Summary
En metod för att kvantifiera orofacial storleken och formen av Xenopus laevis embryon har utvecklats. I detta protokoll är traditionella storleksmätningar i kombination med geometriska Morfometri att möjliggöra mer avancerade analyser av orofacial utveckling och defekter.
Abstract
Xenopus har blivit ett viktigt verktyg för att dissekera de mekanismer som styr kraniofaciala utveckling och defekter. En metod för att kvantifiera orofacial utveckling kommer att möjliggöra mer noggrann analys av orofaciala fenotyper vid upphävande med ämnen som är genetiskt eller molekylärt kan manipulera genuttryck eller proteinfunktion. Med hjälp av två dimensionella bilder av embryonala huvuden, är traditionella storleksmått-såsom orofacial bredd, höjd och områdes mäts. Dessutom är en rundhet mått på den embryonala mynningsöppningen används för att beskriva formen på munnen. Geometriska Morfometri av dessa två dimensionella bilder utförs också för att tillhandahålla en mer sofistikerad vy över förändringar i formen av den orofaciala området. Sevärdheter delas särskilda punkter i orofaciala regionen och koordinater skapas. En princip komponentanalys används för att minska landmärke koordinaterna till huvudkomponenterna som sedan diskriminerar behandlingengrupper. Dessa resultat visas som en punktdiagram där individer med liknande orofaciala former kluster tillsammans. Det är också användbart för att utföra ett urskiljningsfunktionen analys, som statistiskt jämför positionerna för de landmärken mellan två behandlingsgrupper. Denna analys visas på en omvandling nätet där förändringar i landmärke ställning betraktas som vektorer. Ett rutnät ovanpå dessa vektorer så att ett varpmönster visas för att visa var betydande landmärke ställning har förändrats. Formförändringar i analysen urskiljningsfunktionen baseras på ett statistiskt mått, och kan därför utvärderas genom att ett p-värde. Denna analys är enkel och tillgänglig, som endast kräver en stereoskop och freeware programvara, och därmed kommer att bli en värdefull forskning och undervisning resurs.
Introduction
Bland de vanligaste och förödande typer av humana fosterskador är de som berör munnen och ansiktet, till exempel orofaciala klyftor 1. Barn med missbildade orofaciala strukturer genomgår flera operationer under hela sin livstid och kämpar med ansikts vanställdhet, tal, hörsel och ätproblem. Därför underlättar ny forskning i cranio- och orofacial utveckling är avgörande för att förebygga och behandla dessa typer av fosterskador hos människor. Xenopus laevis har vuxit fram som ett nytt verktyg för att dissekera de mekanismer som styr kraniofaciala utveckling (några exempel är 2,3,4 -11). Därför skulle en kvantitativ metod för att analysera storlek och formförändringar under utvecklingen av huvudet och ansiktet av denna art är mycket kraftfull 3.
Här presenterar vi en sådan metod; kombinerar traditionella storleksmätningar med geometriska Morfometri anpassas från en Xenopus studie 12 13-15. Målet med detta protokoll är att göra det möjligt för forskare att kvantifiera ansikts storlek och former för att skilja mellan olika orofaciala fenotyper under normal och onormal utveckling. Denna analys kommer att möjliggöra en bättre differentiering mellan subtila kraniofaciala defekter såsom sådana som härrör från synergistiska effekter av gener och / eller miljömässiga faktorer. Dessutom kan denna kvantifiering metoden också avslöjar även svag förbättring eller räddning av en orofacial defekt. Det gör därför en användbar guide i att analysera potentiella läkemedel.
Kombinationen av ansikts mätningar och geometriska Morfometri som vi presenterar här möjliggör en mer omfattande statistisk analys av både storlek och form på orofaciala regionen än dagens protokoll som till stor del använder bara det ena eller det andra 15-18. Vidare presenterar vi ett enkelt sätt att bedöma både den mediala och laterala planansiktet utan att det krävs avancerad tredimensionell avbildningsutrustning som används i löpande undersökningar 13,19.
Vi visar detta protokoll om Xenopus laevis embryon som behandlats med en retinsyrareceptor hämmare som inducerar onormal orofaciala utveckling och en median gomspalt 2,3. Kvantifiering av dimensionerna och formen av det orofaciala området i dessa embryon har avslöjat förändringar i ansiktet som är analogt till människor med liknande palatinala klyftor och musmodeller 20,21. Dock kan detta protokoll användas för att bedöma effekterna av andra föreningar på orofacial utveckling såsom naturämnen, herbicider, eller proteiner såsom tillväxtfaktorer. Vidare, orofaciala storlek och formförändringar till följd av störning av genuttryck via förlust eller vinst på funktions experiment (med antisens morpholinos eller Crispers / Talens) kan också kvantifieras med hjälp av detta protokoll. Slutligen har vi utvecklat denna metod specifically att bedöma Xenopus morfologi; dock är det lätt modifieras för analys av alla ryggradsdjur. Andra tillämpningar kan också innefatta användning av detta protokoll för att jämföra närbesläktade arter för evolutionära och ekologiska studier. Medan det exempel vi ger här använder detta protokoll för att beskriva analys av den orofaciala området, kunde den lätt modifieras för analys av andra regioner, organ eller strukturer.
Denna orofacial kvantifiering protokoll kommer att bli en värdefull resurs för forskarsamhället, samt ett utmärkt pedagogiskt hjälpmedel för studenter som en videodemonstration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utförda med hjälp av Xenopus laevis har godkänts av IACUC (protokoll # AD20261).
1. Förbereda Reagens och Material som behövs
- Reagens:
- Gör 1 liter 10x MBS (Modified Barths Saline) lösning 22. Lägg NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO 4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8) och NaHCO 3 (25 mM) till en L destillerat vatten. Justera pH till 7,8 med NaOH.
- Gör en L 1X MBS genom att späda 100 ml av 10x MBS-lösning i 900 ml destillerat vatten. Lägg 0,7 ml av 1 M CaCl2-lösning.
- Gör en L av 0,1 x MBS genom utspädning 100 ml 1x MBS-lösning i 900 ml destillerat vatten. Till 1 liter 0,1 x MBS lösning, tillsätt 1 ml 10 mg / ml gentamicin lösning för användning i embryokultur.
- Gör höga salt MBS genom upplösning 4 ml av 5 M NaCl i 100 ml av 10x MBS. Tillsätt sedan destillerat vatten tills den totala volymen är 1 L.
- Gör 70% etanol genom att späda 100% ethanol till 70% etanol med användning av destillerat vatten.
- Gör BMS-543 genom att framställa en 10 mM stamlösning i dimetylsulfoxid (DMSO).
- Gör 4% paraformaldehyd (PFA) genom tillsats av 4 g paraformaldehyd pulver till 50 ml destillerat vatten. Värm på en värmeplatta till ca 65 ° C, vid vilken punkt tillsätt 5 M NaOH droppvis tills lösningen klarnar.
- När lösningen rensar, ta bort från värmen och tillsätt 50 ml 2x PBS och 100 l Tween-20. Låt svalna till rumstemperatur på is. Justera pH-värdet till mellan 7,2 och 7,5 med användning av HCl.
- Gör en fosfatbuffrad saltlösning med Tween (PBT) genom upplösning av 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4, och 0,24 g KH 2 PO 4 i 800 ml destillerat vatten. Med användning av HCl, justera pH till 7,4. Tillsätt 2 ml Tween-20. Anpassa den slutliga volymen med destillerat vatten till lika 1 L.
- Gör en cystein-lösning genom att lösa 1 g av cystein i 50 ml destillerat vatten eller 0,1 x MBS. Lägg 1,5 ml av 5 M NaOH ettnd justera pH till 7,8.
- Gör en 10% bensokain förrådslösning genom tillsats av 10 g av Bensokain pulver till 100 ml 100% EtOH. För avlivning av vuxna män och embryon färdiga för fixering, späd till en 0,05% lösning.
- Gör en testiklar lagringslösning genom att tillsätta 1 ml kalvserum till 9 ml L15-buffert.
- Nödvändiga verktyg och utrustning:
- Skaffa utrustning som förtecknas i tabellen av material och utrustning, som visas i figur 1.
- Ändra en pipett verktyg. Placera spetsen på ett glas Pasteur pipett till en flamma från en bunsenbrännare. Rotera pipettspetsen tills det smälter och bildar en rundad förseglad ände.
- Plattar modellera in i bottnen av en Petriskål av plast, att jämna ut för att täcka hela plattan (kan alla storlekar användas) (Figur 1Aiv).
- Tryck lätt på en rak retas nål i leran kantade skålen i 45 ° vinkel. Håll nålen där, och sakta Petridela horisontellt för att skapa en deprimerad linje (figur 1Bi). Upprepa för önskat antal rader.
- Använd i slutet av en glaspipett verktyg för att göra grunda, runda fördjupningar i varje rad av leran kantade maträtt att placera embryot huvuden (Figur 1Bii) och stöd i att organisera embryona när du fotograferar.
- För fotografering, fyll skålen med PBT (figur 1Biii). Mellan användningar, grundligt tvätta skålen och lera yta med sterilt vatten, följt av 70% etanol.
2. Xenopus laevis Embryo Kultur och Inhibitor Behandlingar
- Provrörsbefruktning och kultur i Xenopus ägg:
- Skaffa och kultur Xenopus laevis embryon genom att använda standard publicerade metoder 22,23.
- I korthet avliva en vuxen man genom nedsänkning i en 0,05% Bensokain lösning. Dissekera testiklar och lagra i testiklar lagringsbuffert. Injiceravuxna kvinnor med humant koriongonadotropin (HCG), plocka ägg i höga salt MBS, och gödsla in vitro med dissekerade testiklar (Figur 2A, B).
- Kultur embryon i 0,1 x MBS vid 15 ° C tills den önskade scenen är nådd (stadium embryon enligt den normala bord Xenopus laevis av Nieuwkoop och Faber 24,25).
- Här, kultur embryon tills etapp 22 (24 timmar efter befruktning (HPF)), och ta bort vitellinmembranet under ett stereomikroskop med hjälp av två par vässade pincett. Överför embryon med en standard, disponibel överföringspipett till en ren petriskål (100 mm i diameter) innehållande 30-40 ml 0,1 x MBS.
- Hämmarbehandlingar av Xenopus-embryon (som illustreras i figur 2):
- Fyll nödvändiga brunnar i en 24-väl odlingsskål med 1 ml 0,1 x MBS använder en kalibrerad pipett-man. Avgränsa utsidan av brunnen med en fin spets märkeer (Figur 2D, infälld). Använd markören för att även märka innehållet som skall sättas till varje brunn på 24-brunnars odlingsskål lock. Kopiera denna information på en 24-väl installation sida i laboratoriet anteckningsbok.
- Överför 5-10 embryon till varje brunn med hjälp av en standard, disponibel överföringspipett (figur 2C). Placera samma antal embryon i varje brunn.
- Fyll på eller ta bort 0,1 x MBS så att den är i nivå med 1 ml markerade linjen (figur 2D). Tillsätt en lämplig mängd av DMSO (så att den slutliga volymen av DMSO är 1%) och snurra försiktigt. Var noga med att inte lägga DMSO för nära embryona, och undvika kontakt av embryona med ytan av bufferten.
- Tillsätt en lämplig mängd av kemikalien till den utsedda brunnar och snurra försiktigt igen. Här, tillsätt 1 pl 10 mM BMS-453 (en vitamin A-syrareceptorantagonist) och 9 pl DMSO till 1 ml av 0,1 x MBS.
- Om kemikalien är ljuskänsligt, löst linda culTure skålen i aluminiumfolie. Kultur embryon i ett 15 ° C inkubator tills önskad scenen. I detta exempel, behandla embryon för 16-18 timmar.
- Tvätta embryon ur behandlingen och uppfödning tills grodyngel steg:
- Ta bort hälften till tre fjärdedelar av lösningen med en disponibel överföringspipett. Var noga med att inte störa embryona. Med hjälp av en ny överföringspipett, fylla brunnen med 0,1 x MBS. Upprepa detta 3-6 gånger.
- Överför embryon till en stor petriskål (150 mm i diameter) som innehåller 100 ml 0,1 x MBS med gentamicin (1 ml / l). Inkubera embryon vid 15 ° C tills de når stadium 42-45 (82-100 HPF).
- Ändra 0,1 x MBS lösningen innehållande gentamicin dagligen och ta bort döda embryon omedelbart för att förhindra kontaminering eller död andra embryon. Anteckna antalet döda embryon i laboratorium anteckningsbok.
- Fixerings embryon i paraformaldehyd (PFA):
- Fix embryon mellan etapperna 42 och 45 (82 och 100hpf, respektive) genom att överföra dem till en ny 24-väl odlingsskål innehållande 1-2 ml 0,1 x MBS. Märk locket med samma information som den behandling som upp beskrivits ovan (avsnitt 2.2.1).
- Ta bort så mycket 0,1 x MBS från varje bra som möjligt, samtidigt som det lämnar embryon som omfattas och säkerställa minimal kontakt för att förhindra skador. Lägg 1-2 ml 0,05% Bensokain lösning i 0,1 x MBS och inkubera tills embryon inte längre reagerar på stimuli.
- Lägg 1-2 ml 4% PFA. Alternativt, placera embryon i märkta mikrocentrifugrör för fixering, om så önskas.
- Inkubera embryon i PFA i 24 h vid 4 ° C på en roterande skakanordning. Avlägsna PFA genom att utföra 3-4 tvättar med PBT under en 3-5 h period.
3. Fotografering av Orofacial regionen Xenopus Grodyngel
- Framställning pre-fotografi (detta illustreras i Figur 3):
- Placera fasta embryon i en stor petriskål (150mm i diameter) som innehåller ca 100 ml PBT.
- Göra två inskärningar för att avskilja huvudet från kroppen (figur 3A, solida svarta linjer). Först håller embryo med en pincett och göra ett snitt på den bakre sidan av tarmen med en steril skalpell (Figur 3B). Göra ett andra snitt på den främre sidan av tarmen, nära hjärtat, för att fullständigt ta bort huvudet (Figur 3C).
- Pipett avskilde embryo huvuden i en lera kantade maträtt (del 1.2.2) med en vanlig, disponibel överföringspipett.
- För frontal vyer, använder två par pincett för att placera embryohuvuden bakre sidan nedåt inne i runda fördjupningar. Använda pincett för att manipulera både embryot huvudet och den omgivande leran, positions embryon så att de står inför kameran och inte lutar bakåt eller åt sidan (figur 3D). Tryck försiktigt den omgivande leran runt huvudet med pincett och / eller glasetpipett verktyg för att säkra huvudet på plats.
- För sidovyer Använd pincett för att placera embryo huvuden inne i runda fördjupningar så att de är på deras sida, tittar åt samma håll, och är platt mot leran. Manipulera embryot huvudet och det omgivande lera så att cementkörtlar hos alla embryon är placerade nedåt med samma vinkel (figur 3E). Använd raderna dras med retas nål som en guide för att säkerställa exakthet när du tar sido mätningar.
- Fånga bilder av grodyngel huvudet:
- Fotografera chefen för grodyngel använder någon dissekera mikroskop med en bifogad digitalkamera och motsvarande kamerans mjukvara. Använd största förstoring som kan hållas konstant för alla embryon.
- Centrera embryon och möter dem alla i samma riktning. Fånga bilder med hjälp av de bästa ljusförhållanden som gör det möjligt för den mest exakta bilden av orofaciala regionen. Positionlampor för att undvika alltför stora skuggor. Spara bilderna som .tiff filer med högsta möjliga upplösning.
4. Att mäta och analysera Facial Storlek Mått i Xenopus Grodyngel
- Mät orofaciala dimensioner (som sammanfattas i figur 4):
- Bestäm kuggbredd. Identifiera de punkter vid vilka den ventrala delen av varje öga möter periferierna av ansiktet (figur 4A, pilar), och mäta avståndet mellan dessa punkter (figur 4A, röd linje).
- Bestäm ansikte höjd. Först bestämmer mittlinjen genom att mäta avståndet mellan varje öga och beräkning halvvägs. Därefter drar horisontella linjer som markerar de dorsala flesta kanterna på ögon och rygg mest punkt av cementkörteln (Figur 4B, vita linjer). Vid mittlinjen, mäta avståndet mellan de horisontella linjerna (Figur 4B, röd linje).
- Bestämma than orofacial område. Använd samma horisontella linjer som markerar ryggkanter ögon och cementkörteln att vägleda areamätning (figur 4C, vita linjer). Starta vid den punkt där den horisontella linje som markerar början av cementkörteln möter periferin av den vänstra sidan av ansiktet (figur 4CA).
- Spåra längs kanten av ansiktet encompassing ögat tills den punkt där den horisontella linje som markerar den övre delen av ögonen möter periferin av ansiktet (figur 4Cb). Fortsätt att spåra längs denna ryggens mest horisontell linje till den punkt där den möter periferin av den högra sidan av ansiktet (Figur 4 ml).
- Trace nedåt längs kanten av ansiktet encompassing ögat tills den punkt där den ventrala mest horisontella linje som markerar den övre delen av cementkörteln möter periferin av den högra sidan av ansiktet (figur 4CD). Fortsätt att spåra längs denna nedre horisontella linjen until den möter den punkt där spårning började. Använd fotoredigeringsprogram för att beräkna området innanför spårning.
- Bestäm nos längd. På sidobilder, gör en vertikal linje som markerar den främre delen av ögat. Därefter mäta det horisontella avståndet från den främre mest punkt där ansiktet möter den dorsala kanten av cementkörteln till den vertikala linje som markerar främre delen av ögat (Figur 4D).
- Bestäm mun bredd. Mäta det horisontella avståndet mellan vänster och höger punkter där de övre och nedre "läppar" mynningen öppnar möts (figur 4E). Dessa kan betraktas grodan motsvarigheten till labial commissures.
- Bestäm mun rundhet. Beräkna munnen rundhet som en omvänd bildförhållande där (4 × [Area]) / (π × [Major axel] 2 >).
- Använd lassoverktyget i en foto-editor för att spåra kanterna på munnen öppningen enligt figur 4F. Välj Analysera i verktygsfältet och välj Mät. Alternativt beräkna rundhet från mätningen av området och diametern på mynningen.
- Uppgiftsanalysen av ansikts dimensioner:
- Inmatnings mätningarna av ansiktsdimensioner i en dataanalys-program för att jämföra den behandlade gruppen med kontrollgruppen. Bestämma medelvärdet för varje mätning för både experimentella och kontrollgrupperna för att skapa stapeldiagram. Bestämma standardavvikelsen i syfte att skapa felstaplar. Utför Students t-test för att statistiskt jämföra grupper.
OBS: Denna information kan vara ganska varierande beroende på de lite olika i utvecklingstakt bland embryon.
- Inmatnings mätningarna av ansiktsdimensioner i en dataanalys-program för att jämföra den behandlade gruppen med kontrollgruppen. Bestämma medelvärdet för varje mätning för både experimentella och kontrollgrupperna för att skapa stapeldiagram. Bestämma standardavvikelsen i syfte att skapa felstaplar. Utför Students t-test för att statistiskt jämföra grupper.
5. Kvantitativ analys av Orofacial Form och Morfometri
- Landmärken Place och create landmärke koordinatfilen (illustreras i figur 5A).
- Välj landmärken sådana som de fångar den formen av målbilden, och upprepat kan placeras i samma relativa placering i alla prov som analyseras. Om en struktur inte finns i alla prover, inte placera ett landmärke på denna struktur.
- Här placerar 24 landmärken för att representera mellanansiktet med kännetecken som t.ex. ögon, näsborrar och mun. För enhetlighetens landmärken plats halvvägs mellan tidigare placerade landmärken (t.ex. landmärken mun, figur 5Ai).
- Fånga landmärke koordinater och skapa "landmärke koordinatfilen". Öppna den första bilden av en grodyngel yta (till exempel, den första styr embryo).
- Välj fliken Plugins på verktygslisten och välj Pointpicker från rullgardinsmenyn. Välj de lägga till punkter fliken och placera sevärdheter i önskade platser som landmärken visas som mångfärgade kors (
- Flytta landmärke platser efter placering genom att välja Flytta korsar verktyget. När alla landmärken har placerats på bilden, välj Visa resultat Tab på verktygslisten och välj Visa (Figur 5Aii) för att visa landmärke koordinater och kopiera in i ett kalkylprogram (figur 5Aiii).
- När du klistrar in dessa koordinater från den här första embryo till ett kalkylprogram, lämna en tom rad ovanför datan. I kolumn B i denna tom rad (rad 1), typ "LM =" med antalet landmärken i provet. Här anger du "LM = 24" eftersom 24 landmärken skapades (Figur 5Aiii, röd ruta).
- I raden nedanför datapunkter, typ "ID =" med ett namn som identifierar provet. Här i figur 5Aiii, ange "id = CON1" eftersom det är ett landmärke koordinatdata för den första styr embryot (Figur 5Aiii, röd pil).
- Kopiera hela andra och tredje kolumnen i ett textdokument och spara som en .txt-fil.
- Välj fliken Plugins på verktygslisten och välj Pointpicker från rullgardinsmenyn. Välj de lägga till punkter fliken och placera sevärdheter i önskade platser som landmärken visas som mångfärgade kors (
- Välj landmärken sådana som de fångar den formen av målbilden, och upprepat kan placeras i samma relativa placering i alla prov som analyseras. Om en struktur inte finns i alla prover, inte placera ett landmärke på denna struktur.
- Sätt upp morfometrisk programmet programvara för dataanalys (illustreras i figur 5B).
- Här väljer du Skapa ny datauppsättning i huvudmenyn i morfometrisk programmet. Döp filen och datauppsättningen i rutorna (till exempel "retinsyra Inhibition" och "Ansiktslandmärken", respektive) i pop up-skärmen (Figur 5Bi). Importera filen som en TPS, och select textfilen koordinater för att skapa datasetet (Figur 5Bi, röd pil).
- Data anpassningen och Prokrustes passar:
- Utför en Prokrustes passform och inriktning. Markera datauppsättningen på fliken Project Tree väljer Förberedelser på verktygslisten, och New Prokrustes Fit i rullgardinsmenyn.
- Välj Align av Principal Axis och välj Utför Prokrustes Fit i botten av lådan (Figur 5Bii, röd pil). Återgå till förberedelser rullgardinsmenyn väljer du Generera kovariansmatrisen (figur 5Biii), och välj Kör.
- Se sambanden i kovariansmatrisen på fliken Resultat.
- Skapa en "klassificerare fil" genom att tilldela varje prov i datauppsättningen till lämplig sorteringsvariabel för att skilja på om det hör hemma i försöksgruppen eller kontrollgruppen.
- Märk två kolumner i ett kalkylblad. Märk huvudet på den första column med "ID" och mata in samma ID är givet för varje prov (t.ex. CON1, RARINHIB1, och så vidare, figur 5Biv). Märk sidhuvudet av den andra kolonnen med "behandling" och matas in i varje cell den behandlingsgrupp som motsvarar det prov som anges i den intilliggande ID cellen.
- Här använder "CONTROL och RAR-hämmare" etiketter som klassificerare (Figur 5Biv). Kopiera in en textfil och spara som en .txt-fil. Importera Classifier variabler i morfometrisk programmet. Välj Match från Identifier, och öppna textfilen (figur 5Bv).
- Skapa en principalkomponentanalys (PCA) punktdiagram genom att välja Variation rullgardinsmenyn och välja Principal Component Analysis (figur 6Al). Välj sedan fliken Grafik för att se ytterligare tre flikar: PC formförändringar, egenvärden och PC tjog (Figur 6Aii). Fliken PC poängen visar bivariate principalkomponentspridningsdiagram av passnings landmärke uppgifter Prokrustes (figur 6Aii).
- För att ändra vilka huvudkomponenter är plottade, ta fram popup-menyn i komplotten utrymmet och välj önskad axel ändra (figur 6Aiii, röd pil).
- Välj färg Data Punkter (Figur 6Aiii). Välj klassificerare tidigare importerades (avsnitt 5.2.2) i den andra popup-menyn som visas för att bestämma färgen på varje kategori (figur 6Aiv).
- Visa mängden variansen fångas av varje huvudkomponent i fliken resultat (figur 6Av). Exportera diagram som en .bmp-fil.
- Skapa en diskriminantanalys funktion (DFA) transformation rutnät i morfometrisk programmet genom att välja diskriminantfunktionen Analys under fliken Jämförelse (figur 6BI). I snabbmenyn, se till att rätt datasetet är selsad och den typ av data är de Prokrustes-fit koordinater.
- Markera paren grupper som skall jämföras, och kör 1.000 permutationstester (figur 6Bii).
- Under Graphics, visa vektor karta över koordinaterna på fliken Shape Skillnad (figur 6Biii). Om bilden är inverterad, ta fram popup-menyn i täppan utrymme för att vända bilden åt rätt håll (figur 6Biii).
- Riktningen för vektorer reflekterar formen skillnad från den första gruppen i förhållande till den andra, som visas i diskriminantfunktionen Meny före körning av analysen (Figur 6Bii). För att vända riktningen på vektor, ta fram popup-menyn i komplotten utrymmet och ändra tecken för skalfaktorn så att det är negativt (Figur 6Biii, iv). Värdet av skalvärdet är satt till en faktor tio som bäst motsvarar de statistiska skillnaderna i landmärke ställning between de två grupperna utan distorsion, och är vanligtvis kvar med förvalda (figur 6Biv).
- Även i popupmenyn, ändra graf till en omvandling rutnät lägga på vektorerna på ett galler (figur 6Biii, v).
- Ange antalet horisontella och vertikala linjer i rutnätet i snabbmenyn (Figur 6Biii, v).
- Exportera grafen som en .bmp fil.
- Visa Prokrustes och Mahalinobis avstånd och p-värden under fliken resultat (figur 6Bvi).
- Ytterligare morfometriska analyser som är användbara för bedömning av mer än en behandlingsgrupp
- Skapa en principalkomponentanalys omvandling rutnät. PC Shape Ändrar fliken visar vektor karta över formförändringar står för varians inom varje urvalsgrupp. Använd popupmenyn i diagramområdet för att orientera bilden ordentligt och överlagra vektorer på en omvandling rutnät. Ställ in skalfaktorntill värdet på x-axeln i PC-poäng grafen som motsvarar den beräknade mitten av kontrollgruppen. Exportera bilden som en .bmp fil.
- Skapa ett CVA spridningsdiagram. Under fliken Jämförelse på verktygslisten, välj Canonical Variate analys och markera klassificerare variabeluppsättning som tidigare importerades (se avsnitt 5.2.3). Välj 1.000 iterationer för permutationstester och välj Kör. Välj fliken CV poäng att visa bivariata CVA spridningsdiagram. Detta är färgkodade utifrån de uppladdade klassificerarna. Ändra färgschema genom att ta upp popup-menyn i täppan utrymmet (se avsnitt 5.3.3). Exportera som en .bmp-fil.
- Skapa ett CVA omvandling rutnät. En transformations rutnät av CVA resultat kan genereras när man jämför mer än två grupper. Under fliken Grafik väljer CV formförändringar att visualisera omvandlingen rutnät av de landmärke koordinater. Ta fram snabbmenyn i täppan utrymme för att förändrariktningen av vektorn, lägga på resultat på en omvandling rutnät, och ange antal stödlinjer. Exportera grafen som en .bmp fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här gjordes en kvantitativ analys av orofacial storlek och form visade att jämföra embryon som behandlats med en retinsyra-receptor-inhibitor (RAR-hämmare) till obehandlade kontroller. Embryon behandlades med en 1 ^ M koncentration av denna kemiska hämmaren från steg 24 till 30 (26-35 HPF), tvättas ut och fixeras vid steg 42 (82 HPF). De bearbetades därefter och analyserades såsom beskrivs i protokollet. Resultaten är originaldata, men i linje med observationer i tidigare publikationer 2,3. Embryon Kontroll behandlades med fordonet, DMSO, och utvecklas normalt (figur 7Ai, ii). Embryon som behandlats med en 1 ^ M koncentration av RAR-hämmare visade lätt förträngning av ansiktet, ögon anomalier, och en missbildad embryonal mun öppning som var mer triangelformat (figur 7Aiii, iv).
Först var traditionella orofaciala dimensioner mäts och sammanfattas i Figur 7B. S TATISTISKA signifikans bestämdes genom att utföra en T-test under antagande olika varians mellan hämmar behandlade embryon och kontroller för varje mätning. Vi fann att både nos längd och ansiktsbredden var signifikant minskat i hämmarbehandlade embryon RAR jämfört med kontroller (p-värden = 0,0062 och 0,0058, respektive; Figur 7BI, ii). Medan ansiktshöjd och mun rundhet ökade signifikant (p-värden = 3,7772 x 10 -6, 1,4812 x 10 -7), mun bredd signifikant minskade (p-värde = 2,5175 x 10 -10, Bild 7Biii-v) .Det Resultaten visade ingen signifikant skillnad i den totala orofaciala området mellan de två grupperna (p-värde = 0,3754, fig 7Bvi). Dessa data visar att förlusten av retinsyra signalering vid en viss tidpunkt i utvecklingsprojekt resulterar i en kortare nos, liten minskning av mellanansiktet regionen och missbildning av embryonala munnen öppningen.
nt "> För att ge en sofistikerad bild av de formförändringar av den embryonala orofaciala regionen som svar på minskad retinsyra signaler, nästa utnyttjade vi geometriska morfometriska analyser. Efter att ha identifierat och anpassa orofaciala landmärken med hjälp morfometrisk analysprogram, då vi granskat variansen inom varje gruppen via principalkomponentanalys (PCA). När de två första huvudkomponenterna avsattes mot varandra, RAR inhibitor behandlade embryon var tydligt skiljas från kontroller längs PC1 axeln (figur 7C). Detta test visade också att extremvärden i urvalet set- illustreras av två hämmarbehandlade embryon som inte klustret med resten av gruppen (figur 7C, pilar).Därefter tillsattes de statistiska skillnaderna i formen av den orofaciala området mellan hämmarbehandlade embryon och kontroller RAR bedömas och visualiserades genom utförande av en diskriminantanalys funktionsanalys (DFA). Den Prokrustes avståndet bÅren de två grupperna var signifikant (distans = 0,2665, p-värde <0,0001, figur 7D), vilket tyder på en förändring i orofacial form när retinolsyra signalering störs. Faktum är dramatiska förändringar i läget för sidolandmärken i orofaciala regionen indikerar en minskning av ansiktsform respektive till höjden i hämmar behandlade embryon (Figur 7D). Dessutom lätt utåt förskjutning i position i näsans landmärken (Figur 7D, pilar) avslöjar abnormalitet i näsborren position i dessa embryon som är förenligt med minskad utväxt av nosen. De förändringar i landmärken som definierar kanterna på munnen öppnande visar positionsändringar som speglar bildandet av en triangelformad mun öppning som är förenligt med medianen kluven rapporterats i våra tidigare studier 2,3. Förutom vektor skift, den skevhet mönster av transformations rutnät illustrerar också formförändringar i ellerofacial regionen. Skevhet i mellanansiktet regionen är överens med mellanansiktet hypoplasi och övergripande ansikts förträngning ses i embryon med minskade retinsyra signaler (Figur 7D).
Resultaten av analysen diskriminantfunktionen (DFA) visar formförändringar som var i linje med vår kvalitativ analys, samt avslöjar en del förändringar som inte i tillräcklig grad återspeglas traditionella storleksmätningar ensam. Till exempel, medan den orofaciala området var ingen signifikant skillnad mellan kontroller och inhibitor behandlade embryon (figur 7Bvi), avslöjade DFA transformationsnätet dramatiska förändringar i denna region som är förenliga med ansikts förträngning sett i hämmar behandlade embryon (figur 7A, D). Vidare skevhet mönster och landmärke förskjutningar i munnen öppningen, tillsammans med den betydande förändring som vi såg i munnen rundhet, illustrerar missbildning i munnen öppna form i inhibitor behandlade embryos. Sammanfattningsvis en kombination av traditionella mätningar av ansikts dimensioner och geometriska morfometrisk analys visar förändringar i form och storlek på orofaciala området när retinsyra signaler störs.
Figur 1. Nödvändiga material. (A) Verktyg för dataanalys. (I) 24-brunnars platta, (ii) standardbruk överföringspipett, (III) Dumont # 5 Inox pincett, (iv) lera-fodrade petriskål, (v) rak retas nål, (vi) glaspipett verktyg, (vii ) steril engångs skalpell. (B) Framställning av leran kantade skålen. (I) En rak retas nål används för att rita horisontella linjer i leran. (Ii) Ett glas pipett verktyg används för att göra runda fördjupningar längs varje rad. (Iii) Skålen fylls med PBT för avbildning.
page = "always"> 
Figur 2. In vitro fertilisering och kultur Xenopus ägg. (A) Efter HCG injektion, laevis vuxna Xenopus honor induceras att lägga ägg. (B) Ägg uppsamlas i höga salt MBS, gödslas med testiklar som extraheras från en hane, och odlades med användning av standardmetoder. (C) Embryon överfördes till en 24-brunnsskål innehållande 0,1 x MBS med en vanlig, disponibel överföringspipett. (D) En kalibrerad pipett-man används för att mäta 1 ml i en tom brunn, och en markör används för att avgränsa denna nivå på utsidan av alla brunnar innehåller embryon (infälld). 0,1 x MBS sedan till eller tas bort så att den är i nivå med det här märket.
highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Beredning av embryohuvuden för avbildning. (A) Diagram över de två snitt som krävs för att avlägsna huvuden, helt svarta linjer. Skalstreck = 400 | j, m. (B) Den första snitt görs i den bakre änden av tarmen för att ta bort svansen och släpptrycket från skalpell. Skalstreck = 400 | j, m. (C) Den andra snitt görs på den främre änden av tarmen, nära hjärtat, för att fullständigt avskilja huvudet. Skala bar = 400 m. (D) Front vyer av raden av embryohuvuden placerade i lera. Skala bar = 650 m. (E) Lateral utsikt över raden av embryohuvuden ställning i lera. Scale bar = 500 | j, m cg: cement körteln.
Figur 4. Traditionella storleksmätningar av orofaciala dimensioner. (A) kuggbredd. Pilar anger de punkter där den ventrala delen av ögat möter periferin av ansiktet. Röd linje är ytbredden, mätt som avståndet mellan dessa punkter. Skala bar = 210 M. (B) Face höjd. Vita linjer finns guider dragna före mätning vid ryggkanten av ögonen och ryggens kanten av cementkörteln. Röd linje är ansiktet höjden, mätt som avståndet mellan dessa två guider vid mittlinjen av ansiktet. Skala bar = 210 M. (C) Orofacial område. Vita linjer finns guider dragna före mätning. (A) I punkt där botten guide möter den ventrala kanten på det vänstra ögat. Röd linje visar att spåra runt vänster öga. (B) Punkt där den dorsala kanten av ögat möter övre guide. Blå linje visar dorsala gränsen för orofacial område, spåras längs den övre guide vid ryggkanten av ögonen. (C) Punkt där den översta guiden möter den högra ansikts periferin. Gröna linjen visarspårning runt höger öga. (D) I punkt där den ventrala kanten på det högra ögat möter botten guide. Gul linje visar ventrala gränsen av orofacial område, spåras längs botten guide på ryggens kanten av cementkörteln. Skalstreck = 210 | iM. (D) tryne längd. Vit linje är den främre kanten av ögat och dras som en guide före mätningen. Röda linjen är tryne längd, mätt från denna linje till den punkt där den dorsala kanten av cement körtel möter den laterala periferin på ansiktet. Skala bar = 300 M. (E) Mouth bredd. Pilar är de punkter där den dorsala och ventrala läppar möts. Den röda linjen är munnen bredd, mätt som avståndet mellan dessa två punkter. Skalstreck = 200 | iM. (F) Mun rundhet. Omkretsen av mynningsöppningen spåras och visas i rött. cg: cementkörteln. Skalstreck = 200 | iM.
Figur 5. Fånga landmärken och förberedelser för geometrisk morfometrisk analys. (A) Använda fotoredigeringsprogram och ett kalkylprogram för att placera landmärken och fånga koordinater. (I) Mång kors är de landmärken som släpps ut på bilden med hjälp av Add punkter verktyget i ImageJ att representera formen på orofaciala regionen. (Ii) Landmärke data visas med hjälp av Visa resultat Tool. (Iii) Landmärke data kopieras och klistras in i ett kalkylblad. Ovanför den andra kolumnen är en rubrik som anger antal landmärken och betecknas med "LM = 24" (röd ruta). Nedanför den andra kolumnen i uppgifterna provet ges ett unikt namn och betecknas med "ID = CON1" (röd pil). Detta upprepas för alla bilder i en provuppsättning och data sparas som en textfil. (B) Preliminär analys av data i ett geometriskt morfometrisk programinfoär programmet. (I) Textfilen skapas i från fotoredigeringsprogram importeras till morfometrisk programmet MorphoJ, som TPS-fil. Fil indikeras med röd pil. (Ii) Landmärke koordinatdata är i linje med Prokrustes fit med huvudaxlarna. Röd pil visar utförandet av anpassning. (Iii) En kovariansmatris Prokrustes fit landmärken genereras i förberedelser menyn. (Iv) En klassificerare fil skapas i ett kalkylblad. Kolumn A och B ges rubriker "ID" och "behandling", respektive. ID: s ges till varje prov i insamlingen landmärke uppgifter matas in i kolumn A och behandlingsgruppen som varje prov tillhör input i kolumn B. (v) Klassificeraren filen importeras till morfometrisk programmet som en klassificerare variabel set och matchade av Identifier för den valda datauppsättningen. Klicka här för att se en större version avdenna figur.
Figur 6. Statistisk analys i morfometrisk programvara. (A) Principal Component Analysis (PCA) (i) PCA är vald från fliken Variant. (Ii) De första två huvudsakliga komponenterna i landmärken Prokrustes visas som en spridningsdiagram på fliken PC-poäng. (Iii) Ett popup-menyn tas upp i täppan utrymmet. Denna meny används för att ändra vilka huvudkomponenter är plottade mot varandra (röd pil) och att färga datapunkterna (markerade med blått). (Iv) Datapunkterna är färgade enligt klassificerare variabler i popupmenyn. (V) Andel av variansen fångas av varje huvudkomponent ses på fliken Resultat. (B) diskriminantfunktionen Analysis (DFA) (i) DFA är vald på fliken Jämförelse. (ii) uppgifterna från Prokrustes koordinater väljs för DFA, och de tidigare uppladdade klassificerarna väljs för att gruppera. De önskade grupper som skall jämföras väljs och permutations tester körs. (Iii) DFA resultat visas som en vektor karta på fliken Shape Difference. En popup-menyn i täppan utrymmet kan användas för att orientera bilden korrekt. (Iv) Genom att välja fliken Set Scale Factor i popupmenyn, kan tecknet för skalfaktorn ändras. (V) Den vektor karta ändras till en transformation rutnät med det önskade antalet rasterlinjer genom att välja Ändra typ av graf i popup-menyn i vektorkartan. (Vi) Mahalanobis och Prokrustes avstånd och motsvarande p-värden ses under fliken Resultat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus laevis har blivit ett användbart verktyg för att dissekera de utvecklings- mekanismerna bakom orofacial utveckling; Det finns dock för närvarande inga protokoll som beskriver storlek och formförändringar i denna region i grodor. Den metod som beskrivs här kommer att bidra avsevärt till området för orofacial utveckling genom att tillåta mer rigorös kvantifiering av orofaciala fenotyper i Xenopus och andra ryggradsdjur.
Den första, mest kritiska aspekten av korrekt utföra detta protokoll är förmågan att mäta ansiktsmått och bestämma landmärke placering både exakt och reproducerbart. Därför är det viktigt att embryonala ansikten fotograferas i samma vinkel, riktning och förstoring. Särskild försiktighet måste vidtas för att få exakta mätningar av nosen längden, eftersom det är svårt att manipulera embryon sidled och uppnå konsekvent placering. Att ha en enda person att utföra alla mätningar på same dag minimerar denna typ av fel, samtidigt maximera reproducerbarheten av resultaten. Den näst mest kritiska aspekten att säkerställa goda resultat är en minskning av onödiga variationer, till exempel utvecklings skillnader eller genetisk bakgrund. Detta är särskilt viktigt vid bedömningen av statistisk signifikans mellan subtila defekter. Embryon därför måste vara i samma skede när de behandlas och fotograferades. Dessutom bör försiktighet iakttas för att säkerställa utvecklingssatser är likvärdiga mellan och bland behandlingsgrupperna. För att minska sådana problem med variabilitet, se till att alla embryon är från samma föräldrar och är stadium matchas i början av experimentet. Också minska externa källor till variabilitet såsom olika buffertkällor och volymer, olika antal embryon, och fördelningar i odlingsskålar (till exempel förhindra trängsel).
Ett viktigt steg i bedömningen av formförändringar genom geometriska Morfometri är alignmenton landmärke koordinater via Prokrustes passform. Genom tillämpning av denna matematisk algoritm, är någon information om storlek eller skillnader i rotation av bilden bort. Den senare genererade kovariansmatris bestämmer unstandardized korrelationer av landmärke samordnar bland alla embryon i datamängden, som multivariata statistiska techniques- såsom huvudkomponent eller diskriminantfunktionen politiska analyser kan utföras.
En principalkomponentanalys (PCA) minskar ett komplext prov till en mindre uppsättning variabler som kallas principalkomponenter 26. Den första komponenten svarar för det mesta variansen i provuppsättning, med varje efterföljande komponent som står för resten. Genom att rita de två första komponenterna mot varandra med hjälp av morfometrisk programvara, prover som är mest likt kluster tillsammans. På detta sätt PCA diskriminerar grupper inom en provuppsättning, medan samtidigt bestämma variationen inom dem. I SOMe fall kan grupperna inte vara klart åtskilda från varandra och överlappar längs ena eller båda axlarna. I detta fall är det fördelaktigt att plotta andra komponenter (till exempel, PC3) för att avslöja subtila särdrag genom vilka grupper är diskriminerade. Detta är särskilt relevant när den totala variansen är mer jämnt fördelad mellan de första flera variabler.
Diskriminantfunktionen Analys (DFA) i Prokrustes fit uppgifter avgör om prov i en datamängd effektivt diskrimineras i grupper enligt de kontinuerliga variabler som definierar dem. Prover klassificeras därför i grupper före analys, och variablerna är översatta till komponenter som kallas diskriminera funktioner för att fastställa statistiskt samband mellan grupperna 27. Innan du kör den här analysen är det viktigt att ange antalet permutationstester. Dessa permutationstester slumpmässigt data så att alla antaganden om dess fördelning eliminated. Fler permutation Test iterationer öka noggrannheten av p-värdet. När visualiseras som en omvandling rutnät, där betydande förändringar i landmärke läge mellan grupperna jämförs visas. Vidare avslöjar skevhet mönstret av nätet där formförändringar inträffar. Nackdelen med denna analys är att den endast kan utnyttjas för jämförelse av två grupper. Om det finns tre eller flera grupper i en provuppsättning för jämförelse, är det bättre att göra en kanonisk variate analys. Detta liknar en DFA i att den genererar ett statistiskt p-värde; Men, det visar förändringar över hela provet satt utöver de som förekommer mellan enskilda grupper inom den uppsättningen.
Den huvudsakliga begränsningen av detta orofacial kvantifiering protokoll är att den endast kan tillämpas på två-dimensionella data. Våra framtida mål inkluderar användning CT-scanning eller konfokalmikroskopi att utveckla liknande metoder för analys av tredimensionella data. Å andra sidan,arbetar med tvådimensionella bilder är också en av de stora styrkorna med detta protokoll. Endast grundläggande stereoscopes utrustade med kameror behövs för att fånga bilder av den embryonala ansiktet. Den Openware utnyttjas för detta dataanalys ökar även tillgängligheten av denna metod, samtidigt som man minskar kostnaderna. Vidare är en avancerad kunskap om sofis avbildning, statistiska analyser, eller programmering krävs inte för att utvinna meningsfulla och viktiga resultat från datan. I själva verket är denna teknik som för närvarande undervisas som en del av en grundutbildning laborationer i VCU Biologiska institutionen. Således är det orofacial kvantifiering Protokollet presenteras här lätt att lära sig och använda i en kort tid. Som en videorepresentation, är kritiska steg såsom positionering embryon och navigera programvaran markerad för att säkerställa att protokollet kan med framgång användas av även otränade studenter och forskare. Sammanfattningsvis kommer detta protokoll att ge en värdefull resursför forskarsamhället och som ett pedagogiskt verktyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Uppstarts pengar till A. Dickinson från VCU stött detta arbete.
Författarna vill erkänna Dan Nacu för hans konstnärliga talang i att skapa den schematiska illustrationen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm x 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15 °C or 20 °C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co. | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
References
- Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
- Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
- Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
- Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
- Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
- Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
- Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
- Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
- Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
- Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
- Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
- Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
- Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
- Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
- Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
- Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
- Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. (1967).
- Nieuwkoop, P. D. aF. J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , Garland Publishing Inc. (1994).
- Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
- Hill, T. L. P. STATISTICS: Methods and Applications. , StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).
