリーウェアのソフトウェアを必要とし、シンプルかつアクセス可能であるため、貴重な研究と教育のリソースとなります。
Introduction
人間の先天性欠損症の最も一般的かつ破壊的な種類の中には、口腔顔面裂1として、口や顔に影響を与えるものである。不正な形式の口腔顔面構造を持つ子どもたちが生涯にわたって、複数の手術を受け、顔面disfigurements、スピーチ、聴力や食の問題に苦労しています。したがって、cranio-および口腔顔面開発に新たな研究を促進することは、ヒトにおける先天性欠損、これらのタイプの予防と治療に最も重要である。 アフリカツメガエル頭蓋顔面の開発を支配するメカニズムを解剖するための新しいツールとして浮上している（いくつかの例は、2,3,4を含む-11）。したがって、この種の頭部の発達と顔の間に大きさや形状変化を分析するための定量的な方法は3非常に強力である可能性があります。
ここでは、そのような方法を提示する。 アフリカツメガエルの研究12から適応幾何学的形態計測を持つ伝統的なサイズ測定を組み合わせる13-15を分析する研究のSUP>と富。このプロトコルの目的は、研究者は、正常および異常な発達の間の異なる顔面表現型を区別するために、顔の大きさや形状を定量化できるようにすることである。この分析は、遺伝子および/または環境要因の相乗効果に起因するもののような微妙な顔面頭蓋の欠陥との間のより良好な区別を可能にする。さらに、この定量方法は、また口腔顔面欠陥の場合でもわずかな改善や救助を明らかにできた。したがって、これはそれの潜在的治療薬の分析に有用な指針になります。
ここで提示する顔の測定値と幾何形態計測の組み合わせは、大部分が1つまたは他の15-18を利用し 、現在のプロトコルよりも口腔顔面領域の大きさと形状の両方のより総合的な統計分析を可能にする。さらに、我々はの内側および外側面の両方を評価するための簡単な方法を提示現在の研究13,19で使用される洗練された三次元画像装置を必要とせずに、顔。
私たちは、 アフリカツメガエルでこのプロトコルは、異常な口腔顔面開発および中央値口蓋裂2,3を誘導するレチノイン酸受容体阻害剤で処理された胚をツメガエル実証する。これらの胚における口腔顔面領域の寸法及び形状の定量化は、類似の口蓋裂およびマウスモデル20,21を有するヒトに類似している顔面の変化を明らかにした。しかしながら、このプロトコルは、成長因子などの天然物質、除草剤、またはタンパク質などの口腔顔面開発に関する他の化合物の効果を評価するために利用することができる。さらに、損失または機能実験のゲインを介して遺伝子発現の摂動から生じる口腔顔面の大きさ及び形状の変化（アンチセンスまたはモルホリノCrispersを使用するには、/ Talens）もまた、このプロトコルを使用して定量することができる。最後に、我々は、このメソッド書または仕様書を開発LLY アフリカツメガエルの形態を評価する。しかしながら、容易に任意の脊椎動物の分析のために修正される。他のアプリケーションも、進化や生態の研究のために密接に関連した種を比較するため、このプロトコルを使用して含めることができます。ここで提供する例は、口腔顔面領域の分析を記述するためにこのプロトコルを利用するが、それは容易に他の領域、臓器または構造の分析のために修正することができる。
この口腔顔面定量化プロトコルは、研究コミュニティのための貴重な資源だけでなく、ビデオのデモンストレーションとして学部学生のための優れた教育ツールとなります。
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Protocol
アフリカツメガエルを使って実行されたすべての実験は、IACUC（プロトコル＃のAD20261）によって承認されている。
1.準備試薬および必要な物品
- 試薬：
- 10倍MBS（変形バース食塩水）溶液22の1リットルを作る。 1Lの蒸留水に塩化ナトリウム（880ミリモル）のKCl（10mM）をし、MgSO 4（10mM）を、HEPES（50mMの、pH7.8）で、そして飽和NaHCO 3（25ミリモル）を加える。 NaOHで7.8にpHを調整する。
- 蒸留水900ml中に10×MBS溶液100mlに希釈して1×MBSの1 Lを作る。 1MのCaCl 2溶液0.7mlのを追加します。
- 蒸留水900ml中に1×MBS溶液100mlに希釈して0.1×MBSの1 Lを作る。 0.1×MBS液1Lに、胚培養に使用するための10 mg / mlのゲンタマイシン溶液1mlを加える。
- 10×MBS 100mlの5 M NaClを4mlの溶解することにより、高い塩MBSを行う。全量を1 Lとなるまで蒸留水を加える
- 100％eを希釈して70％エタノールを加える蒸留水を用いて70％エタノールにthanol。
- ジメチルスルホキシド（DMSO）中の10mMストック溶液を調製し、BMS-543を作る。
- 蒸留水50mlにパラホルムアルデヒド粉末を4g添加することにより、4％パラホルムアルデヒド（PFA）を作る。液が透明になるまで、5MのNaOH滴下を追加、その時点で約65℃、ホットプレート上で加熱する。
- ソリューションはクリアしたら、火から外し、50ミリリットル2X PBSおよび100μlのTween-20を追加します。氷上でRTに冷却させる。 HClを用いて7.2と7.5との間にpHを調整する。
- 8gのNaCl、0.2gのKCl、のNa 2 HPO 4 1.44gを、蒸留水を800mlのKH 2 PO 4 0.24gを溶解することによりツイーン（PBT）を含むリン酸緩衝生理食塩水を作る。 HClを用いて、pHを7.4に調整する。 Tween-20を2 mlを追加します。 1 Lを等しくなるように蒸留水で最終容量を調整
- 水または0.1×MBSを50mlの蒸留システイン1gを溶解させることによってシステイン溶液を作る。 5MのNaOHをaの1.5ミリリットルを追加します。ND 7.8にpHを調整する。
- 100ミリリットルの100％EtOHにベンゾカイン粉末10gを添加することによって10％のベンゾカインストック溶液を作る。固定のための準備が成人男性および胚の安楽死は、0.05％溶液に希釈する。
- L15バッファの9ミリリットルにウシ血清1ミリリットルを追加することによって、精巣·ストレージ·ソリューションとなります。
- 必要な工具および機器：
- 材料および装置の表に記載されている機器を入手し、 図1に示す。
- ピペットツールを変更します。ブンゼンバーナーから炎にガラスパスツールピペットの先端を置きます。それが溶けて丸みを帯びた密封端を形成するまでピペットチップを回転させる。
- プレート全体をカバーするように滑らかに、プラスチック製ペトリ皿の底に粘土を平らに（任意のサイズを使用することができる）（ 図1Aiv）。
- 軽く45°の角度で粘土で裏打ちされた皿にストレートからかい針を押してください。そこに針を持ち、ゆっくりとペトリを移動落ち込んライン（ 図1Bi）を作成するための水平一品。行の所望の数のために繰り返します。
- 胚ヘッド（ 図1Bii）を配置し、撮影しながら、胚を組織を支援するために、粘土で裏打ちされた皿の各行の浅い、円形くぼみを作 るためにガラスピペットツールの終了を使用してください。
- 写真撮影のために、PBT（ 図1Biii）との一品を埋める。使用の間、完全に70％エタノール、続いて滅菌水で皿粘土表面を洗浄する。
2. アフリカツメガエル胚培養およびインヒビター治療
- アフリカツメガエルの卵の体外受精や文化 ：
- 入手して、文化アフリカツメガエルは、標準的な公開された方法22,23を用いて、胚ツメガエル 。
- 簡単に言えば、0.05％ベンゾカイン溶液に浸漬することによって成人男性を安楽死させる。精巣記憶バッファ内精巣と店舗を解剖。注入するヒト絨毛性ゴナドトロピン（HCG）を有する成人女性は、高塩MBSに卵を収集し、解剖精巣（ 図2A、B）を用いてインビトロで受精させる。
- 15℃での0.1×MBS内の培養胚は所望の段階では（Nieuwkoopとフェイバー24,25によるアフリカツメガエルの正常な表に従って段階の胚）に達するまで。
- ここでは、ステージ22（24時間後に受精（HPF））、及び、鋭利鉗子の2ペアを使用して実体顕微鏡下で卵黄膜を除去するまで、培養胚。 0.1×MBSの30〜40 mlを含むクリーンなペトリ皿（直径100mm）への標準、使い捨てトランスファーピペットを用いて移植胚。
- （ 図2に示されている） アフリカツメガエル胚の阻害剤の治療：
- 較正されたピペット-MANを使用した0.1×MBSの1ミリリットルと24ウェル培養皿の必要な井戸を埋める。細かい点マークとよく外を区分ER（ 図2D、挿入図）。また、24ウェル培養皿の蓋上の各ウェルに添加する内容をラベルするためのマーカーを使用する。実験ノートに24ウェルのセットアップページにこの情報をコピーします。
- 各ウェルの標準を使用して、使い捨てトランスファーピペット（ 図2C）に5-10の胚を移す。各ウェル中の胚と同じ数を配置します。
- アップ上部またはそれは1ミリリットルマークされた行（ 図2D）とのレベルになるように0.1×MBSを削除します。 （DMSOの最終容量が1％になるように）DMSOの適切な量を加え、穏やかに旋回させる。胚に近すぎるのDMSOを追加しないように注意して、バッファの表面と胚の接触を避ける。
- 指定されたウェルへの化学物質の適切な量を加え、穏やかに再び旋回。ここでは、1ミリリットル0.1XのMBSに10 mMのBMS-453（レチノイン酸受容体拮抗薬）およびDMSOの9μlに1μlを添加する。
- 化学物質は光感受性である場合には、緩くCULをラップアルミホイルでトゥーレ皿。所望の段階まで、15℃のインキュベーターで培養胚。この例では、16〜18時間の胚を扱う。
- 治療から胚を洗浄し、オタマジャクシの段階まで飼育：
- 使い捨てトランスファーピペットで溶液の四分の三に2分の1を削除します。胚を乱さないように注意してください。新しい転送ピペットを用いて、0.1×MBSでうまく詰め替え。この3-6回繰り返します。
- ゲンタマイシンと0.1×MBS（1ミリリットル/ L）100mlを含有する大きなペトリ皿（直径150mmの）への移植胚。彼らは、ステージ42-45（82から100 HPF）に達するまで、15℃で胚をインキュベートする。
- 他の胚の汚染や死亡を防ぐために、毎日のゲンタマイシンを含む0.1×MBS·ソリューションを変更し、速やかに死んだ胚を取り除く。実験ノートのデッド胚の数を記録します。
- ホルムアルデヒド（PFA）で胚を固定：
- ステージ42および45（82から100までの胚を修正HPF、それぞれ）0.1×MBS 1-2 mlを含む新しい24ウェル培養皿にそれらを転送することにより。治療のセットアップは、上述したように同じ情報（セクション2.2.1）で蓋にラベルを付けます。
- まだカバーされた胚を残して、けがを防止するための最小限の接触を確保しながら、各だけでなく、可能な限り多くから0.1×MBSを削除します。 0.1×MBSで0.05％ベンゾカイン溶液を1-2 mlを加えた胚は、もはや刺激に応答するまでインキュベートん。
- 4％PFA 1-2 mlを加え。好ましければあるいは、固定のために標識マイクロ遠心チューブに胚を置く。
- 回転シェーカー上、4℃で24時間、PFA中で胚をインキュベートする。 3-5時間の期間にわたって、PBTで3〜4回の洗浄を行うことによって、PFAを削除します。
3. アフリカツメガエルオタマジャクシの口腔顔面撮影領域
- プレ撮影準備（これは図3に示されている）。
- （150大型シャーレに固定した胚を置きPBTの約100mlを含有する直径mm）である。
- ボディ（ 図3A、黒い実線）から頭部を切断する2切開を作る。まず、ピンセットで胚を保持し、滅菌メス（ 図3B）で腸の後部側に切開する。完全に頭（ 図3C）を除去するために、心臓の近くに、腸の前方側の第二の切開を行います。
- ピペットは、標準的な、使い捨てトランスファーピペットを用いて、粘土で裏打ちされたディッシュ（パート1.2.2）に胚ヘッドを切断。
- 正面ビューの場合、円形のくぼみの内側にダウン胚ヘッド後方側に配置するために鉗子の2ペアを使用。鉗子を使用して、胚の頭部及び周囲の粘土、それらがカメラを向いていると後方またはいずれかの側（ 図3D）に傾斜されていないような位置の胚の両方を操作する。穏やかに鉗子および/またはガラスを使用して頭部の周りに周囲の粘土を押し出すピペットツールは、所定の位置に頭部を固定します。
- 側面図では、同じ方向を向いて、彼らは彼らの側にあるように、円形の凹部の内部に胚ヘッドを位置決めするために鉗子を使用して、粘土に対して平らである。すべての胚のセメント腺が同じ角度（ 図3E）で下方に位置するように胚の頭と周囲の粘土を操作します。横測定を行う際に精度を確保するためのガイドとしてからかい針で描かれた行を使用してください。
- オタマジャクシヘッドの画像をキャプチャ：
- 添付されたデジタルカメラと対応するカメラソフトウェアを持つ任意の解剖顕微鏡を用いて、オタマジャクシの頭を撮影。すべての胚について一定に保つことができる最高の倍率を使用してください。
- 胚を中央にして同じ方向にそれらすべてに直面している。口腔顔面領域の最も正確な画像を可能にする最高の照明条件を用いて画像をキャプチャする。ポジション過度の影を避けるために点灯します。可能な限り高い解像度で.TIFFファイルとして画像を保存します。
4. アフリカツメガエルオタマジャクシにおける顔面サイズの寸法を測定し、分析
- （ 図4に要約）口腔顔面の長さを測定します。
- 顔の幅を決定します。それぞれの目の腹の部分は面（ 図4A、矢印）の周囲を交わるポイントを特定し、これらの点（ 図4A、赤色の線）との間の距離を測定します。
- 顔の高さを決定します。まず、それぞれの目の間の距離を測定し、中間点を算出することにより、正中線を決定する。次に、目の背最もエッジと背セメント腺（ 図4B、白線）の中で最もポイントをマーク水平線を引く。正中線、水平線（ 図4B、赤線）との間の距離を測定する。
- Tを決定彼口腔顔面領域です。面積測定（ 図4C、白線）を導くために目とセメント腺の背側縁をマーキング同じ水平ラインを使用してください。セメント腺の上部をマーキング水平線が顔（ 図部4Ca）の左側の周囲を満たしている時点で開始します。
- 目の先頭をマークする水平線が顔（ 図4CB）の周囲を満たす時点まで目を包み込む顔のエッジに沿ってトレースします。それは顔（ 図4CC）の右辺の周囲を満たす点まで、この背最も水平線に沿ってトレースし続ける。
- セメント腺の上部をマーキング腹最も水平線面（ 図4CD）の右辺の周囲に適合している時点まで眼を取り囲む面の縁部に沿って下方にたどる。この一番下の水平線に沿ってUNTトレースし続けるILそれはトレースが始まった点を満たしています。トレース内側の面積を計算するには、画像編集ソフトウェアを使用してください。
- 鼻の長さを決定します。横画像に、眼の前をマーク垂直線を作る。次に、顔が目（ 図4D）の前方をマークする垂直線にセメント腺の背側端を満たす前方最もポイントからの水平距離を測定します。
- 口の幅を決定します。口の上部と下部「唇」会うを開いて、左右の点の間の水平距離（ 図4E）を測定する。これらは唇交連のカエルと同等と考えることができる。
- 口の丸みを決定します。 （ここで、逆アスペクト比4口丸さを計算する × [エリア]）/（π × [長径] 2 >）。
- 図4Fに示すように口の開口部のエッジをトレースする、フォトエディタでなげなわツールを使用します。メインツールバーの分析を選択し、メジャーを選択します。あるいは、領域、口の開口部の直径の測定値から真円度を計算する。
- 顔の寸法のデータ分析：
- 入力データ解析プログラムに顔の寸法の測定値は、対照と処置群を比較した。棒グラフを作成するために、実験群と対照群の両方について、各測定の平均値を決定します。エラーバーを作成するために、標準偏差を求める。統計的に群を比較するためにスチューデントのt検定を行います。
注：このデータは、胚の中で、開発のわずかに異なる速度に非常に可変とすることができます。
- 入力データ解析プログラムに顔の寸法の測定値は、対照と処置群を比較した。棒グラフを作成するために、実験群と対照群の両方について、各測定の平均値を決定します。エラーバーを作成するために、標準偏差を求める。統計的に群を比較するためにスチューデントのt検定を行います。
口腔顔面形状と形態計測5.定量分析
- 場所の目印とクレア（ 図5（a）に示す）、TEランドマーク座標ファイル。
- これらは、対象画像の形状をキャプチャし、繰り返し分析される全てのサンプルにおいて同じ相対位置に配置することができるようなランドマークを選択する。構造はすべてのサンプルに存在しない場合は、この構造上のランドマークを配置しないでください。
- ここでは、そのような目、鼻孔、口などの特徴的なマークのついた中顔面を表現するために24ランドマークを配置します。途中（例えば、口のランドマーク、図5Ai）以前に置かランドマークの間の一貫性、場所のランドマークのために。
- ランドマークの座標を取得して、 "ランドマーク座標ファイル」を作成します。オタマジャクシ面（例えば、第一の制御胚）の最初の画像を開きます。
- メインツールバーの[プラグイン]タブを選択し、ドロップダウンメニューから[Pointpickerを選択します。 （選択してランドマークが色とりどりの十字として表示されるように、所望の位置にポイント]タブと場所のランドマークを追加します。
- 移動十字ツールを選択することで、配置後にランドマークの位置を移動します。すべてのランドマークの画像上に置かれてきた場合には、メインツールバーの[表示結果]タブを選択し、ランドマークの座標を表示し、スプレッドシートプログラム（ 図5Aiii）にコピーするには、Show（ 図5Aii）を選択します。
- 表計算プログラムにこの最初の胚からこれらの座標をペーストすると、データの上に空の行を残す。この空の行のB列（列1）では、タイプ「LM = "サンプル中のランドマークの番号を指定します。 24ランドマークが作成されているのでここでは、（ 図5Aiii、赤いボックス）「LM = 24」と入力します。
- データポイントの下の行のサンプルを特定する名前を持つ、タイプ "ID ="。これは画期的な第1の制御胚（ 図5Aiii、赤い矢印）の座標データであるため、ここでは、図5Aiiiで、「ID = CON1」と入力します。
- テキストドキュメントに全体の2列目と3列目にコピーして、.txtファイルとして保存します。
- メインツールバーの[プラグイン]タブを選択し、ドロップダウンメニューから[Pointpickerを選択します。 （選択してランドマークが色とりどりの十字として表示されるように、所望の位置にポイント]タブと場所のランドマークを追加します。
- これらは、対象画像の形状をキャプチャし、繰り返し分析される全てのサンプルにおいて同じ相対位置に配置することができるようなランドマークを選択する。構造はすべてのサンプルに存在しない場合は、この構造上のランドマークを配置しないでください。
- （ 図5Bに図示）は、データ分析のために形態計測ソフトウェアプログラムをセットアップする。
- ここでは、形態計測ソフトウェアプログラムのメインメニューの[新しいデータセットの作成]を選択します。ファイルと適切なボックスに設定されたデータに名前を付ける（例えば、「レチノイン酸抑制」と「顔のランドマーク」、それぞれ）ポップアップ画面で（ 図5Bi）。 TPS、およびSELとしてファイルをインポートするECTデータセット（ 図5Bi、赤い矢印）を作成する座標のテキストファイル。
- データのアライメントおよびプロクラステスは、フィット：
- プロクラステスフィット感とアライメントを行う。 、プロジェクトツリー]タブで設定されたデータをハイライト表示し、メインツールバー上の前置きを選択し、ドロップダウンメニューに新しいクラステスフィット。
- 主軸によって整列を選択して、ボックス（ 図5Bii、赤い矢印）の下部にあるプロクラステスフィットを実行]を選択します。 、ドロップダウンメニュー前置きに戻り共分散行列（ 図5Biii）を生成]を選択し、[Execute]を選択します。
- [結果]タブで共分散行列の相関関係を表示します。
- それは実験群またはコントロール群に属しているかどうかを区別するために適切な分類子変数にデータセットの各サンプルを割り当てることによって「分類子ファイル」を作成する。
- スプレッドシートの2列にラベルを付けます。最初のコラムのヘッダにラベルを付けnは"ID"と入力同じIDの各サンプルに与え（例えば、CON1、RARINHIB1など; 図5Biv）。各セルに隣接するセルのIDにリストされたサンプルに対応治療群を「治療」と入力して、2番目の列のヘッダにラベルを付けます。
- ここでは、分類器（図5Biv）として「CONTROLおよびRAR阻害剤」のラベルを使用しています。テキストファイルにコピーし、.txtファイルとして保存します。形態計測ソフトウェアプログラムにインポート分類変数。識別子による一致を選択し、テキストファイル（ 図5BV）を開きます。
- バリエーションドロップダウンメニューを選択し、主成分分析（ 図6Ai）を選択することにより、主成分分析（PCA）の散布図を作成します。 PCの形状が変化し、固有値、およびPCのスコア（ 図6Aii）：次に、3つの追加のタブを表示するには[グラフィックス]タブを選択します。 PCのスコア]タブには、Bが表示されますプロクラステスフィットランドマークデータ（ 図6Aii）の主成分散布図をivariate。
- 主成分がプロットされている変更するには、プロット空間でのポップアップメニューを表示し、（ 図6Aiii、赤い矢印）を変更したい軸を選択します。
- カラーデータポイントツール（ 図6Aiii）を選択します。セレクト分類器は、以前の各カテゴリ（ 図6Aiv）の色を決定するために表示される2つ目のポップアップメニューで（5.2.2項 ） を輸入した。
- [結果]タブ（ 図6Av）における各主成分によって捕獲分散の量を表示します。の.bmpファイルとしてエクスポートグラフ。
- 比較タブ（ 図6Bi）の下で判別分析を選択することによって、形態計測ソフトウェアプログラムの判別分析（DFA）の変換グリッドを作成します。ポップアップメニューで、適切なデータセットがSELであることを確認精製カートリッジとデータのタイプは、プロクラステス適合座標である。
- 比較対象のグループのペアを強調表示し、千順列テスト（ 図6Bii）を実行します。
- グラフィックスの下、形状差異]タブ（ 図6Biii）の座標のベクトル地図を表示します。画像が反転している場合は、正しい向き（ 図6Biii）でダイアグラムを反転するプロット空間でポップアップメニューを表示させる。
- ベクトルの方向は、事前の分析（ 図6Bii）を実行する判別機能メニューに表示されている第二に比べ最初のグループからの形状の違いを反映している。 、ベクトルの方向を逆にプロット空間でのポップアップメニューを表示し、それが負になるようにスケールファクタの符号を変更するには（ 図6Biiiを、IV）。スケール値の値が最良betweeランドマークの位置の統計的な差を表す10倍に設定されているnは歪みのない二つのグループは、通常はデフォルト（ 図6Biv）に残されている。
- また、ポップアップメニューで、グリッド上にベクトルを重ね合わせる変換グリッドにグラフを変更します（ 図6Biii、v）である 。
- ポップアップメニューのグリッドの水平および垂直ライン数を指定し（ 図6Biiiを、v）である 。
- の.bmpファイルとしてグラフをエクスポートします。
- [結果]タブ（ 図6Bvi）の下でプロクラステスとMahalinobis距離とp値を表示します。
- 複数の治療群の評価に有用である追加の形態計測分析
- 主成分分析変換グリッドを作成する。 PCの形状の変更タブには、各サンプル群内の分散を占めて形状変化のベクトルマップが表示されます。画像を適切に方向付けると変換グリッド上にベクトルを重ね合わせるプロットエリアのポップアップメニューを使用してください。スケールファクタを設定対照群の推定中心に対応するPCスコアのグラフのx軸の値である。の.bmpファイルとして画像をエクスポートします。
- CVAの散布図を作成します。 （5.2.3項を参照）は、メインツールバーの[比較]タブの下で、正準変量分析]を選択し、以前にインポートしたクラシファイア変数セットを強調表示します。順列テストのための千回の反復を選択し、[実行]を選択。二変量CVAの散布図を表示するには、CVスコア]タブを選択します。これは、アップロードされた分類子に基づいて色分けされている。プロット空間でポップアップメニューを表示させることにより配色を変更（5.3.3項を参照）。の.bmpファイルとしてエクスポートします。
- CVA変換グリッドを作成します。以上の二つのグループを比較した場合CVA結果の変換グリッドを生成することができる。 [グラフィックス]タブの下で、ランドマーク座標の変換グリッドを視覚化するためのCV形状変化を選択します。変更にプロット空間でのポップアップメニューを表示させるベクトルの方向は、変態グリッド上に結果を重ね合わせると、グリッド線の数を指定します。の.bmpファイルとしてグラフをエクスポートします。
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Representative Results
ここでは、口顔の大きさおよび形状の定量分析は、未処理対照とレチノイン酸受容体阻害剤（RAR阻害剤）で処理された胚を比較することが実証された。胚をステージ24から30までこの化学阻害剤の1μM濃度（26-35 HPF）で処理し、洗い流され、ステージ42（82 HPF）で固定した。次いで、それらを処理し、プロトコルに記載のように分析した。結果は、元のデータが、以前の出版物2,3の観測と一致している。対照胚は、ビヒクル、DMSOで処理した（ 図7AIと、ii）通常、開発された。 （ 図7Aiii、ⅳ）より三角形をRAR阻害剤の1μMの濃度で処理された胚は、顔、目の異常のわずかな狭小化を示し、それを開いて不正な形式の胚口があった。
まず、従来の顔面寸法を測定し、 図7Bに要約されている。 S tatistical有意性は、各測定のための阻害剤で処置した胚と対照との間で不等分散を仮定しスチューデントt検定を行うことによって決定した。私たちは、鼻の長さと顔の幅の両方が大幅にコントロールと比較したRAR阻害剤治療胚で減少したことを見出した（それぞれp値= 0.0062及び0.0058; 図7BI、ⅱ）。顔の高さと口の真円度が有意に増加したが（p値を=×10 -6 3.7772は、1.4812×10 -7）は 、口の幅が大幅に減少した（p値= 2.5175×10 -10; 図7Biii-v）の .theの結果は、2つのグループ間の全体的な口腔顔面領域（; 図7Bvi p値= 0.3754）に有意差を示さなかった。これらのデータは、短い口吻で開発成果の特定の時点におけるレチノイン酸シグナル伝達の喪失、中顔面領域のわずかな狭小化、および胚口の開口部の奇形を示した。
塩基 ">縮小レチノイン酸シグナルに応答して、胚の口腔顔面領域の形状変化の洗練されたビューを提供するために、次の利用の幾何学的形態計測分析。形態計測分析ソフトウェアを使用して口腔顔面ランドマークを識別し、位置合わせした後、我々は、各内の分散を調べた最初の2つの構成要素が互いに、RAR阻害剤で処理した胚に対してプロットしたときに、主成分分析（PCA）を介してグループは。PC1軸（ 図7C）に沿った対照から明確に区別された。この試験は、サンプル設における異常値を示したグループ（ 図7C、矢印）の残りの部分とクラスタリングしなかった2阻害剤治療の胚で図示。次に、RAR阻害剤で処理された胚と対照との間口腔顔面領域の形状における統計的差異を評価し、判別関数分析（DFA）を行うことにより可視化した。プロクラステス距離betweenつのグループは、有意に異なった（距離= 0.2665、p値<0.0001、 図7D）、レチノイン酸シグナル伝達が中断されたときに口顔形状の変化を示す。実際、口腔顔面領域での横方向のランドマークの位置での劇的なシフトは、阻害剤処理された胚（ 図7D）での高さにそれぞれの顔の形の狭窄を示している。また、鼻のランドマーク（ 図7D、矢印）の位置のわずか外側へのシフトは、鼻の減少伸長と一致しているこれらの胚における鼻孔位置の異常を明らかにする。それが私たちの以前の研究で報告された2,3の中央値裂と一致している開いた三角形の口の形成を反映した口のオープニングショー位置が変化のエッジを定義するランドマークのずれ。ベクトルシフトに加えて、変換グリッドの反りのパターンはまた、形状変化を示し、またはofacial地域。中顔面領域における反りは、中顔面形成不全と減少したレチノイン酸シグナルと胚で見られ、全体的な顔の狭小化（ 図7D）と一致している。
判別分析（DFA）の結果は、我々の定性分析と一致した形状変化を示しているだけでなく、適切に単独の伝統的なサイズ測定によって捕獲されなかったいくつかの変更を明らかに。口腔顔面領域が対照の間に有意差はなかったし、治療胚（ 図7Bvi）を阻害しながら、たとえば、DFA変換グリッドは、阻害剤処理された胚（ 図7A、D）に見られる顔の狭小化と矛盾し、この領域での劇的な変化を明らかにした。さらに、我々は口の丸みで見た重要な変化と相まって口の開口部の反りパターンとランドマークのシフト、阻害剤処理したエンブリー形状を開け口の奇形を説明OS。レチノイン酸シグナルが中断された場合要約すると、顔の寸法および幾何学形態計測分析の従来の測定値の組み合わせは、口腔顔面領域の形状及び大きさの変化を示している。
1.必要な材料図。データ分析のために、（A）ツール。 （i）の24ウェルプレート、（ii）は、標準的な使い捨てのトランスファーピペット、（iii）のデュモン＃5イノックス鉗子、（iv）は、粘土で裏打ちされたペトリ皿、（v）はストレートいじめ針、（vi）のガラスピペットツール、（ト粘土で裏打ちされた料理の）滅菌、使い捨ての外科用メス（B）の準備。 （i）の直いじめ針は、粘土の水平線を描画するために使用される。 （ii）のガラスピペットツールは、各列に沿って円形の窪みを作るために使用される。 （iii）の皿は、イメージングのためにPBTが充填されている。
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アフリカツメガエルの卵の体外受精や文化で図2。 HCGの注射後（A）は 、成体アフリカツメガエルは、メスが産卵するように誘導されるツメガエル （B）卵を標準的な方法を用いて、高塩MBS収集男性から抽出された精巣で受精し、培養する。（C）胚に転送される標準的な使い捨てトランスファーピペットを用いて0.1×MBSを含む24ウェルディッシュ（D）Aに較正ピペットマン空ウェルに1ミリリットルを測定するために使用され、マーカーはすべてのウェルの外側にこのレベルを画定するために使用されを含む胚（挿入図）。 0.1×MBSは、その後追加されたり、それがこのマークと同じ高さになるように離れて撮影されている。
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イメージングのための胚の頭部の調製図。ヘッドを取り外すために必要な2つの切開の（A）図、黒い実線。スケールバー=400μmである。（B）最初の切開を外科用メスの尾放出圧力を除去するために消化管の後端に形成されている。スケールバー=400μmである。（C）は第2切開部が完全に頭を切断するために、心臓の近くに腸の前端に形成されている。スケールバー=400μmである。（D）粘土に位置する胚ヘッドの列の正面図である。スケールバー=650μmの。（E）の粘土で胚ヘッド位置の行の横方向の景色。スケールバー= 500μmのCG：セメント腺。
口腔顔面寸法4.伝統サイズ測定図。 （A） フェイス幅 。矢印は、眼の腹の部分が顔の周囲を満たすポイントを示す。赤い線は、これらの点の間の距離として測定歯幅、である。スケールバー=210μmの。（B）の 顔の高さ。白いラインが目の背側エッジとセメント腺の背側縁部で測定前に描かれたガイドです。赤い線は顔の正中線でのこれら2ガイドの間の距離として測定された顔の高さ、である。スケールバー=210μmの。（C） 口腔顔面領域です。白の線は測定前に描かれたガイドです。 （a）は、下部ガイドは、左眼の腹端を満たすポイント。赤い線は、左眼の周りのトレースを示しています。目の背側縁が上部ガイドを満たしている場合に（b）のポイント。青い線は、目の背側縁部でトップガイドに沿ってトレースされた口腔顔面領域の背側の境界を示している。トップガイドは右の顔の周囲を満たす（c）のポイント。緑色のラインショー右目の周りにトレース。右眼の腹側縁が下部ガイドを満たしている場合（d）は、ポイント。黄色の線は、セメント腺の背側縁部における下部ガイドに沿ってトレースし、口腔顔面領域の腹側の境界を示している。スケールバー=210μmの。（D） スナウトの長さ。白い線が眼の前縁で、測定前にガイドとして描かれている。赤い線はこのラインからセメント腺の背側縁が顔の横方向の周囲を満たす点まで測定された、鼻の長さです。 =300μMのスケールバー。（E） 口幅。矢印は、背側と腹側の唇が会うポイントです。赤い線は、これらの2点間の距離として測定さ口幅である。スケールバー=200μmである。（F） 口の丸み 。口の開口部の周囲をトレースし、赤色で示されている。 CG：セメント腺。スケールバー=200μmである。
図5.幾何学的形態計測分析のためのランドマークと予選をキャプチャする。 （A）のランドマークを配置し、座標を捕捉する写真編集ソフトウェアや表計算プログラムを使用する。 （i）の多色十字は口腔顔面領域の形状を表現するためにはImageJにおける追加ポイントツールを使用して、画像上に配置目印である。 （ⅱ）ランドマークデータが表示結果ツールを使用して表示されます。 （ⅲ）ランドマークデータをコピーしてスプレッドシートに貼り付けられます。第二列の上にランドマークの数を特定し、「LM = 24 "（赤いボックス）で示されるヘッダがある。データの2番目の列の下には、サンプルは、固有の名前を与えられ、「ID = CON1 "（赤い矢印）で示される。これは、サンプルセット内のすべての画像に対して繰り返され、データはテキストファイルとして保存されている。幾何学的形態計測SOFTWにおける（B）予備的なデータ分析プログラムです。 （ⅰ）写真編集ソフトウェアから作成したテキストファイルは、TPSファイルとして、形態計測プログラム、MorphoJにインポートされます。ファイルは、赤い矢印で示されている。 （ⅱ）ランドマーク座標データが主軸によってクラステス嵌めによって整列されている。赤い矢印は、アラインメントの実行を示す。 （ⅲ）プロクラステスフィットランドマークの共分散行列は前置きメニューに生成されます。 （iv）の分類子ファイルは、スプレッドシート内に作成される。列AとBは、それぞれ、ヘッダ「ID」と「TREATMENT」を与えられている。 IDのランドマークデータコレクション内の各試料に与えられ、列Aの下に入力され、各サンプルが属する治療群は、列Bの入力分類子変数が設定され、 マッチしたように（v）の分類子ファイルは、形態計測プログラムにインポートされている識別子によって選択されたデータセットのために。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてくださいこの図。
形態計測ソフトウェア6.統計解析図。 （A）の主成分分析（PCA）は、（i）PCAはバリエーションタブから選択される。 （ⅱ）プロクラステスのランドマークの最初の二つの主成分は、PCのスコア ] タブで散布として表示されます。 （ⅲ）ポップアップメニューがプロットスペースで育てている。このメニューは、互いに（赤矢印）に対してプロットされている主要なコンポーネントを変更し、（青色で強調）のデータ点を色付けするために使用される。 （iv）のデータ点は、ポップアップメニューの分類子の変数に応じて着色される。各主成分によって捕獲分散の（v）の割合は、[結果 ] タブで表示されている。（B）の判別関数分析（DFA）（ⅰ）DFAは 、 比較タブから選択される。 （ii）のプロクラステス座標のデータセットは、DFAのために選択され、以前にアップロードされた分類器は、グループのために選択される。比較されるべき所望のグループが選択され、順列試験を実行している。 （ⅲ）DFA結果は、 形状差異タブにおけるベクトルマップとして表示されます。プロット空間内のポップアップメニューは画像を正しく配向するために使用することができる。 （iv）は、ポップアップメニューの設定スケールファクタタブを選択することによって、スケール係数の符号を変化させることができる。 （v）は、ベクトルマップは、ベクトルマップのポップアップメニューで、 グラフの種類を変更して選択して、グリッド線の所望の数の変換グリッドに変更される。 （vi）のマハラノビスとプロクラステス距離と対応するp値は、[結果 ] タブの下で見ている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
アフリカツメガエルは、発達のメカニズム基礎口腔顔面開発を解剖するための有用なツールとなっています。しかし、カエルは、この領域の大きさや形状変化を記述するないプロトコルは現在ありません。ここで説明する方法では、アフリカツメガエルや他の脊椎動物における口腔顔面の表現型のより厳密な定量化を可能にすることによって口腔顔面開発の分野に大きく貢献していきます。
適切にこのプロトコルを実行する最初の、最も重要な側面は、顔の寸法を測定し、両方を正確かつ再現ランドマークの配置を決定する能力である。このためには、胚性面が同じ角度、方向の倍率で撮影されることが重要である。それが横方向に胚を操作し、一貫性のある配置を達成することは困難であるように、特に注意が、鼻の長さの正確な測定値を得るように注意しなければならない。一人の人間がS上のすべての測定を実行持つ結果の再現性を最大化しながら、AME日は、この種のエラーを最小限に抑えます。良好な結果を確保する二番目に重要な側面は、そのような発達の違いや遺伝的背景として、不必要な変動性の減少である。微妙な欠陥との間の統計的有意性を評価する際に特に重要である。胚は、従って、処理され、撮影時と同じステージである必要がある。また、ケアは発達率は治療群間との間で同等であることを確認するために注意する必要があります。変動性でこのような問題を減少させるために、すべての胚は同じ親からであり、実験開始時に一致した段階であることを確認してください。また、（例えば、混雑を防止するため）培養皿に、異なるバッファ源とボリューム、胚の異なる数、及び分布などの変動の外部ソースを減らす。
幾何学的形態計測を通して形状変化の評価における重要なステップはalignmenですランドマークのtはプロクラステスフィットを経由して調整します。この数学的アルゴリズムを適用することによって、サイズや画像の回転の違いに関する情報が削除される。その後生成された共分散行列は、ランドマークの標準化されていないような相関が主成分や判別関数analyses-などの統計techniques-を行うことができる多変量するデータセット内のすべての胚のうち、座標を決定する。
主成分分析（PCA）は、主成分26と呼ばれる変数の小さい集合に複雑なサンプルを低減します。第一成分が残りを占める各後続のコンポーネントに、サンプルセット内の最も差異を占める。使用して互いに形態計測ソフトウェアに対する最初の二つの成分、一緒にクラスタ最も類似したサンプルをプロットすることによって。同時にその中の変化を判定しながらこのように、PCAは、サンプルセット内のグループを識別する。ソム中電子ケースは、グループは、互いに明確に区別することのいずれかまたは両方の軸に沿って重ならない。この場合には、グループが判別されることにより、微細な特徴を明らかにするために、他の成分（例えば、PC3）をプロットすることが有利である。総分散がより均等に最初のいくつかの変数の間に分散される場合に特に適切である。
プロクラステスフィットデータの判別分析（DFA）は、データセット内のサンプルは、それらを効果的に定義する連続変数によってグループに区別されるかどうかを決定します。サンプルは、したがって、分析前のグループに分類され、変数はグループ27間の統計的関係を決定する差別関数と呼ばコンポーネントに換算されている。この分析を実行する前に、順列検定の数を示すために重要である。これらの順列テストは、その分布についての仮定がeliminaであるように、データをランダム化テッド。以上の並べ替え検定の反復は、p値の精度を高める。変態グリッドとして視覚化した場合、グループ間のランドマーク位置の大幅な変更が表示され、比較される。形状変化が発生する場所、さらに、グリッドの反りパターンが明らかになった。この分析の欠点は、それが2つのグループの比較のために利用できることである。比較のためのサンプルセットに3つ以上のグループがある場合には、正準変量分析を実行した方がよい。これは、統計的なp値を生成するという点でDFAに類似している。しかし、それは、そのセット内の個々のグループの間で発生するものに加えて設定され、サンプル全体にわたって起こる変化を示している。
この顔面定量プロトコルの主な制限は、それが唯一の二次元データに適用することができることである。今後の目標は、三次元データの分析のための同様の方法を開発するためにCTスキャンまたは共焦点顕微鏡を使用することを含む。一方、二次元画像を扱うことも、このプロトコルの主な強みの一つです。カメラを装備し、基本的なステレオスコープは、胚の顔の画像を取り込むために必要とされる。コストを低減しつつ、このデータ分析に利用Openwareはまた、この方法のアクセシビリティを増大させる。さらに、sophisticalイメージング、統計分析、またはコンピュータプログラミングの高度な知識は、データから意味のある、重要な結果を抽出するために必要とされていません。実際に、この技術は、現在、生物学VCU部門の学部の実験室コースの一部として教えられている。したがって、ここに提示顔面定量化プロトコルが学習し、短時間に適用することは容易である。映像表現として、そのようなソフトウェアを胚を配置し、ナビゲートするなどの重要なステップが成功しても、訓練を受けていない学生や研究者が利用可能なプロトコルを確実にするために強調されている。要約すると、このプロトコルは、貴重な資源を提供する研究コミュニティのためにと教育ツールとして。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
VCUからA·ディキンソンのスタートアップ資金がこの作品を支持した。
著者は、概略図を作成する際に、彼の芸術的才能のためのダンNacuを認識したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm x 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15 °C or 20 °C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co. | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
References
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