Summary
Метод количественного определения орофациальная размер и форму эмбрионов Xenopus Laevis была разработана. В этом протоколе, традиционные измерения размеров в сочетании с геометрической морфометрии, чтобы обеспечить более сложных анализов орофациального развития и дефектов.
Abstract
Xenopus стала важным инструментом для вскрытия механизмов, регулирующих черепно-лицевого развития и дефекты. Метод количественной орофациальная развитие позволит более тщательного анализа орофациальных фенотипов при отмене с веществами, которые могут генетически или молекулярно манипулировать экспрессию гена или функцию белка. Использование двухмерных изображений эмбриональных руководителей, традиционные размеры-такие размеры как орофациалъная ширине, высоте и региональное измеряются. Кроме того, округлость мера эмбриональной открывания рта используется для описания формы полости рта. Геометрической морфометрии этих двух одномерных изображений также выполняется для обеспечения более сложный вид изменений в форме орофациального области. Достопримечательности присваиваются определенные точки в орофациалъная области и координаты создаются. Принцип анализа компонент используется для снижения ориентиров координаты на основных компонентов, которые затем являются дискриминационными лечениегруппы. Эти результаты отображаются в виде диаграммы рассеяния, в которых люди с подобными орофациальных форм кластерного вместе. Это также полезно, чтобы выполнить дискриминантный анализ, который статистически сравнивает позиции ориентиров между двумя группами лечения. Этот анализ отображается на сетке, где преобразования изменения в положении знакового рассматриваются как векторы. Сетка накладывается на этих векторов, так что отображается картина деформации, чтобы показать, где значительные позиции ориентир изменились. Изменяет свою форму в анализе дискриминантной функции основаны на статистической мерой, и, следовательно, может быть оценена с помощью р-значение. Этот анализ является простым и доступным, требуя только стереоскоп и бесплатным программным обеспечением, и, таким образом, будет ценным исследовательским и учебным ресурсом.
Introduction
Среди наиболее распространенных и разрушительных видов врожденных дефектов человека являются те, которые затрагивают рот и лицо, такие, как орофациальных расщелин 1. Дети с пороками развития орофациальных структур пройти несколько операций на протяжении всей их жизни, и бороться с лица уродствами, речи, слуха и проблемами питания. Поэтому, облегчая новые исследования в черепно-и орофациалъная развития имеет первостепенное значение для профилактики и лечения этих видов врожденных дефектов у человека. Xenopus Laevis появился как новый инструмент для рассечения механизмы, регулирующие черепно-лицевого развития (некоторые примеры включают 2,3,4 -11). Таким образом, количественный метод для анализа размера и формы изменения в процессе развития головы и лица этого вида может быть очень мощным 3.
Здесь мы представляем такой метод; сочетая традиционные измерения размера с геометрической морфометрии, адаптированных из исследования Xenopus 12 13-15. Цель этого протокола является предоставление исследователям количественно размер лица и фигуры различать орофациальных фенотипов при нормальной и аномальной развития. Этот анализ позволит лучше дифференциации между тонкими черепно-лицевых дефектов, таких как те, что возникают из синергетических эффектов генов и / или экологических факторов. Кроме того, этот метод количественного определения может также выявить даже незначительное улучшение или спасение в орофациалъная дефекта. Это, следовательно, делает его полезным руководством при анализе потенциальных терапевтических.
Сочетание измерений лица и геометрической морфометрии, которые мы представляем здесь позволяет применять более комплексный статистический анализ и по размеру и форме орофациалъная регионе, чем в настоящее время протоколов, которые в значительной степени использовать только один или другой 15-18. Кроме того, мы представляем простой способ оценить как средние и боковые плоскостиЛицо, не требуя сложной трехмерной оборудования изображений, используемые в текущих исследованиях 13,19.
Покажем это протокол на Xenopus Laevis эмбрионов, обработанных ретиноевой ингибитора рецептора кислоты, что вызывает аномальные орофациальная развитие и средний нёба 2,3. Количественное определение размеров и формы орофациального области в этих эмбрионов выявил изменения в средней зоне лица, которое аналогично людей с аналогичными небных расщелин и мышиных моделях 20,21. Тем не менее, этот протокол может быть использован, чтобы оценить эффекты соединений на других орофациального развития, таких как природные вещества, гербициды, или белков, таких как факторы роста. Кроме того, орофациальная размера и формы изменения, связанные с возмущением экспрессии генов посредством потери или приобретения функциональных опытах (с использованием антисмысловых Morpholinos или Crispers / Talens) могут также быть количественно с использованием этого протокола. Наконец, мы разработали этот метод specificaLLY оценить Xenopus морфологию; Тем не менее, он легко модифицированы для анализа любого позвоночного животного. Другие приложения также могут включать в себя, используя этот протокол для сравнения близких видов для эволюционных или экологических исследованиях. Хотя пример мы предоставляем здесь использует этот протокол для описания анализ орофациалъная регионе, она может быть легко модифицирована для анализа других регионах, органов или структур.
Это орофациалъная протокол количественное станет ценным ресурсом для научного сообщества, а также отличным инструментом обучения для студентов в качестве демонстрации видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, проведенные с использованием Xenopus Laevis были одобрены IACUC (протокол # AD20261).
1. Подготовка и реагентов Необходимые материалы
- Реагенты:
- Сделайте 1 л 10х MBS (Modified засоленных Барта) решения 22. Добавить NaCl (880 мМ), KCl (10 мМ), MgSO 4 (10 мм), HEPES (50 мМ, рН 7,8), и NaHCO 3 (25 мм) до 1 л дистиллированной воды. Отрегулируйте рН до 7,8 с помощью NaOH.
- Сделать 1 л 1x MBS разбавлением 100 мл 10х MBS раствора в 900 мл дистиллированной воды. Добавить 0,7 мл 1 М раствора CaCl 2.
- Сделать 1 л 0.1x MBS разбавлением 100 мл 1x MBS раствора в 900 мл дистиллированной воды. К 1 л раствора МБС 0.1x, добавляют 1 мл 10 мг / мл гентамицина решения для использования в культивировании эмбрионов.
- Сделать высокие MBS соль путем растворения 4 мл 5 М NaCl в 100 мл 10х MBS. Затем добавьте дистиллированной воды до общего объема не 1 Л.
- Сделать 70% этанола путем разбавления 100% Ethanol в 70% -ном этаноле с использованием дистиллированной воды.
- Сделать BMS-543 путем приготовления исходного раствора 10 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО).
- Сделать 4% параформальдегида (PFA) путем добавления 4 г параформальдегида порошка в 50 мл дистиллированной воды. Тепло на горячей плите примерно 65 ° C, после чего добавляют 5 М NaOH по каплям, пока раствор не станет прозрачным.
- Как только раствор очищает, снять с огня и добавить 50 мл 2x PBS и 100 мкл Твин-20. Дать остыть до комнатной температуры на льду. Регулировка рН до между 7,2 и 7,5 с помощью HCl.
- Сделать фосфатный буферный солевой раствор с Tween (PBT) растворением 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na 2 HPO 4 и 0,24 г KH 2 PO 4 в 800 мл дистиллированной воды. Использование HCl, доведения рН до 7,4. Добавить 2 мл Твин-20. Регулировка конечного объема дистиллированной водой до 1 л, равной
- Сделать цистеина раствора путем растворения 1 г цистеина в 50 мл дистиллированной воды или 0.1x MBS. Добавить 1,5 мл 5 М NaOH ай доведения рН до 7,8.
- Сделать 10% маточного раствора Benzocaine путем добавления 10 г порошка Benzocaine к 100 мл 100% этанола. Для эвтаназии взрослых мужчин и эмбрионов, готовых к фиксации, разбавить до 0,05% раствора.
- Сделать решение яички хранения путем добавления 1 мл сыворотки теленка к 9 мл буфера L15.
- Необходимые инструменты и оборудование:
- Получите оборудование указано в таблице материалов и оборудования, показано на рисунке 1.
- Изменить инструмент пипетки. Поместите кончик стеклянной пипетки Пастера в пламени от горелки Бунзена. Поверните наконечник пипетки, пока он не расплавится и образует округлые запечатанный конец.
- Свести глиной дно пластиковой чашке Петри, разглаживая, чтобы покрыть всю пластину (любой размер может быть использован) (рис 1Aiv).
- Слегка нажмите прямую дразнящий иглу в глиняном картонных блюдо под углом 45 °. Удерживая иглу там, и медленно перемещайте Петриблюдо горизонтально, чтобы создать подавленное линию (рис 1Bi). Повторите эти действия для нужного количества строк.
- Используйте конец инструмента стекло пипетки сделать неглубокие, круглые углубления в каждой строке глины картонных блюдо поместить головы эмбриона (рис 1Bii) и помощь в организации эмбрионов во время фотографирования.
- Для фотографии, заполнить блюдо с PBT (рис 1Biii). Между использования, тщательно промыть блюдо и глины поверхность с стерильной воде, а затем 70% -ным этанолом.
2. Xenopus Laevis культивирования эмбрионов и ингибитора Лечение
- Экстракорпоральное оплодотворение и культуры Xenopus яиц:
- Получите и культура Xenopus Laevis эмбрионов, используя стандартные опубликованные методы 22,23.
- Вкратце, усыпить взрослого мужчину погружением в 0,05% раствора Benzocaine. Проанализируйте яички и хранить в буфере яички хранения. Вводитьвзрослых женщин с хорионического гонадотропина (ХГЧ), собирать яйца в высокие MBS соли, и оплодотворить в пробирке с расчлененными яичек (2А, Б).
- Эмбрионы Культура в 0.1x MBS на 15 ° С, пока желаемый этап не будет достигнута (этап эмбрионов в соответствии с нормальной таблице Xenopus Laevis по Nieuwkoop и Фабер 24,25).
- Здесь культура эмбрионов до стадии 22 (24 ч после оплодотворения (ФВЧ)), и удалить желточной оболочки под стереомикроскопом с помощью двух пар заостренных щипцов. Эмбрионы передачи с помощью стандартного, располагаемого пипетки на чистую чашку Петри (100 мм в диаметре), содержащей 30-40 мл 0.1x MBS.
- Ингибитор лечения эмбрионов Xenopus (показано на рисунке 2):
- Заполните необходимые лунки блюдо культуры 24-а с 1 мл 0,1 x MBS, используя калиброванный пипетки-мужчину. Демаркацию вне колодца с тонкой точке отметкиэ (рис 2D, вставка). Используйте маркер, чтобы также маркировать содержимое, чтобы быть добавлены в каждую лунку на крышке чашки для культивирования 24-луночного. Скопируйте эту информацию на 24-и наладки странице в лабораторной тетради.
- Трансфер 5-10 эмбрионов в каждую лунку, используя стандартные, одноразовые пипетки (рис 2С). Поместите одинаковое количество эмбрионов в каждую лунку.
- Долить или удалить 0.1x MBS так, чтобы он на одном уровне с 1 мл отмеченные линии (рис 2D). Добавить соответствующий объем ДМСО (так, чтобы конечный объем ДМСО 1%) и осторожно циркулировать. Будьте осторожны, чтобы не добавить ДМСО слишком близко к эмбрионов, и избегать контакта эмбрионов с поверхности буфера.
- Добавить соответствующий объем химических назначенным скважин и нежно вихревой снова. Здесь, добавить 1 мкл 10 мМ BMS-453 (антагонист рецептора ретиноевой кислоты) и 9 мкл ДМСО к 1 мл 0,1 x MBS.
- Если химическая светочувствительный, свободно оберните кульра блюдо в фольге. Эмбрионы Культура в 15 ° С инкубатор до нужной стадии. В этом примере, лечить эмбрионов на 16-18 часов.
- Стиральная эмбрионов из обращения и не воспитание до головастика этапов:
- Удалите одну половину на три четверти решения с одноразовой пипетки. Будьте осторожны, чтобы не нарушить эмбрионов. Использование новой передачи пипетки, пополнить колодец с 0.1x MBS. Повторите это 3-6 раз.
- Эмбрионы Переезд в большой чашке Петри (диаметром 150 мм), содержащей 100 мл 0.1x MBS с гентамицином (1 мл / л). Выдержите эмбрионов при 15 ° С, пока не достигнут Stage 42-45 (82-100 ФВЧ).
- Измените 0.1x MBS раствор, содержащий гентамицин ежедневно, и удалить отмершие эмбрионов оперативно, чтобы предотвратить загрязнение или смерть других эмбрионов. Запишите количество погибших эмбрионов в лабораторных ноутбука.
- Крепежные эмбрионы в параформальдегиде (PFA):
- Fix эмбрионов между этапами 42 и 45 (82 и 100HPF, соответственно) путем переноса их в новую культуральную чашку 24-луночный, содержащей 1-2 мл 0,1 x MBS. Этикетка крышку с той же информацией, как лечение настройки, описанной выше (раздел 2.2.1).
- Удалить столько 0.1x MBS друг от также возможно, все еще оставляя эмбрионов, покрытые и обеспечение минимальный контакт, чтобы предотвратить травмы. Добавить 1-2 мл 0,05% раствора в Benzocaine 0.1x MBS и не инкубировать до эмбрионы больше не реагировать на раздражители.
- Добавить 1-2 мл 4% PFA. Кроме того, место эмбрионов в маркированных микропробирок для фиксации, при желании.
- Инкубируйте эмбрионов в PFA в течение 24 ч при 4 ° С на ротационном вибраторе. Удалить PFA, выполняя 3-4 стирок с PBT в течение 3-5 ч.
3. Фотографирование Орофациальные Регионом Xenopus Головастики
- Предпродажная подготовка фотография (это показано на рисунке 3):
- Поместите фиксированных эмбрионов в большой чашке Петри (150мм в диаметре), содержащий приблизительно 100 мл PBT.
- Сделайте два разреза, чтобы разорвать голову от тела (рис 3а, твердые черные линии). Во-первых, удерживать эмбрион с парой щипцов и сделать разрез на задней стороне кишечнике стерильным скальпелем (рис 3b). Сделать второй разрез на передней стороне кишечнике, около сердца, чтобы полностью удалить головку (фиг.3С).
- Внесите отрубленные головы эмбриона в глиняную картонных блюдо (часть 1.2.2), используя стандартный, одноразовые пипетки.
- Для фронтальным видом, используют две пары щипцов для позиционирования головок эмбрион задней стороной вниз внутри круглых углублений. Используя пинцет, чтобы манипулировать как голову эмбриона и окружающую глину, положение эмбрионов, таких, что они сталкиваются камеру и не наклонена назад или в сторону (рис 3D). Аккуратно надавите на окружающий глину вокруг головы, используя пинцет и / или стеклопипетки инструментом для обеспечения голову на место.
- Для боковым видом, использовать щипцы для позиционирования головок эмбриона внутри круглых углублений, такие, что они находятся на их стороне, смотрят в одном направлении, и плотно прилегали к глине. Манипулирование головку эмбриона и окружающей глину таким образом, что цементные железы всех эмбрионов, расположенную вниз под тем же углом (Рисунок 3E). Используйте строк нарисованные с дразня иглы в качестве ориентира для обеспечения точности при принятии боковые измерения.
- Захват изображений головастика голове:
- Сфотографировать глава головастика, используя любой рассекает микроскоп с прикрепленным цифровой камеры и соответствующего программного обеспечения камеры. Используйте максимальном увеличении, что может быть постоянным для всех эмбрионов.
- Сосредоточьте эмбрионов и перед ними все в том же направлении. Захват изображения с помощью лучшие условия освещения, которые позволяют для наиболее точного образа орофациалъная регионе. Положениеогни, чтобы избежать чрезмерных тени. Сохранение изображений в качестве .tiff файлы с максимально возможным разрешением.
4. Измерение и анализ для лица Размеры в Xenopus Головастики
- Измерьте Орофациальные размеры (показаны на рисунке 4):
- Определить ширину лица. Определить точки, в которых вентральной части каждого глаза встречается по периферии лица (рис 4А, стрелки), и измерить расстояние между этими точками (рис 4A, красная линия).
- Определите высоту лица. Во-первых, определить среднюю линию, измеряя расстояние между каждым глазом и расчета на полпути. Затем нарисуйте горизонтальные линии, которые отмечают спинной большинство края глаз и спинной самых точки цементной железы (рис 4В, белые линии). В средней линии, измерить расстояние между горизонтальными линиями (фиг.4В, красная линия).
- Определите тон орофациалъная область. Используйте те же горизонтальные линии разметки спинные ребра глаз и цемента железы, чтобы вести измерения площади (рис 4C, белые линии). Начало в точке, где горизонтальная линия маркировки на верхнюю часть цемента железы встречается периферию левой стороне лица (рис 4CA).
- Трассировка по краю лица не охватывающей глаз до точки, где горизонтальная линия маркировки в верхней части глаза встречает периферию лица (рис 4Cb). Продолжать проследить по этому спинной большей горизонтальной линии до точки, где она встречает периферию правой стороне лица (рис 4cc).
- Трассировка вниз вдоль края лица не охватывающей глаз до точки, в которой наиболее вентральной горизонтальная линия маркировки на верхнюю часть цемента железы встречается периферию правой стороне лица (рис 4CD). Продолжайте обводить по этому нижней горизонтальной ЕНТ линииИра она отвечает той точки, когда начал трассировка. Используйте фотографий программное обеспечение для редактирования, чтобы вычислить площадь внутри трассировки.
- Определите длину морда. На боковых изображений, сделать вертикальную линию, которая отмечает переднюю часть глаза. Далее, измерьте расстояние по горизонтали от передней большей степени, что лицо отвечает спинной край цементной железы к вертикальной линии, обозначающей переднюю часть глаза (рис 4D).
- Определить ширину рта. Измерить расстояние по горизонтали между левой и правой точек, где верхний и нижний "губы" во рту открытия встречаются (рис 4Е). Это можно было бы считать лягушка эквивалент губных спаек.
- Определить рот округлость. Рассчитать рот округлость в виде обратного соотношения сторон где (4 × [Область]) / (π × [Главная ось] 2 >).
- Используйте инструмент Lasso в фото-редактором, чтобы проследить края ротового отверстия, как показано на рисунке 4F. Выберите Проанализируйте на главной панели инструментов, и выберите Измерить. В качестве альтернативы, рассчитать округлость из измерения площади и диаметра входного отверстия.
- Анализ данных измерений лица:
- Входной измерения размеров лица в программы анализа данных, чтобы сравнить группу лечения с контролем. Определить среднее каждого измерения для обеих экспериментальных и контрольных групп для создания гистограммы. Определить стандартное отклонение для создания планки погрешностей. Выполните т-тесты Стьюдента статистически сравнивать группы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти данные могут быть весьма переменная из-за слегка разных темпах развития между эмбрионами.
- Входной измерения размеров лица в программы анализа данных, чтобы сравнить группу лечения с контролем. Определить среднее каждого измерения для обеих экспериментальных и контрольных групп для создания гистограммы. Определить стандартное отклонение для создания планки погрешностей. Выполните т-тесты Стьюдента статистически сравнивать группы.
5. Количественный анализ Орофациальные Shape и морфометрии
- Место ориентиры и CREAТе вехой координировать файл (показано на рисунке 5А).
- Выберите достопримечательности, такие, что они захватывают форму конечного изображения, и может быть повторно размещены в одной и той же относительной месте во всех анализируемых образцов. Если структура не существует во всех образцах, не ставьте ориентир на этой структуре.
- Здесь место 24 ориентиры для представления средней зоны лица с отличительных знаков, таких как глаза, ноздри, и уста. Для согласованности, место с достопримечательностями полпути между ранее размещенных ориентиров (например, достопримечательностей рта, рис 5Ai).
- Захват знаковые координаты и создать "вехой координировать файл". Откройте первое изображение головастика лица (например, первый управления эмбриона).
- Выберите вкладку Плагины на главной панели инструментов и выберите Pointpicker из выпадающего меню. Выберите закладку Добавить очки и место вехи в нужных местах, как ориентиры появятся в разноцветных крестов (
- Перемещение местоположения ориентиров после размещения, выбрав инструмент Move кресты. Когда все достопримечательности были размещены на изображения, выделите Отображать результаты Tab на главной панели инструментов и выберите Показать (рис 5Aii) для отображения знаковые координаты и скопировать в программе электронных таблиц (рис 5Aiii).
- При вставке эти координаты из этого первого эмбриона в программе электронных таблиц, оставить пустую строку выше данных. В столбце В этой пустой строке (строка 1), тип "LM =" с количеством мест в образце. Вот, введите "LM = 24", так как 24 достопримечательности были созданы (рис 5Aiii, красный ящик).
- В строке ниже точек данных, типа "ID =" с именем, идентифицирующим образец. Вот на рисунке 5Aiii, введите "ID = CON1", так как это является знаковым координировать данные первого контрольного эмбриона (рис 5Aiii, красная стрелка).
- Скопируйте все второго и третьего столбцов в текстовый документ и сохранить его в виде текстового файла.
- Выберите вкладку Плагины на главной панели инструментов и выберите Pointpicker из выпадающего меню. Выберите закладку Добавить очки и место вехи в нужных местах, как ориентиры появятся в разноцветных крестов (
- Выберите достопримечательности, такие, что они захватывают форму конечного изображения, и может быть повторно размещены в одной и той же относительной месте во всех анализируемых образцов. Если структура не существует во всех образцах, не ставьте ориентир на этой структуре.
- Настройте морфометрический программу для анализа данных (показан на рисунке 5, б).
- Здесь, выберите Создать новый набор данных в главном меню в морфометрического программе. Имя файла и установленного в соответствующих полях данных (например, "ретиноевой кислоты Торможение" и "ориентиры для лица", соответственно) во всплывающем окне (рис 5Bi). Импорт файла как TPS, и SELЭСТ текстовый файл с координатами для создания набора данных (рис 5Bi, красная стрелка).
- Выравнивание и Прокруст данных подходят:
- Выполните Прокруста посадку и выравнивание. Выделите установленные на вкладке дерева проекта данные, выбрать Предварительные на главной панели инструментов, и Нью-Прокруст Fit в выпадающем меню.
- Выберите Выровнять по главной оси и выберите Выполнить Прокруста Fit в нижней части окна (Рис 5Bii, красная стрелка). Вернуться в отборочных выпадающее меню, выберите Создать ковариационную матрицу (рис 5Biii), и выберите Выполнить.
- Просмотр корреляции ковариационная матрица на вкладке Результаты.
- Создание "классификатора файл", назначив каждый образец в установленных для соответствующей переменной классификатора данных различать, принадлежит ли она в экспериментальной группе или в контрольной группе.
- Этикетка две колонки в таблице. Этикетка заголовок первого Columн с "ID" и вход и тот же идентификатор, присвоенный для каждого образца (например, CON1, RARINHIB1, и так далее; Рисунок 5Biv). Этикетка заголовок второго столбца с "лечение" и вход в каждую ячейку группу лечения, который соответствует образцу, указанному в соседнем ID ячейки.
- Здесь, использовать «контроль и RAR ингибитор" метки как классификаторов (рис 5Biv). Скопируйте в текстовый файл и сохранить как файл с расширением .txt. Импорт классификатора переменные в морфометрического программе. Выберите матч с идентификатором, и открыть текстовый файл (рис 5BV).
- Создать анализ главных компонент (PCA) точечный график, выбрав в раскрывающемся меню вариации и выборе главных компонент (рис 6Ai). Далее, выберите вкладку Графика, чтобы увидеть еще три вкладки: меняет форму PC, собственные значения, и множество ПК (рис 6Aii). Вкладка баллы ПК отображает бivariate главных компонент разброс подгонки данных знаковых Прокруста (рис 6Aii).
- Для изменения, которые главные компоненты нанесены, воспитывать всплывающее меню в участок пространства и выбрать необходимую ось изменить (рис 6Aiii, красная стрелка).
- Выберите Очки инструмент Color Data (рис 6Aiii). Выберите классификаторы ранее импортированных (раздел 5.2.2) во втором всплывающем меню, которое появляется, чтобы определить цвет каждой категории (рис 6Aiv).
- Просмотр объема дисперсии захваченного каждого основного компонента во вкладке Results (рис 6AV). Экспорт график в виде файла .bmp.
- Создать дискриминантный анализ (DFA) преобразование сетки в морфометрического программе, выбрав дискриминантный анализ на вкладке сопоставлений (рис 6Bi). В контекстном меню, убедитесь, что соответствующая набор данных сельected и тип данных является Прокруст посадкой координаты.
- Выделите пары групп в сравнении, и запустить 1000 перестановок тестов (рис 6Bii).
- Под Graphics, просматривать векторную карту координат на вкладке Shape Разница (рис 6Biii). Если изображение переворачивается, воспитывать всплывающее меню в участок пространства, чтобы перевернуть схему в правильной ориентации (рис 6Biii).
- Направление векторов отражает разницу формы из первой группы по сравнению со вторым, который отображается в дискриминантной функции меню перед запуском анализа (рис 6Bii). Чтобы изменить направление векторов, воспитывать всплывающее меню в участок пространства и изменить знак масштабного фактора, так что он отрицательный (рис 6Biii, внутривенно). Значение шкалы установлен в десять раз, что наилучшим образом представляет статистические различия в эпохальном позиции betweeн две группы без искажений, и, как правило, оставить значения по умолчанию (рис 6Biv).
- Кроме того, в всплывающем меню, изменить график в сетку трансформации наложить векторы на сетку (рис 6Biii, v).
- Укажите количество горизонтальных и вертикальных линий сетки в всплывающем меню (рис 6Biii, v).
- Экспорт график как .bmp файла.
- Просмотр расстояния Прокруста и Mahalinobis и р-значения на вкладке Results (рис 6Bvi).
- Дополнительные анализы морфометрические, которые являются полезными для оценки более чем одной группе лечения
- Создать анализа главных компонент трансформации сетки. PC Форма Изменяет вкладке отображается векторную карту изменения формы учета для дисперсии внутри каждой группы образцов. Используйте всплывающее меню в области построения ориентировать изображение правильно и наложить векторы на сетку трансформации. Установите масштабный коэффициентк значению по оси х очков ПК графика, который соответствует расчетной центре контрольной группе. Экспорт изображения в виде .bmp файла.
- Создать CVA разброс. На вкладке Сравнение на главной панели инструментов, выберите Canonical варьировать анализа, и выделить классификатора набор переменных, который ранее был импортный (см раздел 5.2.3). Выберите 1000 итераций для перестановок испытаний, и выберите Выполнить. Выберите вкладку забивает CV для просмотра двумерного CVA разброс. Это цветами в зависимости от загруженных классификаторов. Изменение цветовой схемы по воспитанию всплывающее меню в участок пространства (см раздел 5.3.3). Экспорт в виде файла .bmp.
- Создать сетку трансформации CVA. Преобразование сетки из результатов CVA могут быть сгенерированы при сравнении более двух групп. На вкладке Graphics, выбрать изменения CV Shape визуализировать преобразования сетку координат знаковых. Вызовите всплывающее меню в участок пространства, чтобы изменитьНаправление вектора, наложить результаты на сетку трансформации, и указать количество линий сетки. Экспорт график как .bmp файла.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь, количественный анализ орофациального размера и формы была продемонстрирована для сравнения эмбрионов, обработанных ингибитором рецептора ретиноевой кислоты (RAR) ингибитора с необработанным контролем. Эмбрионы были обработаны концентрации 1 мкМ этого химического ингибитора от стадии 24 до 30 (26-35 часов после оплодотворения), вымываются, и фиксируется на этапе 42 (82 часов после оплодотворения). Затем они были обработаны и проанализированы, как описано в протоколе. Результаты исходные данные, но согласуется с наблюдениями в предыдущих публикациях 2,3. Контрольных эмбрионов были обработаны с использованием транспортного средства, ДМСО, и развивались нормально (рис 7Ai, II). Эмбрионы обработанные концентрации 1 мкМ ингибитора RAR показали незначительное сужение лица, глаз аномалий, и уродливый эмбриональных рот открывать, что было больше треугольной формы (рис 7Aiii, внутривенно).
Во-первых, традиционные орофациальная размеры были измерены и приведены в фиг.7В. S tatistical значимость определяли, выполняя Т-теста Стьюдента предполагая неравные вероятности между ингибитором обработанных эмбрионов и управления для каждого измерения. Мы обнаружили, что оба длина рыла и ширина лица были значительно снизилась в ингибитора лечение RAR эмбрионов по сравнению с контрольной группой (р-значения = 0,0062 и 0,0058, соответственно; рис 7Bi, б). В то время как высота лица и рот округлость была значительно увеличена (п-значения = 3,7772 × 10 -6, 1,4812 х 10 -7), ширина рта значительно снизилась (р-величина = 2,5175 × 10 -10; Рисунок 7Biii-V) .Отель Результаты не показали существенной разницы в общей орофациалъная области между двумя группами (р-значение = 0,3754; рис 7Bvi). Эти данные показывают, что потеря сигнализации ретиноевой кислоты в определенное время в результатах развития в более короткие морды, небольшое сужение области средней зоны лица, и порок развития эмбрионального ротового отверстия.
нт "> Для обеспечения сложный вид изменения формы эмбрионального орофациалъная регионе в ответ на снижение сигналов ретиноевой кислоты, мы рядом используются геометрические морфометрический анализы. После определения и согласования Орофациальные ориентиры с помощью программного обеспечения для анализа морфометрических, мы затем исследовали дисперсию в каждом Группа помощью анализа главных (PCA) компонента. Когда первые две главные компоненты были нанесены друг на друга, ингибитор RAR обработанных эмбрионов были четко отделены от контрольных вдоль оси ПК1 (Рисунок 7с). Этот тест также показал выбросы в образце комплекте- иллюстрируется двумя ингибиторов лечение эмбрионов, что не кластера с остальной частью группы (рис 7С, стрелки).Далее, статистические различия в форме орофациального области между ингибиторов обрабатывают RAR эмбрионов и контроля были оценены и визуализировали путем выполнения дискриминантный анализ (DFA). Прокруст расстояние бetween две группы значительно отличалось (расстояние = 0,2665, р-значение <0,0001, рис 7D), что указывает на изменение в форме орофациального, когда нарушается передача сигналов ретиноевой кислоты. Действительно, драматические сдвиги в положении боковых ориентиров в орофациалъная регионе указывают на сужение формы лица соответствующего высоте в ингибитора обработанных эмбрионов (рис 7D). Кроме того, небольшое внешнее изменение позиции носовых ориентиров (рис 7D, стрелки) показывает ненормальность в положении ноздрю в этих эмбрионов, что согласуется с уменьшением вырост морды. Сдвиги в ориентиров, которые определяют края ротового отверстия изменений шоу положения, которые отражают формирование треугольной формы рта открытия, который согласуется с медианной щель сообщается в наших предыдущих исследованиях 2,3. В дополнение к векторных сдвигов, деформации образец сетки трансформации также иллюстрирует изменения формы в илиofacial область. Искривление в регионе средней зоны лица согласуется с средней зоны лица гипоплазии и общей сужения лица видели в эмбрионах с уменьшением сигналов ретиноевой кислоты (рис 7D).
Результаты анализа дискриминантных функций (DFA) показать изменения формы, которые согласуются с нашей качественного анализа, а также раскрывающие некоторые изменения, которые не были должным образом захваченные традиционных измерений размеров в одиночку. Например, в то время как орофациалъная площадь существенно не отличается от управления и ингибитор лечение эмбрионов (рис 7Bvi), преобразование сетки DFA показали значительные изменения в этой области в соответствии с лицевого сужения видели в ингибитора обработанных эмбрионов (рис 7А, D). Кроме того, сновать картины и знаковые сдвиги ротового отверстия, в сочетании с существенным изменением мы видели в рот округлости, иллюстрируют порок развития рот открытия форму в ингибитора лечение ЭмбриОС. Таким образом, сочетание традиционных измерений лицевых размеров и геометрической анализа морфометрического иллюстрирует изменения в форме и размеру орофациального области, когда сигналы ретиноевой кислоты, нарушается.
Рисунок 1. Необходимые материалы. (A) Инструменты для анализа данных. (Я) 24-луночного планшета, (б) стандартный сменный передачи пипетки, (III) Дюмон # 5 Inox пинцет, (IV) глина картонных Петри, (v) прямо дразня иглы, (VI) стекло инструмент пипетка, (VII ) стерильные, одноразовые скальпель. (Б) Получение глины картонных блюдо. (Я) прямо дразня игла используется для рисования горизонтальных линий в глине. (II) инструмент пипетка стекло используется, чтобы сделать круговые впадины вдоль каждой строки. (III) блюдо наполнен PBT для визуализации.
страница = "всегда"> 
Рисунок 2. Экстракорпоральное оплодотворение и культуры Xenopus яиц. (А) После инъекции HCG, взрослый Xenopus Laevis самки индуцируются, чтобы отложить яйца. (B) Яйца собирают в высоких MBS соли, удобряли, извлеченных из семенников самца, и культивировали с использованием стандартных методов (C) Эмбрионы переносятся в. 24-а блюдо, содержащее 0.1x MBS, используя стандартные, одноразовые пипетки. (D) откалиброваны пипетка-человек используется для измерения 1 мл в пустой хорошо, и маркер используется для разграничения этого уровня на внешней всех скважин содержащие эмбрионы (вставка). 0,1 x МБС затем добавляют или отводится таким образом, чтобы она на одном уровне с этой отметке.
highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 3. Подготовка руководителей эмбрионов для визуализации. (А) Схема из двух разрезов, необходимых для удаления головы, твердые черные линии. Шкала бар = 400 мкм. (B) Первый разрез делается на заднем конце кишечнике удалить хвост и сбросьте давление с скальпеля. Шкала бар = 400 мкм. (С) второй разрез сделан на переднем конце кишечнике, около сердца, чтобы полностью отделить голову. Шкала бар = 400 мкм. (D) прямой вид ряда эмбрионов руководителей расположенных в глине. Шкала бар = 650 мкм. (E) Боковые виды подряд глав эмбрион позиции в глине. Шкала бар = 500 мкм CG: цемент железы.
Рисунок 4. Традиционные измерения размерам орофациальных размеров. (А) ширина лица. Стрелки указывают точки, где брюшной части глаза встречается периферию лице. Красная линия ширины лица, измеренная как расстояние между этими точками. Шкала бар = 210 мкМ. (B) Лицо Высота. Белые линии гиды нарисованные перед измерением на спинном краю глаз и спинной краю цемента железы. Красная линия является высота лица, измеряется как расстояние между этими двумя направляющими на средней линии лица. Шкала бар = 210 мкМ. (C) Орофациальные область. Белые линии гиды нарисованные перед измерением. (А) Укажите, где дно руководство отвечает нижнему краю левого глаза. Красная линия показывает обведите левого глаза. (Б) точка, где спинной край глаза встречает верхнюю направляющую. Синяя линия показывает спинной границу орофациалъная области, прослеживается вдоль верхней направляющей в дорсальном глаз. (В) точки, в которой верхняя направляющая встречает свою периферию лица. Зеленые шоу линииТрассировка вокруг правого глаза. (D) точка, где нижним краем правого глаза отвечает нижнюю направляющую. Желтая линия показывает вентральной границы орофациалъная области, прослеживается вдоль нижней направляющей на дорсальном крае цементный железы. Шкала бар = 210 мкМ. (D) Длина рыла. Белая линия является передний край глаза и рисуется в качестве руководства перед измерением. Красная линия является длина рыла, измеряется от этой линии до точки, где спинной край цементной железы встречается боковое периферию лице. Шкала бар = 300 мкМ. (E) Рот ширина. Стрелки являются точки, в которых спинной и брюшные губы встречаются. Красная линия ширина рта, измеренная как расстояние между этими двумя точками. Шкала бар = 200 мкм. (F) Рот округлость. Периметр входного отверстия прослеживается и показаны красным цветом. CG: цемент железы. Шкала бар = 200 мкм.
Рисунок 5. Захват ориентиры и предварительные для геометрического анализа морфометрического. (A), используя фото-программное обеспечение для редактирования и программы электронных таблиц для размещения ориентиры и координаты захвата. (I) Разноцветные кресты являются вехами, размещенные на изображении, используя инструмент добавления точек в ImageJ представлять форму орофациалъная регионе. (Б) Ориентир данные отображаются с помощью инструмента отображения результатов. (III) Landmark данные скопировать и вставить в таблицу. Выше второго столбца заголовка идентификации количества ориентиров и обозначается "LM = 24" (красный коробка). Ниже второго столбца данных, выборка дается уникальное имя и обозначается «ID = CON1" (красная стрелка). Это повторяется для всех изображений в наборе образцов и данные сохраняются в виде текстового файла. (B) Предварительный анализ данных в геометрической морфометрического Программноеявляются программы. (Я) текстовый файл создан в с программным обеспечением для редактирования фотографий импортируется в морфометрического программы, MorphoJ, в виде файла TPS. Файл обозначается красной стрелкой. (Б) Ориентир координировать данные выровнены по прокрустова подгонки по главным осям. Красная стрелка указывает выполнение выравнивания. (III) ковариационная матрица Прокруста пригодных мест создается в меню предварительных переговоров. (IV) классификатор файл создается в таблице. Колонка А и В приведены заголовки "ID" и "лечение", соответственно. Дано каждого образца в сборе данных знакового являются введите номер под колонке А, и группа лечение, к которому принадлежит каждый образец вводится в столбце B. (v) файл классификатор не вводились в морфометрического программы в качестве переменной набора классификаторов и подобраны по Identifier для выбранного набора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версиюэтот показатель.
Рисунок 6. Статистический анализ в морфометрического программного обеспечения. (A) главных компонент (PCA) (я) PCA выбран на вкладке вариации. (Б) Первые две основные составляющие ориентиров Прокруста отображаются в виде диаграммы рассеяния на вкладке баллов PC. (III) во всплывающем меню воспитывается в участок пространства. Это меню используется для изменения которой основной компоненты нанесены друг на друга (красная стрелка) и раскрасить точки данных (выделены синим цветом). (IV) Точки данных окрашены в соответствии с классификатору переменных в контекстном меню. (V) Процент дисперсии захвачен каждого основного компонента рассматривается в закладке Результаты. (B) дискриминантной функции анализа (DFA) (я) DFA выбрана на вкладке сопоставлений. (б) набор данных из Прокруста координаты выбран для DFA, а ранее загруженные классификаторы выбраны для группировки. Нужные группы в сравнении выбираются и перестановок тесты. (III) результаты DFA отображаются в виде векторной карты на вкладке Shape разница. Всплывающее меню в участок пространства можно использовать, чтобы ориентировать изображение правильно. (IV) Выбрав вкладку Set Scale Factor в всплывающем меню, знак масштабного фактора могут быть изменены. (V) векторная карта меняется на сетке трансформации с желаемым количеством линий сетки, выбрав Изменить тип диаграммы в всплывающем меню векторной карте. (VI) Махаланобиса и Прокруста расстояния и соответствующие значения р просматриваются на вкладке Результаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus Laevis стала полезным инструментом для рассечения развития механизмов, лежащих орофациальная развития; Однако, есть в настоящее время нет протоколы, описывающие размер и форму изменения этого региона в лягушек. Метод, описанный здесь, будет в значительной степени способствовать области орофациалъная развития, позволяя более строгого количественного орофациальных фенотипов в Xenopus и других позвоночных.
Первый, самый важный аспект должным выполнения этого протокола является возможность измерять размеры лица и определить размещение ориентир как точно и воспроизводимо. Для этого очень важно, что эмбриональные лица сфотографироваться на тот же угол, направление и увеличения. Особое внимание должно быть принято, чтобы получить точные измерения длины рыла, как трудно манипулировать эмбрионов с боков и достижения устойчивого размещение. Имея один человек выполняет все измерения на хАм день минимизирует этот тип ошибки, в то время как максимизации воспроизводимости результатов. Второй наиболее важный аспект обеспечения хороших результатов является сокращение излишнего изменчивости, например, различия в развитии или генетического фона. Это особенно важно при оценке статистической значимости между тонкими дефектов. Эмбрионы, поэтому, нужно быть на той же стадии, когда лечение и сфотографировали. Кроме того, следует позаботиться, чтобы обеспечить темпы развития эквивалентны между и между группами лечения. Для уменьшения таких проблем с изменчивостью, убедитесь, что все эмбрионы от тех же родителей и этап соответствует в начале эксперимента. Также уменьшить внешние источники, такие как изменчивость различных источников и объемов буфера, различным количеством эмбрионов, и распределений в чашки для культивирования (например, предотвратить скученности).
Ключевым шагом в оценке изменения формы через геометрической морфометрии является alignmenт ориентир координаты через прокрустова припадке. При применении этого математического алгоритма, любая информация о размере или различий в поворота изображения удаляется. Впоследствии генерируется ковариационная матрица определяет нестандартизованные корреляции из вехой координирует среди всех эмбрионов в наборе данных, на которые многомерного статистического techniques- таких как основного компонента или дискриминантной функции analyses- могут быть выполнены.
Анализ главных компонент (PCA) уменьшает сложный образец к меньшим набором переменных, называемых основными компонентами 26. Первый компонент приходится по большей дисперсии в выборочной совокупности, с каждым последующим компонента приходится остальных. Построив первые две составляющие друг с другом с помощью морфометрического программного обеспечения, образцы, которые наиболее похожи кластер вместе. Таким образом, СПС различает группы в пределах набора образцов, в то время как одновременно определении изменения в них. В сомове случаях группы не могут быть четко отделены друг от друга и перекрывают вдоль одной или обеих осей. В этом случае, предпочтительно, чтобы построить другие компоненты (например, PC3) для того, чтобы выявить тонкие особенности, с помощью которых группы дискриминационный. Это особенно актуально, когда общая дисперсия более равномерно распределяется среди первых нескольких переменных.
Анализ функция дискриминант (DFA) из прокрустова подходят данных определяет, является ли образцы в наборе данных эффективно дискриминации в группы по непрерывных переменных, определяющих их. Образцы поэтому классифицируются на группы до анализа, а переменные переводятся в компонентах, называемых дискриминацию в функции для определения статистической связи между группами 27. До запуска этого анализа, важно указать количество перестановок испытаний. Эти перестановки тесты выборочно данные таким образом, что любые предположения о его распределении являются eliminaТед. Еще итераций тестирования перестановка повышения точности р-значения. Когда визуализируется в виде сетки трансформации, значительные изменения в положении ориентир между сравниваемых групп отображаются. Кроме того, шаблон деформации сетки показывает, где происходят изменения формы. Недостатком этого анализа состоит в том, что он может быть использован только для сравнения двух групп. Если есть три или более групп в выборочной совокупности для сравнения, то лучше выполнить канонический анализ варьировать. Это похоже на DFA в том, что он генерирует статистическую р-значение; Тем не менее, это показывает изменения, происходящие в течение всего образца, установленного в дополнение к тем, которые происходят между отдельными группами в пределах этого набора.
Основным недостатком этого орофациалъная протокола количественного является то, что он может быть применен только к двумерным данным. Наши будущие цели включают в себя использование КТ или конфокальной микроскопии разработать аналогичные методы для анализа трехмерных данных. С другой стороны,работы с двумерными изображениями также является одним из главных достоинств этого протокола. Только основные стереоскопы оснащенные камерами необходимы для захвата изображений из эмбриональной лица. Openware использованы для анализа данных также увеличивает доступность этого метода, при снижении стоимости. Кроме того, углубленные знания в области софистической изображений, статистических анализов, или компьютерного программирования не требуется извлекать осмысленные и значимые результаты из данных. На самом деле, эта техника в настоящее время преподается в рамках бакалавриата лабораторного курса в отделе VCU биологии. Таким образом, орофациалъная протокол количественное, представленные здесь, легко учиться и применять в течение короткого периода времени. В представлении видео, критические шаги, такие как позиционирование эмбрионов и навигации программное обеспечение, выделены для обеспечения протокол может быть с успехом использован даже неподготовленных студентов и исследователей. Таким образом, этот протокол обеспечит ценный ресурсдля научного сообщества и в качестве учебного пособия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Пусконаладочные деньги на А. Дикинсон из VCU поддержали эту работу.
Авторы хотели бы выразить признательность Дэну Nacu для его художественного таланта в создании схематическое изображение.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm x 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15 °C or 20 °C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co. | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
References
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
- Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
- Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
- Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
- Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
- Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
- Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
- Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
- Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
- Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
- Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
- Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
- Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
- Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. (1967).
- Nieuwkoop, P. D. aF. J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , Garland Publishing Inc. (1994).
- Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
- Hill, T. L. P. STATISTICS: Methods and Applications. , StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).
