Abstract
כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה של פרוסות מוח חריפות. הליך זה הוא אלמנט קריטי עבור ניסויי תיקון- clamp אלקטרו שקובע במידה רבה את איכות תוצאות. הוכח כי השמטת צעד הקירור במהלך חיתוך הליך היא בהשגת פרוסות ותאים בריאים, במיוחד כאשר התמודדות עם מבנים מוחיים myelinated מאוד מבעלי חיים בוגרים. למרות שהמנגנון המדויק שבו טמפרטורה גבוהה תומכת בבריאות עצבית ניתן השקיעה רק על, זה מתקבל על הדעת כי, במידת האפשר, את הטמפרטורה שבה החיתוך מבוצע צריכה להיות קרובה למצבים פיסיולוגיים כדי למנוע חפצים הקשורים בטמפרטורה. יתרון חשוב נוסף של שיטה זו הוא הפשטות של ההליך ולכן זמן הכנה הקצר. בשיטה הוכיחה עכברים בוגרים משמשים אך את אותו ההליך יכול להיות מיושם עם עכברים צעירים כמו גם חולדות. כמו כן, CL התיקון הבאניסוי המגבר מתבצע על פרוסות המוח הקטן אופקיים, אלא גם באותו ההליך ניתן להשתמש במטוסים אחרים, כמו גם אזורים האחוריים אחרים של המוח.
Introduction
מטרת השיטה המוצגת היא להשיג פרוסות מוח חריפות באיכות גבוהה עבור בניסויים במבחנה אלקטרו, במיוחד בעת שימוש במבוגרים או אפילו בעלי חיים ישנים.
שיטת חיתוך המוח החריפה, כפי שתוארה על ידי Skrede ו1 Westgaard בשני משפטים אלגנטיים, הפכה לאחד מעמודי התווך של מחקר במדעי המוח מודרני ומועסקת בוריאציות אין ספור ברחבי העולם. האיכות של הפרוסות באו לידי ביטוי במספר של חיים נוירונים לכל פרוסה, פרק זמן שבמהלכו התאים ממשיך תכונות אלקטרו והצורניות שלהם, כמו גם בשלמות הרקמה. יתר על כן, משך הזמן המקסימאלי להקלטות יציבים תלוי באיכות של הפרוסות. כך, לאורך עשרות השנים, שיטת החיתוך המקורית פותחה עוד יותר על ידי קבוצות מחקר בודדות כדי לשפר את ההתאוששות פרוסה לאחר חיתוך 2-10, לעתים קרובות על ידי שינויים מורכבים של הרכב חיתוך oפתרונות התאוששות r (כגון הוספת ascorbate, thiourea או אפילו H 2 O 2), כמו גם מראש זלוף תוך לבו של בעל החיים עם פתרונות פיסיולוגיים מקוררים.
כפי שהראה 11 לאחרונה, נראה טמפרטורה פיזיולוגית במהלך החיתוך להיות מועיל יותר מאשר קירור לבריאות עצבית; השיפור בולט ביותר בעבודה עם מבוגרים מכרסמים (2-8 חודש). הימנעות שינויי טמפרטורה דרמטיות מונעת חפצים בשל תהליכי טמפרטורה תלויה בתוך התאים, כגון קינטיקה פלסטיות 13 ויון-ערוצי 13,14. שינויים כאלה יכולים להשפיע על מתח קרום ואיתות סידן תוך תאי, סף ספייק, וספייק צורה.
השיטה "החמה" פרוסה חריפה ההכנה שהוצגה כאן היא נוהל כללי לקבלת פרוסות מוח חריפות באיכות גבוהה מכל אזור במוח, כולל המוח הקטן, קליפת המוח וההיפוקמפוס, גזע המוח גרעיני 16 </ Sup> כמו גם את הנורה חוש הריח, הן בחולדות ועכברים.
יש לציין, הליך חיתוך הטמפרטורה הפיזיולוגי דורש כי להב החיתוך רוטט כמעט בצורה מושלמת בצורה אופקית, והוא ללא כל פגמים מבניים. הדיוק הזה לא יכול להיות בר-השגה עם מודלים מבצעה מבוגרים; במקרים כאלה, אנו ממליצים על ביצוע הכנת פרוסה בתנאים קר כקרח כנראית בטמפרטורה הנמוכה על מנת להפוך את הרקמה עמידה יותר בפני נזק מכאני, גם אם במחיר של סטיות מטבולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי הניסוי שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים של האוניברסיטה בעברית ובועדת השימוש.
1. הכנת הפתרונות וכלים לחיתוך
- הכן 1 ליטר של פתרון פיסיולוגי סטנדרטי (SPS) המכיל את היונים שמתוארים בטבלה 1.
- הכן פתרון מניות המכיל מלחים בשעה 10 פעמים את הריכוז הסופי מראש בבקבוק זכוכית אחסון מלא 1,000 מיליליטר של מים ללא יונים (מוליכות של 0.055 מייקרו-שני / סנטימטר). להוסיף מלח (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, וMgSO 4), ומערבבים עד שהיא נמסה לחלוטין. אחסן את פתרון המניות ב 4 מעלות צלזיוס.
- להפוך את פתרון SPS הסופי ביום של הניסוי. הוספה של פתרון המניות 100 מיליליטר ל -700 מיליליטר של מים מטוהרים, לפזר את גלוקוז (3.6 גר ') וNaHCO 3 (ז 2.18) באמצעות סרגל מערבבים מגנטי ולאחר מכן להוסיף מים מזוקקים עד 1 ל
- לאזן solutiבגז אותו עם 95% O 2/5% CO 2 ~ 20 דקות. אחרי זה, להוסיף 2 מיליליטר של M CaCl פתרון 2 1.
- להרכיב את הכלים הבאים (איור 1).
- הכינו מספריים גדולים או כלי אחר לעריפת הראש, מספריים כירורגיות קטנים לפתיחת הגולגולת, מלקחיים טיפ נאה להרמת הגולגולת לחשוף את המוח, באזמל עם להב ללנתח את החלק הרצוי של המוח להיות פרוס ומרית קטנה לטיפול ב חלקי מוח גזורים.
- בנוסף, להכין חתיכות קטנות של נייר סינון להסרת נוזלי עודפים מהמוח, שתי צלחות פטרי קטנות למוח להיות גזורים בשתי זכוכית 500 מיליליטר כוסות לחממו מים המכילים מטוהרים וSPS, ודבק cyanoacrylate הדבקת המוח שלב חיתוך.
- הכן מברשת קטנה לטיפול בפרוסות במהלך החיתוך ופיפטה פסטר זכוכית בעלת פתח רחב להעברת פרוסות מאמבטית החיתוך לצ'ה ההתאוששותmber. לחטא את הכלים כדי למנוע צמיחת חיידקים באמבטיות פרוסה החמה. יתר על כן, להשתמש בכפפות מעבדה נקיות.
- הכן חדר התאוששות הפרוסה שקוע כזה כפי שתואר על ידי גיב ו -15 אדוארדס. ברציפות בגז SPS בו עם 95% O 2/5% CO 2 ולשמור על 36 מעלות צלזיוס. ודא כי להמתה בגז אינו מביא לבועות קטנות שנלכדו באמבטיה שיכולה לגרום נזק לפרוסות.
- חם ~ 300 מיליליטר של SPS 36 ° C על צלחת חימום עם בוחש מגנטי או באמבט מים. אם נעשה שימוש בצלחת חימום, לטפל כדי למנוע את הפתרון מהתחממות יתר, שעלול לגרום למשקעי יון. במקרה זה קורה, SPS חם וטרי במקום הקירור הישן.
- להביא ~ 500 מיליליטר של מים מטוהרים לרתיחה תוך שימוש בקומקום חשמלי ו, בכוס, לשלב 300 מיליליטר שלו במים קרירים כדי לקבל מים מעט חמים יותר מטמפרטורת החיתוך. השתמש בזה חימם מים מטוהרים בעריפת הראש ולהשתמש במאהלרנינג של המים רתוחים מאוחר יותר לשמירה על הטמפרטורה הפיזיולוגית של האמבטיה החיתוך.
- לטשטש את העכבר על ידי הזרקת 0.1 מיליליטר של pentobarbital (60 מ"ג / מיליליטר) intraperitoneally. אחרי כמה דקות לבדוק שבעלי החיים אינם מגיבים לצובט הבוהן או זנב חזק כדי לברר את חוסר התחושה.
2. ביתור המוח
- לערוף את העכבר במהירות על ידי חיתוך הצוואר עם המספריים הגדולים ליד החלק האחורי של הגולגולת, ולתת לראש ליפול לתוך הכוס עם מים מטוהרים חיממו כדי לשטוף את הדם עודף.
- לחשוף את מגנום foramen בגולגולת מתחת לשרירי הצוואר והעור, אולי הסרת יותר של הצוואר עם המספריים הקטנים.
- משוך את העור בחלק העליון של הגולגולת כדי להיות מסוגל לראות בבירור את תפרי גולגולת על מנת להנחות את הפתיחה של הגולגולת.
- חותך את הגולגולת הפתוחה על ידי החדרת הקצה התחתון של המספריים הקטנים דרך מגנום foramen ומייד להפוך אותם לכיווןהצד לרוחב. לחתוך בעדינות לאורך הקצה הלטרלי של העצם הקודקודית עד מיקום מאחורי העיניים ותפר frontoparietal; אז, פונה לכיוון מרכז הגולגולת וחצתה את קו האמצע לצד השני של הגולגולת האחר (ראה קו מקווקו ירוק באיור 2 א).
- בעזרת מלקחיים טיפ נאה, להרים את הגולגולת מפינת frontoparietal ולמשוך באלכסון אותו וsidewards לחשוף את המוח (ראה חץ מקווקו צהוב באיור 2 א). ודא כי הגולגולת אינה מחוברת לשום עצם או עור של הראש, כדי שהמוח יישאר במקום שבו הגולגולת היא הרימה. במקרה שהמוח נע בגולגולת, להשתמש במספריים הקטנים כדי להסיר את כל רקמת חיבור בין הגולגולת והמוח.
- כאשר המוח חשוף, לא מאפשר למוח להיות יבש. כך, בצע את השלבים הבאים תוך שמירה על הגולגולת והמוח בצלחת פטרי מלאה חימם, הומתו בגז SPS.
- לנתק את חלק במוח המשמש לדוארxperiment משאר המוח באמצעות אזמל ומרית. במקרה של שימוש במוח הקטן, להתנתק מהמוח הקדמי על ידי חתך אחד דרך המוח התיכון וגשר המוח (קווים אדומים באיורים 2B-D) ולהעביר אותה לצלחת פטרי קטנה המכילה טרי, הומתו בגז SPS.
- הסר את גזע המוח כדי ליצור בסיס ישר ורחב להדבקת המוח לחיתוך שלב שבו חותך את המוח הקטן במישור אופקי. בקצרה למקם המוח הקטן על פיסת נייר סינון רטובה כל כך שהצד שנחתך מהמוח הקדמי פונה כלפי מטה.
- חותך את גזע המוח עם אזמל כדי ליצור את הבסיס (כפי שצוין בקו הכחול בתרשים 2B), ולהחזיר את המוח הקטן לSPS. כאשר מטוסים אחרים של חיתוך יש צורך, לקצץ את בלוק המוח הקטן בהתאם (קווים כחולים בתרשימים 2C & D).
3. חותך את המוח
- הכן את שלב הגזירה על ידי בירור שהוא הייתר"י, לפני יישום טיפה קטנה של דבק מגע באמצע השלב.
- הרם את בלוק המוח מSPS בעזרת מרית עם צד עד נכון, ולהסיר את נוזלי עודפים מהמוח באמצעות חתיכות קטנות של נייר סינון. ואז, בתנועה אחת, חלק את המוח מהמרית על טיפת הדבק על הבמה.
- כדי למנוע את המוח מייבוש והדבק בריצה בצידי הרקמות, להחיל כמה טיפות של SPS עם פיפטה פסטר והנח את שלב החיתוך בתא החיתוך. יישר את בלוק המוח כך שהאזורים של עניין (למשל, קליפת מוח) מתמודדים עם הלהב ובכך יהיה כפוף לכמות מינימאלית של לחץ מכאני לפני שנחתכה.
- חותך כל פרוסה על פי הוראות היצרן ואילו בגז כל הזמן SPS בתא החיתוך, כמו גם שמירה על הטמפרטורה ב34-37 מעלות צלזיוס. שמור על הטמפרטורה של חדר החיתוך בטווח זה על ידי מילוי externתא אל של מבצעה עם חיממו מים מטוהרים והחלפת המים בכל פעם שהטמפרטורה יורדת נמוכה מדי.
הערה: הפרמטרים החיתוך יש למצוא באופן ניסיוני עבור כל סוג של רקמה ותאי עצב שנבחנים. במקרה של מבצעה קמפדן SMZ 700 עם להבי קרמיקה ותאי Golgi המוח הקטן, להשתמש במשרעת תנודה 0.75 מ"מ על 65 הרץ וקידום מהיר של 0.05 מ"מ / שנייה; למשרעת נוירונים גרעיניים המוח הקטן יותר ותדירות (1 מ"מ ו -90 הרץ, בהתאמה), ומהירות איטית יותר מראש (.01-0.02 מ"מ / שנייה) מומלצים. עבור שני Golgi ונוירונים גרעיניים המוח הקטן, עובי פרוסה צריך להיות 300 מיקרומטר. - במהלך החיתוך, אינו מאפשר את הפרוסות לקפל על עצמם. למנוע את זה בעדינות על ידי תמיכתם במברשת רכה, רצוי לגעת בפרוסה רק באזורים שאינם בעלי עניין לניסוי. לטפל כדי למנוע את המברשת מלגעת בלהב vibratome; במיוחד במקרה של להבי הקרמיקה אפילו מגע, אורעלול לגרום נזק ללהב.
- העבר כל פרוסה מתא החיתוך להתאוששות / מחזיק תא באמצעות פיפטה פסטר זכוכית בעלת פתח רחבה, אש מלוטשת.
- בואו פרוסות לנוח בחדר במשך שעה לפחות 1 לפני תחילת הניסוי. זה מאפשר פירוק של רקמות ותאים פגומים או למות ובכך גורם למשטח פרוסה נקי. במהלך השעה הראשונה, לשמור על הטמפרטורה של SPS בתא בטווח של 34-36 C °; להבטיח שהפרוסות אינן נוגעות בבועות אוויר שעלול לגרום נזק לפרוסות או לגרום להם לצוף.
ניסוי 4.
- אחרי שעה 1, תן טמפרטורת חדר ההתאוששות להתקרר לRT (C ° 17-25).
הערה: פעולה זו עשויה להאריך את משך הזמן שבמהלכו את הפרוסות ניתן להשתמש על ידי האטה של הצמיחה של חיידקים, כמו גם חילוף חומרים בתאים. תקופה זו תלויה באזור במוח וסוג התא. לדוגמא, ניתן למצוא סוגים מסוימים של תאי Golgi להיות בריאים בפרוסות8 שעות לאחר החיתוך ואילו סוגים אחרים יימשכו רק 6 שעות. - אחרי שעה 1 עברה מהחיתוך, להשתמש בפרוסות לניסויי אלקטרו שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוסות מוכנות באופן המתואר יכולות לשמש לניסויי אלקטרו וoptogenetic שונים. באיור 3 א ו3C, אנחנו מראים דוגמא מייצגת של חתך אופקי המוח הקטן ופרוסה בקליפת המוח מוח העטרה, בהתאמה, שנצפה תחת התערבות ההפרש (DIC) אופטיקה. בפרוסת המוח הקטן, מספר סוגים של תאי עצב של המוח קטן יכולים להיות מזוהים בקלות על ידי צורת הגוף ומיקום הסלולרי שלהם, המאפשרים ממוקד קלטות אלקטרו. באיור 3 ו3D, דוגמא עקבות מהקלטות תיקון- clamp כל התא במצב מהדק נוכחי מתא פעיל באופן ספונטני המוח הקטן Golgi ותא פירמידלי בקליפת המוח מוצגות. ניתן למצוא דוגמאות נוספות לאיכות של קלטות אלקטרו וoptogenetic המתקבלות ממוח הפרוס חם בהואנג ו -11 Uusisaari וet al לפלר. 16.
| ריכוז [מ"מ] | משקל (גרם / ליטר) | |
| NaCl | 124 | 72.5 |
| KCl | 3 | 2.23 |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | 1.63 |
| MgSO 4 * 6 שעות 2 O | 1.9 | 4.3 |
| גלוקוז | 20 | 3.6 |
| NaHCO 3 | 26 | 2.18 |
| CaCl 2 | 2 | 1.109 |
הרכב 1. טבלה של הפתרון הפיזיולוגי הסטנדרטי.
איור 1. הסדר של הכלים. 1. מספריים גדולים, 2. מספריים קטנים כירורגית, אזמל 3. עם להב # 11, 4. מלקחיים טיפ נאים, 5. מרית קטנה, 6. צלחות פטרי קטן, 7. כוס זכוכית מים ללא יונים, 8. כוס זכוכית לגאס חימםפתרון ד פיסיולוגי, 9. דבק סופר, 10. מברשת דקה, 11. פיפטה פסטר, 12. מזרק קטן, 13. Pentobarbital, 14. ניירות סינון, שלב חיתוך 15..
ציור איור 2. ייצוג סכמטי של נתיחת הגולגולת והמוח () המתאר את פתיחת הגולגולת כדי לחשוף את המוח (B - D).. ציורי סכמטי המתארים את המטוסים של חיתוך המוח לשלושה מטוסי חיתוך גדולים. הקו הכחול מייצג את המטוס שעליו המוח יהיה דבוק ב.
איור o פרוסת המוח הקטן אופקית 3. תוצאות נציג של השיטה. ()btained עם השיטה הפגינה. שלוש השכבות העיקריות של קליפת המוח (שכבת גרגר תא, שכבת GC; שכבת נוירון פורקינג, שכבת PN; השכבה מולקולרית, ML), כמו גם בחומר לבן (WM) מצוינים. אלקטרודה תיקון- clamp נמשכת סכמטי על תא Golgi (סרגל קנה מידה: 40 מיקרומטר) (אלוף). דוגמא (ב) הקלטה מתא Golgi שמוצג א ההקלטה שהושגה עם אלקטרודה תיקון- clamp בנוכחי מהדק מצב. (בשחור: עקבות נציג מתוך שש עקבות אפורות). פרוסת קליפת המוח מוח העטרה (C) המתקבלת בשיטה הפגינה. תאים פירמידליים בקליפת המוח מוצגים יחד עם ציור סכמטי של אלקטרודה תיקון- clamp. הקלטת מהדק דוגמא תיקון (ד '), במצב מהדק נוכחי, מתא פירמידלי מוצג ב( C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מדגימים שיטה להכנת פרוסות מוח חריפות מעכברים בפיסיולוגיים במקום טמפרטורה קרה כקרח.
הוכח 11 שאיכות פרוסות שהושגו בתנאים חמים היא מעולה כאשר בהשוואה לאלו שהוכנו בתנאים קרים, ובלבד שיש לו את להב מבצע רטט אנכי מינימאלי. חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית עשוי למנוע חפצים פיסיולוגיים הנגרמים על ידי הטמפרטורה הנמוכה, כגון אלה הקשורים לשינויים בתהליכי חילוף חומרים 17-19 שיכול להתבטא בסטיות של תא בודד, כמו גם התנהגות רשת. יתר על כן, למרות שהליך החיתוך צריך כמובן להיות הושלם ללא עיכובים מיותרים, אין צורך למהר עם החיתוך (כפי שהוא כשהוא חותך בתנאים קרים כקרח כדי לסיים חיתוך לפני הפתרונות הפכו חמים מדי, וכדי למנוע את נזק מהקפאה ארוכת טווח של הרקמה). כך, מהירויות חיתוך איטיות יותר יכולות להיות לנוed. זה יכול להיות מועיל במקרה של חיתוך מבנים עדינים מאוד. אחרון, תוך השמטת צעד הקירור של שני הפתרונות ושל המוח מפחיתה באופן משמעותי את המשך זמן הנדרש להליך, כמו גם מורכבותו. הקירור של הפתרון לטמפרטורה קר כקרח דורש בערך 40 דקות יותר מ התחממות הפתרון לטמפרטורה פיזיולוגית, משאיר יותר זמן לניסוי עצמו.
הוכח 20 שעוצמת הקרינה בתאי עצב בקליפת המוח בעכברי GAD67-GFP היא חזקה יותר כאשר בוחנים פרוסות לחתוך ב -20 מעלות צלזיוס בהשוואה לאלו לחתוך ב 0 מעלות צלזיוס. זו תומכת עוד יותר את הרעיון שחותך בטמפרטורה קרה כקרח מפעיל מזיק בfl uence על יכולת הקיום של תאי עצב. מצד השני, באותו נייר זה היה מראה כי הצפיפות של נוירונים ניאון הופחתה בפרוס שהושג על 37 מעלות צלזיוס בהשוואה לאלו לחתוך ב 20 ° C. המחלוקת עם התוצאות עשויה אריse מהעובדה שz-הסטייה לא נלקחה תחת שיקולים. כפי שצוין לעיל, יש z-סטיית השפעה חזקה על איכות הרקמות בעת חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית, בנוסף לאיכות של הלהב ואת המהירות והגדרות אחרות של מבצעה.
אחד החלקים החיוניים של ההליך כרוך כוונון עדין של להב מבצעה לפני חיתוך. שלא כמו בעת שימוש בפתרונות קר כקרח שבו החיתוך סביר כרוך בשני החיתוך אופקי כמו גם אנכי "פיצוח" של ממברנות שומנים בדם הנוקשה, בתנאים פיסיולוגיים כל תנועה של להב המבצע בz-הכיוון תגרום נזק ברקמה. כדי למזער את זה, הלהב צריך להיות קשה וישר ככל האפשר; בניסיון שלנו, יש לי סכיני גילוח קונבנציונליים פגמים רבים מדי כדי להיות שמיש. להבי פלדת אל-חלד באיכות גבוהה שתוכננו במיוחד עבור vibratome שימוש טובים יותר, אבל לתוצאות הטובות ביותר אנו מציעים CERAM-משופע אחתלהבי ic. יתר על כן, אנו ממליצים בחום לבלות זמן משמעותי ליישור אופקי מושלם של הלהבים כמו זה משפיע ישירות על איכות פרוסה. אנו משתמשים במבצע קמפדן 700SMZ המאפשר כוונון של יישור הלהב כך שהרטט בz-המטוס הוא פחות מ -0.5 מיקרומטר. ואכן, ההגבלה החשובה ביותר של שיטת החיתוך החמה היא התלות שלה באיכות להב מבצעה ויציבות. אם לא ניתן עמדו בדרישות אלה, מומלץ להשתמש בשיטת החיתוך קר כקרח המסורתית במקום, למרות החסרונות בחיתוך בפתרון קר כקרח כמו משתנה osmolarity מלהיות קפוא בחלקו.
השיטה הוכיחה משמשת להשגת פרוסות אופקית של המוח הקטן; עם שינויים פשוטים באותה השיטה יכולה לשמש כדי לקבל פרוסות באו העטרה או מטוס sagittal, מהרבה אזורים אחרים בקדמת הבמה - או המוח התיכון, כמו גם את גזע המוח. לפרוסות של החלקים קדמי ביותר של המוח הקדמי וolfactמערכת אורי, הגולגולת יש לחתוך קדמית יותר כדי למנוע נזק לחלקים אלה. אנו בכוונה לשמור על השיטה פשוטה וקצר ככל האפשר, ולא להעסיק מראש טפטוף של בעלי החיים, ואין לנו להחליף את כל רכיבים בפתרון הפיזיולוגי לחיתוך. זה מאפשר השיטה להיות שונה בהתאם לתת סוג העצבי הספציפי של עניין. סביר להניח כי שינויים של פתרונות החיתוך (כפי שמתוארת באזכור במבוא) יכולים לשפר את הכדאיות של פרוסות וביציבות של תוצאות. באופן כללי, השיטה צריכה להיות תואמת עם רוב פתרונות פיסיולוגיים נפוצים אחרים המשמשים בדרך כלל להקלטת אלקטרו.
בשיטה המוצגת כאן, פרוסות נחתכות 300 מיקרומטר עבה. העובי הפרוסה האופטימלי תלוי באזור במוח הפרוס והתאים של עניין. לשיקולי יושר רשת, פרוסות לא צריכים להיות דק יותר מ -250 מיקרומטר, ובגלל מגבלות דיפוזיה עדלמגבלה של העובי הפרוסה הוא ~ 400-450 מיקרומטר.
שלב קריטי בשיטה זו רואה בהדבקת המוח לשלב הגזירה, כחוסר יציבות אפילו קטן ברקמות יכולה לגרום לפרוסות אחידות, או לא שמיש. לכן, יש לנקוט זהירות כדי לוודא כי פני השטח של המוח אין SPS עודף כשמוריד על ירידת הדבק; גם, יותר מדי דבק, יגרום למוח שוכב בצורה לא אחידה על הבמה ואולי ניתוק מהבמה במהלך חיתוך. כמו כן, דבק עודף עלול להתגנב על הצדדים רקמות ו, בנוסף להחדרת inhomogeneity לפרוסות, עלול לגרום נזק ללהב.
יש כמה קשיים שעלולות לעלות בעת שינוי פרוטוקול החיתוך מהשיטה קרה כקרח לשיטה החמה הפגינה. אחד הקשיים הוא המראה של חיידקים בפרוסות. מסיבה זו חשוב לחטא את הכלים, קאמרי, ואמבטית החיתוך עם אתנול לפני ההליך. כמו כן, הפיכהאת מערכת החימום בהתאוששות האמבטיה אחרי שעה 1 מאיטה את גידול החיידקים.
לבסוף, יש להדגיש כי שיפור הבריאות של תאי העצב בפרוסות לחתוך בטמפרטורה פיזיולוגית עלולה גם לגרום לשינויים במאפיינים הפנימיים שלהם. לכן, מומלץ לבצע השוואה ראשונית של התוצאות שהתקבלו מפרוסות עם שני שיטות קרות וחמות, במיוחד אם הניסויים הם חלק מפרויקט ארוך עם עבודות קודמות נעשו בשיטה הקרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg/ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M.
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , 2nd edition, Company of Biologists. Cambridge, UK. (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
