Summary
Un método para cuantificar el tamaño orofacial y la forma de los embriones de Xenopus laevis ha sido desarrollado. En este protocolo, las mediciones de tamaño tradicionales se combinan con morfometría geométrica para permitir análisis más sofisticados de desarrollo y defectos orofacial.
Abstract
Xenopus se ha convertido en una herramienta importante para la disección de los mecanismos que rigen el desarrollo y defectos craneofaciales. Un método para cuantificar el desarrollo orofacial permitirá análisis más riguroso de fenotipos orofaciales en derogación con sustancias que genéticamente o molecularmente pueden manipular la expresión génica o la función de proteínas. El uso de dos imágenes dimensionales de las cabezas de embriones, se miden las dimensiones tradicionales de tamaño-tales como orofacial anchura, altura y zona-. Además, una medida de la redondez de la abertura de la boca embrionario se utiliza para describir la forma de la boca. Morfometría geométrica de estas dos imágenes dimensionales también se realiza para proporcionar una visión más sofisticada de los cambios en la forma de la región orofacial. Puntos de referencia se asignan a puntos específicos en la región orofacial y coordenadas se crean. Un análisis de componentes principio se utiliza para reducir coordenadas señal a los componentes principales que discriminan entonces el tratamientogrupos. Estos resultados se muestran como un gráfico de dispersión en el que los individuos con formas orofaciales similares se agrupan. También es útil para llevar a cabo un análisis de función discriminante, que compara estadísticamente las posiciones de los puntos de referencia entre dos grupos de tratamiento. Este análisis se muestra en una rejilla de transformación donde los cambios en la posición de punto de interés se consideran como vectores. Una rejilla se superpone a estos vectores a fin de que se muestra un patrón de deformación para mostrar dónde posiciones hitos significativos han cambiado. Cambios en la forma en el análisis de la función discriminante se basan en una medida estadística, y por lo tanto pueden ser evaluados por un valor de p. Este análisis es sencillo y accesible, que sólo requiere un estereoscopio y software freeware, y por lo tanto será una investigación y la enseñanza valiosa de recursos.
Introduction
Entre los tipos más frecuentes y devastadores de defectos de nacimiento en humanos son los que afectan a la boca y la cara, como hendiduras orofaciales 1. Los niños con estructuras orofaciales malformados se someten a múltiples cirugías durante toda su vida y luchan con desfiguraciones faciales, el habla, la audición y problemas de alimentación. Por lo tanto, lo que facilita una nueva investigación en el desarrollo de craneo y orofacial es de suma importancia para la prevención y el tratamiento de estos tipos de defectos de nacimiento en seres humanos. Xenopus laevis ha surgido como una nueva herramienta para la disección de los mecanismos que rigen el desarrollo craneofacial (algunos ejemplos incluyen 2,3,4 -11). Por lo tanto, un método cuantitativo para analizar los cambios de tamaño y forma durante el desarrollo de la cabeza y la cara de esta especie podría ser muy poderosa 3.
A continuación, presentamos un método de este tipo; la combinación de mediciones de tamaño tradicional con morfometría geométrica adaptados de un estudio de Xenopus 12 13-15. El objetivo de este protocolo es permitir a los investigadores para cuantificar el tamaño de la cara y las formas de distinguir entre los diferentes fenotipos orofaciales durante el desarrollo normal y anormal. Este análisis permitirá una mejor diferenciación entre los defectos craneofaciales sutiles tales como las derivadas de los efectos sinérgicos de los genes y / o factores ambientales. Además, este método de cuantificación también podría revelar incluso leve mejora o rescate de un defecto orofacial. Por lo tanto, esto hace que sea una guía útil en el análisis de productos terapéuticos potenciales.
La combinación de medidas faciales y morfometría geométrica que aquí presentamos permite un análisis estadístico más exhaustivo del tamaño y forma de la región orofacial que los protocolos actuales que utilizan en gran medida sólo uno o el otro 15-18. Además, se presenta una forma sencilla de evaluar tanto el medial y planos laterales dela cara sin necesidad de equipos de imagen tridimensional sofisticada utilizada en los estudios actuales 13,19.
Demostramos este protocolo en Xenopus laevis embriones tratados con un inhibidor del receptor del ácido retinoico que induce el desarrollo orofacial anormal y una mediana de 2,3 paladar hendido. La cuantificación de las dimensiones y la forma de la región orofacial en estos embriones han revelado cambios en el tercio medio facial que es análogo a los seres humanos con hendiduras palatinas similares y modelos de ratón 20,21. Sin embargo, este protocolo puede utilizarse para evaluar los efectos de otros compuestos sobre el desarrollo orofacial tales como sustancias naturales, herbicidas, o proteínas tales como factores de crecimiento. Además, el tamaño y forma cambia orofaciales derivados de la perturbación de la expresión génica a través de la pérdida o ganancia de experimentos de función (utilizando morfolinos antisentido o Crispers / Talens) también pueden ser cuantificados usando este protocolo. Por último, hemos desarrollado este método specificaLLY para evaluar la morfología de Xenopus; sin embargo, se puede modificar fácilmente para el análisis de cualquier vertebrado. Otras aplicaciones también podrían incluir el uso de este protocolo para la comparación de especies estrechamente relacionadas para los estudios evolutivos o ecológicos. Aunque el ejemplo que ofrecemos aquí utiliza este protocolo para describir el análisis de la región orofacial, que fácilmente podría ser modificado para el análisis de otras regiones, órganos o estructuras.
Este protocolo cuantificación orofacial se convertirá en un recurso valioso para la comunidad de investigación, así como una excelente herramienta de enseñanza para los estudiantes de pregrado como una demostración en video.
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Protocol
Todos los experimentos realizados utilizando Xenopus laevis han sido aprobados por IACUC (protocolo # AD20261).
1. Reactivos Preparación y materiales necesarios
- Reactivos:
- Hacer 1 L de 10x MBS (Modificado salinos de Barth) solución 22. Añadir NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8) y NaHCO3 (25 mM) a 1 L de agua destilada. Ajustar el pH a 7,8 con NaOH.
- Hacer 1 L de 1x MBS por dilución de 100 ml de 10x solución de MBS en 900 ml de agua destilada. Añadir 0,7 ml de solución M CaCl 2 1.
- Hacer 1 L de 0,1X MBS por dilución de 100 ml de solución 1x MBS en 900 ml de agua destilada. Para 1 L de solución de 0,1x MBS, añadir 1 ml de solución de gentamicina 10 mg / ml para su uso en el cultivo de embriones.
- Hacer MBS elevadas de sal por disolución de 4 ml de NaCl 5 M en 100 ml de 10x MBS. A continuación, añadir agua destilada hasta que el volumen total es de 1 L.
- Hacer etanol al 70% diluyendo 100% eTHANOL de etanol al 70% con agua destilada.
- Hacer BMS-543 mediante la preparación de una solución madre 10 mM en sulfóxido de dimetilo (DMSO).
- Hacer 4% de paraformaldehído (PFA) mediante la adición de 4 g de polvo de paraformaldehído a 50 ml de agua destilada. Calentar en una placa caliente a aproximadamente 65 ° C, momento en el que agregar 5 M NaOH gota a gota hasta que la solución se aclare.
- Una vez que la solución se aclara, retirar del fuego y añadir 50 ml 2x PBS y 100 l de Tween-20. Deje que se enfríe a temperatura ambiente en el hielo. Ajustar el pH a entre 7,2 y 7,5 usando HCl.
- Hacer una solución salina tamponada con fosfato con Tween (PBT) disolviendo 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, y 0,24 g de KH 2 PO 4 en 800 ml de agua destilada. Usando HCl, ajustar el pH a 7,4. Añadir 2 ml de Tween-20. Ajustar el volumen final con agua destilada a la igualdad de 1 L.
- Prepare una solución de cisteína disolviendo 1 g de cisteína en 50 ml de agua destilada o 0,1x MBS. Añadir 1,5 ml de NaOH 5 M unnd ajustar el pH a 7,8.
- Hacer una solución madre Benzocaína 10% mediante la adición de 10 g de Benzocaína polvo a 100 ml 100% EtOH. Para la eutanasia de los varones y embriones listos para la fijación de adultos, diluir a una solución al 0,05%.
- Hacer una solución de almacenamiento de los testículos mediante la adición de 1 ml de suero de ternera a 9 ml de tampón L15.
- Herramientas y equipos necesarios:
- Obtener el equipo listado en la Tabla de Materiales y Equipos, que se muestra en la Figura 1.
- Modificar una herramienta pipeta. Coloque la punta de una pipeta Pasteur de vidrio en una llama de un mechero Bunsen. Gire la punta de la pipeta hasta que se derrite y forma un extremo sellado redondeado.
- Aplanar el modelado arcilla en el fondo de una placa Petri de plástico, suavizando para cubrir toda la placa (de cualquier tamaño se puede utilizar) (Figura 1Aiv).
- Presione ligeramente una aguja burlas directamente en la cazuela de barro forradas en un ángulo de 45 °. Sostenga la aguja allí, y lentamente mover la Petrirepartir horizontalmente para crear una línea deprimida (Figura 1Bi). Repita el procedimiento para el número deseado de filas.
- Use la punta de una herramienta de pipeta de vidrio para hacer, depresiones circulares superficiales en cada fila de la cazuela de barro forradas para colocar cabezas de embriones (Figura 1Bii) y ayuda en la organización de los embriones mientras fotografiaba.
- Para la fotografía, llenar el plato con PBT (Figura 1Biii). Entre usos, lave completamente el plato y la superficie de la arcilla con agua estéril, seguido de etanol al 70%.
2. Xenopus laevis cultivo de embriones y el inhibidor Tratamientos
- La fertilización in vitro y la cultura de los huevos de Xenopus:
- Obtenga y cultura Xenopus laevis embriones utilizando métodos estándar publicado 22,23.
- En pocas palabras, la eutanasia a un hombre adulto por inmersión en una solución de benzocaína 0,05%. Diseccionar testículos y almacenar en la memoria de almacenamiento de los testículos. Inyectarhembras adultas con gonadotropina coriónica humana (HCG), recoge los huevos en MBS altos de sal, y fertilizan in vitro con testículos disecados (Figura 2A, B).
- Embriones Cultura en 0,1x MBS a 15 ° C hasta que el escenario deseado se alcanza (embriones en estadio de acuerdo a la tabla normal de Xenopus laevis por Nieuwkoop y Faber 24,25).
- Aquí, los embriones de cultivo hasta la etapa 22 (después de la fertilización de 24 horas (HPF)), y quitar la membrana vitelina bajo un microscopio estereoscópico usando dos pares de pinzas afiladas. Embriones de transferencia con un estándar, pipeta de transferencia desechable para un plato de Petri limpia (100 mm de diámetro) que contienen 30-40 ml de 0,1X MBS.
- Inhibidor de tratamientos de embriones de Xenopus (ilustradas en la Figura 2):
- Llenar los pocillos necesarios de una placa de cultivo de 24 pocillos con 1 ml de 0,1X MBS utilizando una pipeta calibrada-hombre. Demarcar el exterior del pozo con una marca de punto finoer (Figura 2D, recuadro). Use el marcador para etiquetar también los contenidos que se añaden a cada pozo de la tapa de 24 pocillos placa de cultivo. Copie esta información en una página de 24 pocillos de configuración en el cuaderno de laboratorio.
- Transferencia 5-10 embriones en cada pocillo utilizando un estándar, pipeta de transferencia desechable (Figura 2C). Coloque el mismo número de embriones en cada pocillo.
- Rellene o eliminar los MBS 0,1x para que esté a nivel con la línea marcada 1 ml (Figura 2D). Añadir el volumen apropiado de DMSO (de modo que el volumen final de DMSO es 1%) y homogeneizar suavemente. Tenga cuidado de no añadir DMSO demasiado cerca de los embriones, y evitar el contacto de los embriones con la superficie de la memoria intermedia.
- Añadir el volumen adecuado de productos químicos a los pocillos designados y agitar suavemente de nuevo. Aquí, añadir 1 l de 10 mM BMS-453 (un antagonista del receptor de ácido retinoico) y 9 l de DMSO a 1 ml de 0,1x MBS.
- Si el producto químico es sensible a la luz, sin apretar envolver el callejónplato tura en papel de aluminio. Embriones de cultivo en una incubadora a 15 ° hasta que la etapa deseada. En este ejemplo, el tratamiento de los embriones de 16 a 18 h.
- Lavarse embriones fuera del tratamiento y la crianza hasta etapas renacuajo:
- Retire de la mitad a las tres cuartas partes de la solución con una pipeta de transferencia desechable. Tenga cuidado de no molestar a los embriones. Utilizando una nueva pipeta de transferencia, vuelva a llenar el pozo con 0,1x MBS. Repita esto 3-6 veces.
- Embriones de transferencia a una gran placa de Petri (150 mm de diámetro) que contiene 100 ml de 0,1x MBS con gentamicina (1 ml / l). Incubar los embriones a 15 ° C hasta que alcanzan la etapa 42-45 (82-100 HPF).
- Cambie el MBS 0,1x solución que contiene gentamicina diariamente, y eliminar embriones muertos con prontitud para evitar la contaminación o muerte de otros embriones. Anote el número de embriones muertos en el cuaderno de laboratorio.
- Fijación embriones en paraformaldehído (PFA):
- Fijar los embriones entre las etapas 42 y 45 (82 y 100HPF, respectivamente) mediante la transferencia en una nueva placa de cultivo de 24 pocillos que contenía 1-2 ml de MBS 0,1X. Etiqueta de la tapa con la misma información que el tratamiento de configuración descrito anteriormente (apartado 2.2.1).
- Retire MBS 0,1x tanto de cada pocillo como sea posible, al mismo tiempo dejan embriones cubiertos y asegurar un contacto mínimo para evitar lesiones. Añadir 1-2 ml de solución de benzocaína 0,05% en 0,1x MBS e incubar los embriones hasta que ya no responden a los estímulos.
- Añadir 1-2 ml de PFA al 4%. Como alternativa, colocar los embriones en tubos de microcentrífuga etiquetados para la fijación, si se prefiere.
- Incubar los embriones en PFA durante 24 horas a 4 ° C en un agitador rotatorio. Retire PFA mediante la realización de 3-4 lavados con PBT durante un periodo de 3-5 horas.
3. Fotografía de la región orofacial de Xenopus renacuajos
- Preparación previa a la fotografía (esto se ilustra en la Figura 3):
- Coloque embriones fijos en una gran placa de Petri (150mm de diámetro) que contenía aproximadamente 100 ml de PBT.
- Haga dos incisiones para cortar la cabeza del cuerpo (Figura 3A, líneas negras sólidas). En primer lugar, sujetar el embrión con un par de pinzas y hacer una incisión en el lado posterior de la tripa con un bisturí estéril (Figura 3B). Hacer una segunda incisión en el lado anterior del intestino, cerca del corazón, para eliminar por completo la cabeza (Figura 3C).
- Pipeta cortó las cabezas de embriones en una cazuela de barro forradas (parte 1.2.2) utilizando un estándar, pipeta de transferencia desechable.
- Para las vistas frontales, utilizar dos pares de pinzas para posicionar las cabezas de embriones lado posterior por el interior de las depresiones circulares. Usando las pinzas para manipular tanto la cabeza del embrión y la arcilla que rodea, los embriones posición tal que los que se enfrentan la cámara y no están inclinados hacia atrás o hacia los lados (Figura 3D). Empuje suavemente la arcilla que rodea alrededor de la cabeza con unas pinzas y / o el cristalherramienta de pipeta para asegurar la cabeza en su lugar.
- Para las vistas laterales, utilizar pinzas para colocar las cabezas de embriones dentro de las depresiones circulares de manera que sean de su lado, frente a la misma dirección, y son planas contra la arcilla. Manipular la cabeza del embrión y la arcilla que rodea de manera que las glándulas de cemento de todos los embriones se colocan hacia abajo en el mismo ángulo (Figura 3E). Utilice las filas extraídas con la aguja burlas como una guía para asegurar la precisión al tomar medidas laterales.
- La captura de imágenes de la cabeza renacuajo:
- Fotografiar la cabeza del renacuajo utilizando cualquier microscopio de disección con una cámara digital conectada y el software de la cámara correspondiente. Utilice el máximo aumento que se puede mantener constante para todos los embriones.
- Centrar los embriones y se enfrentan a todos en la misma dirección. Captura de imágenes utilizando las mejores condiciones de iluminación que permiten la imagen más precisa de la región orofacial. Posiciónluces para evitar sombras excesivas. Guarde las imágenes como archivos .tiff con la mayor resolución posible.
4. Medición y Análisis Facial Tamaño Dimensiones en Xenopus renacuajos
- Medir las dimensiones orofaciales (que se resumen en la figura 4):
- Determinar el ancho de la cara. Identificar los puntos en los que la parte ventral de cada ojo se encuentra con la periferia de la cara (Figura 4A, flechas), y medir la distancia entre estos puntos (Figura 4A, línea roja).
- Determinar la altura de la cara. En primer lugar, determinar la línea media por la medición de la distancia entre cada ojo y el cálculo de la mitad del recorrido. A continuación, dibuje líneas horizontales que marcan los dorsales mayoría de los bordes de los ojos y el dorsal más puntuales de la glándula de cemento (Figura 4B, líneas blancas). En la línea media, medir la distancia entre las líneas horizontales (Figura 4B, línea roja).
- Determinar tél área orofacial. Utilice las mismas líneas horizontales que marcan los bordes dorsales de los ojos y la glándula de cemento para guiar medición de área (Figura 4C, líneas blancas). Comience en el punto donde la línea horizontal marca la parte superior de la glándula de cemento se encuentra con la periferia de la parte izquierda de la cara (Figura 4ca).
- Seguir la pista a lo largo del borde de la cara que abarca el ojo hasta el punto donde la línea horizontal marca la parte superior de los ojos se encuentra con la periferia de la cara (Figura 4BC). Continuar para rastrear a lo largo de esta línea horizontal más dorsal hasta el punto donde se encuentra con la periferia de la parte derecha de la cara (Figura 4 cc).
- Seguir la pista hacia abajo a lo largo del borde de la cara que abarca el ojo hasta el punto en que la línea más horizontal ventral marcado la parte superior de la glándula de cemento cumple con la periferia de la parte derecha de la cara (Figura 4 cd). Continuar a rastrear a lo largo de esta línea de fondo unt horizontalil se encuentra con el punto en el que comenzó el rastreo. Utilice el software de edición de fotos para calcular el área dentro del trazado.
- Determinar la longitud hocico. En las imágenes laterales, hacer una línea vertical que marca la parte anterior del ojo. A continuación, medir la distancia horizontal desde el punto más anterior donde la cara se encuentra con el borde dorsal de la glándula de cemento a la línea vertical marca el anterior del ojo (Figura 4D).
- Determinar el ancho de la boca. Medir la distancia horizontal entre los puntos izquierdo y derecho, donde los superiores e inferiores "labios" de la apertura de la boca se encuentran (Figura 4E). Estos podrían ser considerados el equivalente rana de las comisuras labiales.
- Determinar la redondez boca. Calcular boca redondez como una relación inversa aspecto donde (4 × [Área]) / (π × [Eje Mayor] 2 >).
- Utilice la herramienta Lazo en una foto-editor para trazar los bordes de la abertura de la boca, como se muestra en la Figura 4F. Seleccione Analizar en la barra de herramientas principal y seleccione Medir. Alternativamente, el cálculo de la redondez de la medición de área y el diámetro de la abertura de boca.
- Análisis de los datos de las dimensiones faciales:
- Entrada de las mediciones de las dimensiones faciales en un programa de análisis de datos para comparar el grupo de tratamiento con el control. Determinar la media de cada medición para ambos grupos experimentales y de control para crear gráficos de barras. Determinar la desviación estándar con el fin de crear barras de error. Realizar pruebas t de Student para comparar grupos estadísticamente.
NOTA: Esta información puede ser muy variable debido a las ligeras diferencias en las tasas de desarrollo entre los embriones.
- Entrada de las mediciones de las dimensiones faciales en un programa de análisis de datos para comparar el grupo de tratamiento con el control. Determinar la media de cada medición para ambos grupos experimentales y de control para crear gráficos de barras. Determinar la desviación estándar con el fin de crear barras de error. Realizar pruebas t de Student para comparar grupos estadísticamente.
5. Análisis cuantitativo de la forma Orofacial y Morfometría
- Coloque los puntos de referencia y CREAte coordinar archivo histórico (ilustrado en la Figura 5A).
- Elija puntos de referencia, que capturan la forma de la imagen de destino, y se pueden colocar en varias ocasiones en la misma ubicación relativa en todas las muestras que se analiza. Si una estructura no existe en todas las muestras, no coloque un punto de referencia en esta estructura.
- Aquí, colocar 24 puntos de referencia para representar el tercio medio facial con marcas distintivas tales como los ojos, la nariz y la boca. Para mantener la coherencia, lugar Lugares de interés a medio camino entre hitos colocados previamente (por ejemplo, la boca puntos de referencia, la figura 5ai).
- Captura de coordenadas históricas y crear "archivo histórico de coordenadas". Abrir la primera imagen de una cara de renacuajo (por ejemplo, el primer embrión de control).
- Seleccione la pestaña Plug-ins en la barra de herramientas principal y seleccione Pointpicker en el menú desplegable. Seleccione el complemento Puntos pestaña y colocar puntos de referencia en lugares deseados como puntos de referencia aparecerán como cruces multicolores (
- Mueva lugares emblemáticos después de la colocación al seleccionar la herramienta Mover cruces. Cuando todas las señales se han colocado en la imagen, seleccione la ficha Presentación de Resultados a la barra de herramientas principal y seleccione Mostrar (Figura 5Aii) para mostrar las coordenadas históricas y copiar en un programa de hoja de cálculo (Figura 5Aiii).
- Al pegar estas coordenadas de este primer embrión en un programa de hoja de cálculo, dejar una fila vacía por encima de los datos. En la columna B de esta fila vacía (fila 1), tipo "LM =" con el número de puntos de referencia de la muestra. Aquí, introduzca "LM = 24", ya 24 puntos de referencia se crearon (Figura 5Aiii, caja roja).
- En la fila de abajo los puntos de datos, tipo "ID =" con un nombre de identificación de la muestra. Aquí en la figura 5Aiii, introduzca "ID = CON1" ya que este es el punto de referencia de coordenadas de los datos del primer embrión de control (Figura 5Aiii, flecha roja).
- Copie todo la segunda y tercera columnas en un documento de texto y guardarlo como un archivo .txt.
- Seleccione la pestaña Plug-ins en la barra de herramientas principal y seleccione Pointpicker en el menú desplegable. Seleccione el complemento Puntos pestaña y colocar puntos de referencia en lugares deseados como puntos de referencia aparecerán como cruces multicolores (
- Elija puntos de referencia, que capturan la forma de la imagen de destino, y se pueden colocar en varias ocasiones en la misma ubicación relativa en todas las muestras que se analiza. Si una estructura no existe en todas las muestras, no coloque un punto de referencia en esta estructura.
- Configure el programa de software para el análisis de los datos morfométricos (ilustrado en la Figura 5B).
- Aquí, seleccione Crear nuevo conjunto de datos en el menú principal del programa de software morfométricos. Asigne un nombre al archivo y los datos que figuran en los cuadros correspondientes (por ejemplo, "ácido retinoico inhibición" y "puntos de referencia faciales", respectivamente) en la pantalla pop-up (Figura 5BI). Importe el archivo como un TPS, y select el archivo de texto de coordenadas para crear el conjunto de datos (Figura 5BI, flecha roja).
- La alineación de datos y Procusto encajan:
- Realizar un ajuste Procusto y la alineación. Resaltar los datos que figuran en la ficha Árbol de proyectos, elija Preliminares en la barra de herramientas principal, y Nueva Procusto Fit en el menú desplegable.
- Elija Alinear por la Directora Eje y seleccione Realizar Procusto Fit en la parte inferior de la caja (Figura 5Bii, flecha roja). Vuelta a la Preliminares en el menú desplegable, seleccione Generar matriz de covarianza (Figura 5Biii), y seleccione Ejecutar.
- Ver las correlaciones de la matriz de covarianza en la pestaña Resultados.
- Crear un "archivo clasificador" mediante la asignación de cada muestra en el conjunto de datos a la variable clasificador apropiado distinguir si pertenece en el grupo experimental o al grupo control.
- Etiquetar dos columnas en una hoja de cálculo. Etiquetar el encabezado de la primera column con "ID" y la entrada del mismo ID determinado para cada muestra (por ejemplo, CON1, RARINHIB1, y así sucesivamente; Figura 5Biv). Etiqueta de la cabecera de la segunda columna con "tratamiento" y la entrada dentro de cada celda el grupo de tratamiento que corresponde a la de ejemplo que aparece en la celda ID adyacente.
- En este caso, utilizar las etiquetas de "control y RAR INHIBIDOR" como clasificadores (Figura 5Biv). Copie en un archivo de texto y guardarlo como un archivo .txt. Variables Importación clasificador en el programa de software morfométricos. Elige Partido por identificador, y abrir el archivo de texto (Figura 5Bv).
- Crear un análisis de componentes principales (ACP) diagrama de dispersión seleccionando el menú desplegable Variación y la elección de Análisis de Componentes Principales (Figura 6AI). A continuación, seleccione la ficha Gráficos para ver tres pestañas adicionales: cambios en la forma de PC, valores propios, y las puntuaciones de PC (Figura 6Aii). La ficha puntuaciones PC muestra el bivariate director de dispersión componente de los datos emblemáticos aptos Procusto (Figura 6Aii).
- Para cambiar el que se representan los componentes principales, abrir el menú emergente en el espacio de parcela y seleccionar el eje deseado para cambiar (Figura 6Aiii, flecha roja).
- Seleccione la herramienta Puntos de datos de color (Figura 6Aiii). Seleccione clasificadores importados previamente (Sección 5.2.2) en el segundo menú emergente que aparece para determinar el color de cada categoría (Figura 6Aiv).
- Ver la cantidad de varianza capturada por cada componente principal en la pestaña Resultados (Figura 6AV). Gráfico Exportar como un archivo .bmp.
- Crear un análisis de la función discriminante (DFA) de rejilla de transformación en el programa de software morfométricos eligiendo Análisis de función discriminante en la ficha Comparación (Figura 6BI). En el menú emergente, asegúrese de que el conjunto de datos adecuado es seleja y el tipo de datos es las coordenadas Procusto-fit.
- Resaltar los pares de grupos que deben compararse, y ejecutar 1.000 pruebas de permutación (Figura 6Bii).
- En Gráficos, ver el mapa del vector de las coordenadas en la pestaña Diferencia Forma (Figura 6Biii). Si se invierte la imagen, abrir el menú emergente en el espacio complot para darle la vuelta al diagrama en la orientación correcta (Figura 6Biii).
- La dirección de los vectores de forma refleja la diferencia del primer grupo en comparación con el segundo, que se muestra en el menú de funciones discriminante antes de ejecutar el análisis (Figura 6Bii). Para invertir la dirección de los vectores, que aparezca el menú emergente en el espacio de parcela y cambiar el signo del factor de escala por lo que es negativo (Figura 6Biii, iv). El valor del valor de la escala se establece en un factor de diez que mejor representa las diferencias estadísticas en posición hito between los dos grupos sin distorsión, y se suele dejar en el valor predeterminado (Figura 6Biv).
- También en el menú emergente, cambiar el gráfico a una rejilla de transformación para superponer los vectores sobre una rejilla (Figura 6Biii, v).
- Especifique el número de líneas horizontales y verticales de la cuadrícula en el menú emergente (Figura 6Biii, v).
- Exportar el gráfico como un archivo .bmp.
- Ver las distancias Procusto y Mahalinobis y los valores de p en la ficha Resultados (Figura 6Bvi).
- Análisis adicionales morfométricos que son útiles para la evaluación de más de un grupo de tratamiento
- Crear una red de transformación análisis de componentes principales. La Forma PC Cambia ficha muestra el mapa vectorial de cambios en la forma que representan la variación dentro de cada grupo de muestra. Utilice el menú emergente en el área de trazado para orientar la imagen correctamente y superponer vectores sobre una rejilla de transformación. Ajuste el factor de escalaal valor en el eje x de la gráfica de las puntuaciones de PC que corresponde al centro estimado del grupo de control. Exporta la imagen como un archivo .bmp.
- Crear un diagrama de dispersión de CVA. En la ficha Comparación de la barra de herramientas principal, seleccione Análisis de variación canónica, y poner de relieve el clasificador conjunto de variables que se importó anteriormente (véase la Sección 5.2.3). Seleccione 1.000 iteraciones de pruebas de permutación, y seleccione Ejecutar. Seleccione la pestaña de calificaciones CV para ver el diagrama de dispersión CVA bivariado. Este es un código de color basado en los clasificadores subidos. Cambiar el esquema de color al traer el menú emergente en el espacio de parcela (véase la Sección 5.3.3). Exportar como un archivo .bmp.
- Crear una red de transformación de CVA. Una rejilla de transformación de los resultados en materia de VAC se puede generar cuando se comparan más de dos grupos. En la ficha Gráficos, seleccione Cambios Forma CV para visualizar la red de transformación de las coordenadas históricas. Abra el menú emergente en el espacio de parcela para cambiarla dirección del vector, superponer los resultados en una rejilla de transformación, y especificar el número de líneas de división. Exportar el gráfico como un archivo .bmp.
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Representative Results
Aquí, se demostró un análisis cuantitativo de tamaño y forma orofacial para comparar los embriones tratados con un inhibidor de receptor de ácido retinoico (RAR inhibidor) a los controles no tratados. Los embriones se trataron con una concentración 1 M de este inhibidor químico de la etapa 24 a 30 (26-35 HPF), eliminado, y se fijaron en la etapa 42 (82 HPF). Luego fueron procesados y analizados como se describe en el protocolo. Los resultados son los datos originales, pero consistente con las observaciones en las publicaciones anteriores 2,3. Embriones de control se trataron con el vehículo, DMSO, y se desarrollaron normalmente (Figura 7Ai, ii). Los embriones tratados con una concentración de 1 mM del inhibidor RAR mostraron leve estrechamiento de la cara, anomalías oculares y una malformación embrionaria que la apertura de la boca tenía la forma más triangular (Figura 7Aiii, iv).
En primer lugar, se midieron las dimensiones tradicionales orofaciales y se resumen en la Figura 7B. S importancia tatistical se determinó mediante la realización de la prueba t de Student suponiendo una varianza desigual entre inhibidores de embriones tratados y los controles para cada medición. Se encontró que tanto la longitud del hocico y la anchura de la cara se redujo significativamente en RAR inhibidores de embriones tratados en comparación con los controles (p-values = 0,0062 y 0,0058, respectivamente; Figura 7Bi, ii). Mientras altura de la cara y la boca redondez aumentaron significativamente (p-valores = 3.7772 x 10 -6, 1,4812 x 10 -7), ancho de la boca se redujo significativamente (p-valor = 2.5175 x 10 -10; Figura 7Biii-v) .El los resultados no mostraron diferencias significativas en el área orofacial general entre los dos grupos (p-valor = 0,3754; Figura 7Bvi). Estos datos muestran que la pérdida de la señalización del ácido retinoico en un momento específico en los resultados de desarrollo en un hocico más corto, ligero estrechamiento de la región media de la cara, y la malformación de la apertura de la boca embrionario.
nt "> Proporcionar una visión sofisticada de los cambios en la forma de la región orofacial embrionario en respuesta a las señales del ácido retinoico reducidos, el próximo utilizamos morfométrico geométrico análisis. Después de identificar y alinear hitos orofaciales utilizando software de análisis morfométricos, que examinó a continuación la variación dentro de cada grupo a través de un análisis de componentes principales (ACP). Cuando los dos primeros componentes principales se trazan unos contra otros embriones, inhibidor RAR tratados fueron distinguirse claramente de los controles a lo largo del eje PC1 (Figura 7C). Esta prueba también mostró los valores atípicos en el ajuste de la muestra ilustrado por dos embriones tratados con inhibidores de la que no se agrupan con el resto del grupo (Figura 7C, flechas).A continuación, las diferencias estadísticas en la forma de la región orofacial entre RAR inhibidores de embriones tratados y controles fueron evaluados y se visualizaron mediante la realización de un análisis de función discriminante (DFA). El Procusto distancia bntre los dos grupos fue significativamente diferente (distancia = 0,2665, valor p <0,0001, Figura 7D), lo que indica un cambio en la forma orofacial cuando se altera la señalización del ácido retinoico. De hecho, los cambios dramáticos en la posición de las señales laterales en la región orofacial indican un estrechamiento de la forma de la cara correspondiente a la altura de inhibidores de embriones tratados (Figura 7D). Además, el ligero desplazamiento hacia afuera en la posición de los puntos de referencia nasales (Figura 7D, flechas) revela la anomalía en la posición de ventana de la nariz en estos embriones que es consistente con la disminución consecuencia del hocico. Los cambios en los puntos de referencia que definen los bordes de la abertura de boca cambios mostrar la posición que reflejan la formación de una boca en forma triangular abertura que es consistente con la hendidura mediana informada en nuestros estudios anteriores 2,3. Además de los cambios de vectores, el patrón de deformación de la rejilla de transformación también ilustra los cambios de forma en la oofacial región. De urdido en la región media de la cara es consistente con la hipoplasia mediofacial y estrechamiento general del rostro visto en embriones con señales de ácido retinoico disminuidas (Figura 7D).
Los resultados del análisis de la función discriminante (DFA) muestran cambios en la forma en que eran compatibles con nuestro análisis cualitativo, así como revelan algunos cambios que no fueron capturados adecuadamente por medidas del tamaño tradicionales por sí solos. Por ejemplo, mientras que el área orofacial no fue significativamente diferente entre los controles y el inhibidor de embriones tratados (Figura 7Bvi), la rejilla de transformación DFA reveló cambios dramáticos en esta región de conformidad con el estrechamiento facial visto en inhibidores de embriones tratados (Figura 7A, D). Además, el patrón y la señal de deformación turnos de la apertura de la boca, junto con el cambio significativo que vimos en la boca redondez, ilustran la malformación de la boca abrir en forma inhibidor tratado Embryos. En resumen, una combinación de mediciones tradicionales de dimensiones faciales y análisis morfométrico geométrico ilustra los cambios en la forma y tamaño de la región orofacial cuando se interrumpen las señales de ácido retinoico.
Figura 1. Material necesario. (A) Herramientas para el análisis de datos. (I) la placa de 24 pocillos, (ii) pipeta de transferencia desechable estándar, (iii) Dumont # 5 pinzas Inox, (iv) Petri plato de barro forradas, (v) la aguja burlas recta, (vi) herramienta pipeta de vidrio, (vii ) escalpelo estéril, desechable. (B) Preparación de la cazuela de barro forradas. (I) Una aguja burlas recta se utiliza para dibujar líneas horizontales en la arcilla. (Ii) Una herramienta pipeta de vidrio se utiliza para hacer depresiones circulares a lo largo de cada fila. (Iii) El plato está lleno de PBT para formación de imágenes.
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Figura 2. En la fecundación in vitro y la cultura de los huevos de Xenopus. (A) Después de la inyección de HCG, adultos hembras de Xenopus laevis son inducidos a desovar. (B) Los huevos se recogieron en MBS elevadas de sal, fertilizados con testículos extraídos de un macho, y se cultivan utilizando métodos estándar. (C), los embriones se transfieren a una placa de 24 pocillos que contenía 0,1X MBS utilizando un estándar, pipeta de transferencia desechable. (D) Una pipeta calibrada-man se utiliza para medir 1 ml en un pocillo vacío, y un marcador se utiliza para delimitar este nivel en el exterior de todos los pocillos embriones que contienen (recuadro). 0,1x MBS luego se agrega o quita para que esté a nivel con esta marca.
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Figura 3. Preparación de los jefes de embriones para la obtención de imágenes. (A) Diagrama de las dos incisiones requeridas para eliminar las cabezas, las líneas negras. Barra de escala = 400 m. (B) La primera incisión se hace en el extremo posterior de la tripa para eliminar la presión de la cola y la liberación desde el bisturí. Barra de escala = 400 m. (C) La segunda incisión se hace en el extremo anterior del intestino, cerca del corazón, para cortar completamente la cabeza. Barra de escala = 400 m. (D) vistas frontales de la fila de cabezas de embriones colocados en arcilla. Barra de escala = 650 m. (E) Vistas laterales de la fila de la posición de las cabezas de embriones en arcilla. Barra de escala = 500 micras cg: glándula de cemento.
Figura 4. mediciones del tamaño de las dimensiones tradicionales de orofaciales. (A) la anchura de la cara. Las flechas indican los puntos donde la porción ventral del ojo se encuentra con la periferia de la cara. La línea roja es la anchura de la cara, medida como la distancia entre estos puntos. Líneas de barra de escala = 210 M. (B) Altura de la cara. Blancos son guías extraídas antes de la medición en el borde dorsal de los ojos y el borde dorsal de la glándula de cemento. La línea roja es la altura de la cara, medida como la distancia entre estas dos guías en la línea media de la cara. Barra de escala = 210 M. (C) área orofacial. Las líneas blancas son guías elaboradas antes de la medición. (A) el punto donde el guía inferior y el borde ventral del ojo izquierdo. La línea roja muestra el trazado alrededor del ojo izquierdo. (B) En el punto donde el borde dorsal del ojo se encuentra con la guía superior. La línea azul muestra el límite dorsal del área orofacial, trazada a lo largo de la guía superior en el borde dorsal de los ojos. (C) El punto donde la guía superior se encuentra con la periferia de la cara derecha. Espectáculos línea verdeel trazado alrededor del ojo derecho. (D) El punto donde el borde ventral del ojo derecho se encuentra con la guía inferior. Línea amarilla muestra límite ventral del área orofacial, trazada a lo largo de la guía inferior en el borde dorsal de la glándula de cemento. Barra de escala = 210 M. (D) la longitud del hocico. La línea blanca es el borde anterior del ojo y se dibuja como una guía antes de la medición. La línea roja es la longitud del hocico, medida a partir de esta línea hasta el punto donde el borde dorsal de la glándula de cemento cumple con la periferia lateral de la cara. Barra de escala = 300 M. De ancho (E) de la boca. Las flechas son los puntos donde se unen los dorsales y ventrales labios. La línea roja es el ancho de la boca, medida como la distancia entre estos dos puntos. Barra de escala = 200 M. (F) Boca redondez. El perímetro de la abertura de la boca se traza y se muestra en rojo. CG: glándula de cemento. Barra de escala = 200 mM.
Figura 5. La captura de puntos de referencia y los preliminares para el análisis morfométrico geométrico. (A) El uso de software de edición de fotos y un programa de hoja de cálculo para colocar puntos de referencia y las coordenadas de captura. (I) los cruces multicolores son los hitos colocados en la imagen con la herramienta añadir puntos en ImageJ para representar la forma de la región orofacial. (Ii) los datos de punto de interés se muestra mediante el uso de la herramienta Mostrar resultados. (Iii) los datos de Landmark se copia y se pega en una hoja de cálculo. Por encima de la segunda columna es un encabezado que identifica el número de puntos de referencia y denotado por "LM = 24" (caja roja). Debajo de la segunda columna de datos, la muestra se le da un nombre único y denota por "ID = CON1" (flecha roja). Esto se repite para todas las imágenes en un conjunto de muestras y los datos se guardan como un archivo de texto. (B) El análisis preliminar de datos en un softw morfométricos geométricason programa. (I) El archivo de texto creado desde el software de edición de fotos se importa en el programa morfométrico, MorphoJ, como un archivo de TPS. Archivo está indicado por la flecha roja. (Ii) Punto de referencia los datos de coordenadas se alinea por ajuste Procusto por ejes principales. La flecha roja indica la ejecución de la alineación. (Iii) una matriz de covarianza de Procusto ajuste de puntos de referencia se genera en el menú Preliminares. (Iv) Un archivo clasificador se crea en una hoja de cálculo. Columna A y B se dan los encabezados "ID" y "tratamiento", respectivamente. Dado a cada muestra en la recopilación de datos histórica son de entrada del ID en la columna A, y el grupo de tratamiento al que pertenece cada muestra se introduce en la columna B. (v) El archivo clasificador se importa en el programa morfométrico como un conjunto variable de clasificador y acertaron por Identificador del conjunto de datos elegido. Haga clic aquí para ver una versión más grande deesta cifra.
Figura 6. Análisis estadístico en el software morfométrico. Análisis de los componentes (A) Principales (PCA) (i) PCA se ha seleccionado en la ficha Variación. (Ii) Los dos primeros componentes principales hitos de Procusto se muestran como un diagrama de dispersión en la pestaña de calificaciones de PC. (Iii) Un menú emergente se crió en el espacio de parcela. Este menú se utiliza para cambiar los componentes principales se representa frente a la otra (flecha roja) y para colorear los puntos de datos (resaltados en azul). (Iv) Los puntos de datos son de color de acuerdo a las variables del clasificador en el menú emergente. (V) Porcentaje de varianza capturada por cada componente principal es vista en la pestaña Resultados. (B) Función discriminante Análisis (DFA) (i) de DFA se ha seleccionado en la ficha Comparación. (ii) las coordenadas Se selecciona el conjunto de datos de Procusto de DFA, y los clasificadores previamente subidos son elegidos por la agrupación. Los grupos deseados para ser comparados son elegidos y se ejecutan pruebas de permutación. (Iii) los resultados de DFA se muestran como un mapa del vector en la ficha Diferencia Forma. Un menú emergente en el espacio de parcela se puede utilizar para orientar correctamente la imagen. (Iv) Al seleccionar la pestaña Set Factor de Escala en el menú emergente, el signo del factor de escala se puede cambiar. (V) El mapa vectorial se cambia a una rejilla de transformación con el número deseado de líneas de la cuadrícula seleccionando Cambiar el tipo de gráfico en el menú emergente del mapa vectorial. (Vi) El Mahalanobis y Procusto distancias y los correspondientes valores de p son vistos en la pestaña Resultados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
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Discussion
Xenopus laevis se ha convertido en una herramienta útil para la disección de los mecanismos de desarrollo de desarrollo orofacial subyacente; sin embargo, actualmente no existen protocolos que describen los cambios de tamaño y forma de esta región en las ranas. El método aquí descrito contribuirá significativamente a la esfera del desarrollo orofacial al permitir una cuantificación más rigurosa de fenotipos orofaciales en Xenopus y otros vertebrados.
El primer aspecto, más crítico de ejecutar correctamente este protocolo es la capacidad para medir las dimensiones faciales y determinar la colocación hito tanto precisa y reproducible. Para ello, es crucial que los rostros embrionarias ser fotografiados en el mismo ángulo, la dirección y la ampliación. Especial cuidado se debe tomar para obtener mediciones precisas de la longitud hocico, ya que es difícil de manipular embriones lateralmente y lograr la colocación consistente. Tener una sola persona realice todas las mediciones en los sdía AME minimiza este tipo de error, al tiempo que maximiza la reproducibilidad de los resultados. El segundo aspecto más crítico de asegurar buenos resultados es la reducción de la variabilidad innecesaria, tales como las diferencias en el desarrollo o antecedentes genéticos. Esto es especialmente importante cuando se evalúa la significación estadística entre los defectos sutiles. Los embriones, por lo tanto, tienen que estar en la misma etapa cuando se les trata y se fotografiaron. Por otra parte, se debe tener cuidado para asegurar tasas de desarrollo son equivalentes entre y entre los grupos de tratamiento. Para reducir este tipo de problemas con la variabilidad, asegúrese de que todos los embriones son de los mismos padres y son etapa emparejado al comienzo del experimento. También reducir las fuentes externas de la variabilidad tales como diferentes fuentes de amortiguamiento y volúmenes, diferentes números de embriones, y distribuciones en las placas de cultivo (por ejemplo, evitar la aglomeración).
Un paso clave en la evaluación de los cambios en la forma a través de morfometría geométrica es la alignment de hito coordina a través de ajuste Procusto. Por aplicación de este algoritmo matemático, se elimina cualquier información sobre el tamaño o las diferencias en la rotación de la imagen. La matriz de covarianza posteriormente generada determina las correlaciones no estandarizados de hito coordina entre todos los embriones en el conjunto de datos, en la que multivariado técnicas- estadística como componente principal o la función discriminante análisis- se puede realizar.
Un análisis de componentes principales (PCA) reduce una muestra compleja para un conjunto más pequeño de variables llamadas componentes principales 26. El primer componente representa el más varianza dentro del conjunto de la muestra, con cada componente posterior que representa el resto. Trazando los primeros dos componentes uno contra el otro software morfométricos con nuevas muestras que son más similares clúster juntos. De esta manera, PCA discrimina grupos dentro de un conjunto de muestras, mientras se determina simultáneamente la variación dentro de ellos. En some casos, los grupos pueden no distinguirse claramente unos de otros y se superponen a lo largo de uno o ambos ejes. En este caso, es ventajoso para trazar otros componentes (por ejemplo, PC3) a fin de revelar características sutiles por el cual los grupos se discrimina. Esto es especialmente relevante cuando la variación total se distribuye de manera más uniforme entre las primeras de varias variables.
El análisis de la función discriminante (DFA) de Procusto ajuste de datos determina si las muestras en un conjunto de datos se discrimina de manera efectiva en grupos por las variables continuas que los definen. Por lo tanto, las muestras se clasifican en grupos antes del análisis, y las variables se traducen en componentes llamados funciones discriminan para determinar la relación estadística entre los grupos 27. Antes de ejecutar este análisis, es importante para indicar el número de pruebas de permutación. Estas pruebas de permutación aleatoriamente los datos de tal manera que ninguna suposición sobre su distribución son Eliminated. Más iteraciones de prueba de permutación aumentar la exactitud de la p-valor. Cuando se visualizó como una rejilla de transformación, los cambios significativos en la situación histórica entre los grupos que se comparan se muestran. Además, el patrón de deformación de la red revela dónde ocurren cambios en la forma. El inconveniente de este análisis es que sólo se puede utilizar para la comparación de dos grupos. Si hay tres o más grupos en un conjunto de muestras para la comparación, es mejor para llevar a cabo un análisis de variación canónica. Esto es similar a un DFA en que se genera un p-valor estadístico; Sin embargo, muestra cambios que se producen en toda la muestra establecida, además de los que se producen entre los grupos individuales dentro de ese conjunto.
La principal limitación de este protocolo cuantificación orofacial es que sólo se puede aplicar a los datos de dos dimensiones. Nuestras metas para el futuro incluyen el uso de la tomografía computarizada o la microscopía confocal para desarrollar métodos similares para el análisis de los datos tridimensionales. Por otra parte,trabajar con imágenes bidimensionales es también uno de los principales puntos fuertes de este protocolo. Sólo se necesitan estereoscopios básicos equipados con cámaras para capturar imágenes de la cara embrionario. El Openware utilizado para este análisis de datos también aumenta la accesibilidad de este método, mientras que disminuye el costo. Además, no se requiere un conocimiento avanzado de imágenes sofístico, análisis estadísticos, o la programación de computadoras para extraer resultados significativos e importantes de los datos. De hecho, esta técnica se enseña en la actualidad como parte de un curso de laboratorio de grado en el departamento de biología de la UCV. Por lo tanto, el protocolo de cuantificación orofacial se presenta aquí es fácil de aprender y aplicar en un corto período de tiempo. Como una representación de vídeo, se resaltan los pasos críticos tales como la colocación de los embriones y la navegación por el software para garantizar el protocolo puede ser utilizado con éxito por los estudiantes incluso sin entrenamiento e investigadores. En resumen, este protocolo proporcionará un valioso recursopara la comunidad de investigación y como herramienta de enseñanza.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Fondos para la instalación de A. Dickinson de VCU apoyaron este trabajo.
Los autores desean agradecer a Dan Nacu por su talento artístico en la creación de la ilustración esquemática.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm x 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15 °C or 20 °C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co. | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
References
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