Abstract
Здесь мы приводим протокол для подготовки острых срезах мозга. Эта процедура является важным элементом для электрофизиологических экспериментов патч-зажим, который в значительной степени определяет качество результатов. Было показано, что опуская стадии охлаждения во время резки процедуру полезно в получении здоровых ломтики и клетки, особенно при работе с высокой миелиновых структур головного мозга из зрелых животных. Даже при том, что точный механизм которой повышенная температура поддерживает нервную здоровье можно только предполагать на, само собой разумеется, что, когда это возможно, температура в которой выполняется нарезка должна быть близка к физиологическим условиям по предотвращению температуры, связанные артефакты. Еще одним важным преимуществом этого метода является простота процедуры и поэтому некоторое время подготовка. В продемонстрированной методом взрослых мышей используются, но та же самая процедура может быть применена с молодых мышей, а также крыс. Также, следующий патч клЭксперимент усилитель выполнен на горизонтальных срезов мозжечка, но та же самая процедура также может быть использован и в других самолетов, а также другие задних областях мозга.
Introduction
Целью предложенного метода является получение высококачественных острых кусочков мозга для в пробирке электрофизиологических экспериментов, особенно при использовании взрослого или даже старые животные.
Острая метод мозг нарезка, как описано Skrede и Westgaard 1 в двух элегантных приговоров, стал одним из основ современных исследований в области нейронаук и используется в бесчисленных вариациях по всему миру. Качество ломтиками отражается в количестве живых нейронов за среза, период времени, в течение которых клетки держать их электрофизиологических и морфологических свойств, а также в целостности ткани. Кроме того, максимальная продолжительность записи для стабильных зависит от качества срезов. Таким образом, вдоль десятилетий, оригинальный метод нарезки получила дальнейшее развитие отдельных исследовательских групп по повышению нефтеотдачи ломтик после резки 2-10, часто сложных модификаций состава резки оРешения г восстановления (например, добавление аскорбат, тиомочевины или даже H 2 O 2), а также внутри-сердечной предварительной перфузии животного с охлаждаемых физиологических растворов.
Как было недавно показано 11, физиологическая температура во время нарезки, кажется, более выгодным, чем охлаждение до нейронов здоровья; улучшение самое поразительное при работе со взрослыми (2-8 месяц) грызунов. Как избежать резких изменений температуры предотвращает артефактов из-за процессов в зависимости от температуры клеток, таких как пластичность 13 и ион-каналы кинетики 13,14. Такие изменения могут повлиять на мембранным напряжением и внутриклеточной сигнализации кальция, порог шип, и шип форму.
"Горячая" острый срез способ приготовления, представленные здесь, общая процедура для получения высококачественных острых кусочков мозга из любого региона мозга, в том числе в мозжечок, кору и гиппокамп, ядрах ствола мозга 16 </ SUP>, а также в обонятельной луковице, как у крыс и мышей.
Следует отметить, что процедура физиологический температура нарезки требуется, чтобы режущий диск вибрирует почти совершенно горизонтально и без каких-либо дефектов структуры. Такая точность не может быть достижимо с более старыми моделями среза; в таких случаях, мы рекомендуем вам провести подготовку ломтик в морозильных холодной условиях, низкая температура, кажется, делает ткани более устойчивы к механическим повреждениям, даже если ценой метаболических отклонений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, описанные в этом протоколе были утверждены уходу и использованию животных комитета Еврейского университета.
1. Подготовка решения и инструменты для нарезки
- Подготовьте 1 л физиологического раствора стандарт (SPS), содержащий ионы, описанные в таблице 1.
- Подготовка исходного раствора, содержащего соли при 10-кратной конечной концентрации в заранее в хранения стеклянной бутылки, наполненной 1000 мл деионизированной воды (проводимости 0,055 мкСм / см). Добавить соли (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, и MgSO 4), и размешать до полного растворения. Хранить маточного раствора в 4 ° С.
- Сделать окончательное решение SPS на день эксперимента. Добавить 100 мл исходного раствора до 700 мл очищенной воды, растворить глюкозу (3,6 г) и NaHCO 3 (2,18 г) с использованием магнитной мешалки, а затем добавить очищенную воду до 1 л
- Уравновесить Solutiна по газовыделения его с 95% O 2/5% CO 2 в течение ~ 20 мин. После этого, добавьте 2 мл 1 М CaCl раствора 2.
- Соберите следующие инструменты (рисунок 1).
- Подготовьте большие ножницы или другой инструмент для обезглавливания, небольшие хирургические ножницы для вскрытия черепной коробки, тонкий наконечник щипцы для подъема череп подвергать мозг, скальпель с лезвием для вскрытия нужную часть мозга, чтобы быть нарезанный и небольшой шпатель для работы расчлененные части мозга.
- Кроме того, подготовить небольшие кусочки фильтровальной бумаги для удаления избытка жидкости из головного мозга, две маленькие чашки Петри для мозга, чтобы разрезать на две стекла 500 мл стаканы для содержащего подогретой очищенной воды и СПС, и цианакрилатного клея для склеивания мозг нарезка этап.
- Подготовьте небольшую щетку для обработки ломтики в течение нарезки и с широким горлом стекло пипетки Пастера для перемещения ломтики от нарезки бане к восстановления чаmber. Лечить инструменты, чтобы предотвратить рост бактерий в теплых ломтик ванн. Кроме того, используйте чистые лабораторные перчатки.
- Приготовьте погруженной ломтик камера регенерации такой, как описано Edwards и Гибб 15. Постоянно газ СПС в нем с 95% O 2/5% CO 2 и держать при температуре 36 ° С. Убедитесь, что выделение газов не приводит к мелких пузырьков, захваченных в ванне, что может привести к повреждению ломтиками.
- Теплый ~ 300 мл СПС до 36 ° С на нагревательной пластины с магнитной мешалкой или в водяной бане. При использовании пластины нагревателя, заботиться, чтобы предотвратить решение от перегрева, что может привести к ионной осадков. Если это произойдет, теплые свежие SPS вместо охлаждения старый.
- Принесите ~ 500 мл очищенной воды до кипения, используя электрический чайник и, в стакане, объединить 300 мл него с холодной водой, чтобы получить немного теплой воды, чем температура нарезки. Используйте этот нагревали очищенную воду во время обезглавливания и использовать Remaiнин из кипятка позднее для поддержания физиологического температуру нарезки ванной.
- Анестезировать мыши путем инъекции 0,1 мл фенобарбитала (60 мг / мл) внутрибрюшинно. Через несколько минут проверить, что животное не реагирует на сильные ног или хвоста щепотки констатировать отсутствие ощущения.
2. Пройдя мозг
- Обезглавьте мышь быстро путем отрезания шейки с большими ножницами возле задней части черепа, и пусть голова упасть в стакан с подогретой очищенной воды, чтобы смыть лишнюю кровь.
- Expose затылочного отверстия в черепе под мышц шеи и кожи, возможно, удаление более шеи с маленькими ножницами.
- Потяните кожу на верхней части черепа, чтобы иметь возможность четко видеть черепа швов, чтобы направлять открытие черепа.
- Вырезать череп открытый, вставив нижний кончик маленькими ножницами через затылочного отверстия и сразу же превращая их в сторонубоковая сторона. Аккуратно разрезать вдоль бокового края теменной кости до места позади глаз и лобно-теменной шов; Затем, повернуть в направлении к центру черепа и пронизывают средней линии к другой стороне черепа (см зеленый пунктирную линию на фиг.2А).
- Использование тонких наконечников щипцов, поднимите череп с лобно-теменной углу и потяните его по диагонали вверх и в сторону, чтобы выставить на мозг (см желтый пунктирной стрелкой на рисунке 2а). Убедитесь, что череп не привязан к какой-либо кости или кожу головы, так что мозг будет оставаться на месте, когда череп поднимается. В случае, что мозг движется с черепом, использовать маленькие ножницы, чтобы удалить любой соединительной ткани между черепа и мозга.
- Когда мозг подвергается, не позволяют мозгу быть сухим. Таким образом, выполнить следующие шаги, сохраняя при этом череп и мозг в чашку Петри, наполненную нагревают, газом SPS.
- Снимите часть мозга, используемый для электроннойXperiment от остальной части головного мозга с использованием скальпель и шпателя. В случае использования в мозжечок, оторваться от переднего мозга с помощью одного надреза по мозга и моста (вдоль красных линий в рисунках 2B-D) и переместить его в небольшой чашке Петри, содержащей свежий, газом SPS.
- Снимите ствол мозга образовывать прямую и широкую базу для склеивания мозг резки этап, когда нарезка мозжечок в горизонтальной плоскости. Кратко разместить мозжечок на мокрой кусочек фильтровальной бумаги так, чтобы та сторона, которая была вырезана из переднего мозга направлена вниз.
- Вырезать ствол мозга с помощью скальпеля, чтобы сформировать базу (как указано с синей линии в рисунке 2B), и вернуться в мозжечок к СПС. Когда другие самолеты резки необходимы, отделка мозжечка блок соответственно (синие линии на рисунках 2С & D).
3. нарезки мозг
- Подготовьте почву резания на выяснение, что это DRy, перед нанесением небольшую каплю суперклея в середине стадии.
- Поднимите блок головного мозга от СПС, используя шпатель с правильной стороной вверх, и удалите лишнюю жидкость из мозга с помощью маленьких кусочков фильтровальной бумаги. Тогда, одним движением, сдвиньте мозг от шпателя на каплю клея на сцене.
- Чтобы предотвратить мозг от сушки и клей от работы на боковых сторонах ткани, применить несколько капель SPS с помощью пипетки Пастера и помещают в стадию резки в камере нарезки. Совместите блок мозга таким образом, что регионы интерес (например, коры мозжечка) сталкиваются лезвие и, таким образом, будут подвергаться наименьшим количеством механического давления, прежде чем нарезанный.
- Разрежьте каждый ломтик в соответствии с инструкциями изготовителя, постоянно газом СПС в камеру дробления, а также поддерживая температуру 34-37 ° С. Поддержания температуры рабочей камеры в этом диапазоне, заполнив EXTERNаль палата резки с подогретой очищенной воды и замены воды, когда температура падает слишком низко.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры нарезки должны быть экспериментально обнаружено для каждого типа ткани и нейронов, которые находятся на рассмотрении. В случае Кэмпден SMZ 700 ломтерезки с керамическими лопатками и мозжечковых клетках Гольджи, используют 0,75 мм амплитуду колебаний на 65 Гц и наступающей скорость 0,05 мм / с; для мозжечковые нейроны ядерные более высокой амплитудой и частотой (1 мм и 90 Гц соответственно) и более низкой скорости заранее (0,01-0,02 мм / сек) рекомендуется. Для обоих Гольджи и мозжечка ядерных нейронов, толщина среза должна быть 300 мкм. - Во время нарезки, не позволяют ломтики сложить на себя. Избежать этого можно, мягко поддерживая их с помощью мягкой щетки, предпочтительно касаясь кусочек только в регионах, которые не представляют интереса для эксперимента. Позаботьтесь, чтобы предотвратить кисть от прикосновения к vibratome лезвие; особенно в случае керамических лопастей, даже легкий контактможет повредить лопасти.
- Перемещение каждый кусочек от нарезки камеры для восстановления / проведение камеру, используя широкий рот, огневой полировкой стекла пипетки Пастера.
- Пусть ломтики отдохнуть в камере в течение не менее 1 часа перед началом эксперимента. Это позволяет деградации поврежденных или умирающих тканей и клеток, и, таким образом, приводит к более чистой поверхности среза. В течение первого часа, поддерживая температуру СПС в камере в диапазоне 34-36 ° С; гарантировать, что ломтики не тронут пузырьков воздуха, которые могут повредить ломтики или делают их плавать.
4. Эксперимент
- После 1 часа, пусть температура камера регенерации остыть до комнатной температуры (17-25 ° С).
Примечание: Это может продлить период времени, в течение которого ломтики могут быть использованы, замедляя рост бактерий, а также клеточный метаболизм. Этот период зависит от области мозга и типа клеток. Например, некоторые виды Гольджи клеток можно найти, чтобы быть здоровым в срезах8 ч после резки в то время как другие виды длиться только 6 ч. - После 1 ч прошло с нарезки, использовать ломтики для различных электрофизиологических экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Кусочки, приготовленные описанным способом могут быть использованы для различных электрофизиологических и optogenetic экспериментов. На рисунке 3А и 3В, мы показываем типичный пример горизонтальной мозжечка срез и корональной коры головного мозга срез, соответственно, если смотреть под дифференциал помех (DIC) оптики. В мозжечка срез, несколько типов нейронов мозжечка можно легко узнать по их форме местоположение и клеточной тела, позволяя направлены электрофизиологические записи. В 3В и 3D, пример следы от цельноклеточных записей патч-зажим в текущем режиме зажим из спонтанно активных мозжечка Гольджи клетки и коркового пирамидальной клетки показаны. Другие примеры качества электрофизиологических и optogenetic записей, полученных от горячей нарезанный мозгов можно найти в Huang и Uusisaari 11 и Lefler др. 16.
| Концентрация [мм] | вес (г / л) | |
| NaCl | 124 | 72,5 |
| KCl | 3 | 2.23 |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | 1.63 |
| MgSO 4 * 6H 2 O | 1,9 | 4.3 |
| Глюкоза | 20 | 3.6 |
| NaHCO 3 | 26 | 2.18 |
| CaCl 2 | 2 | 1,109 |
Таблица 1. Состав стандартной физиологического раствора.
Рисунок 1. Композиция из инструментов. 1. Большие ножницы, 2. Малые хирургические ножницы, 3. скальпеля с лезвием № 11, 4. тонкий пинцет наконечник, 5. Малый шпатель, 6. посуда Малый Петри, 7. стеклянный стакан для деионизированной воды, 8. стеклянный стакан для подогретой Гассеd физиологический раствор, 9. Супер клей, 10. Тонкая кисть, 11. пипетки Пастера, 12. Малый шприц, 13. Пентобарбитал, 14. Для этого бумагу, 15. Резка этап.
. Рисунок 2. Схематическое изображение черепа и головного мозга рассечения () Рисование изображающая открытие черепа подвергать мозг (B - D). Чертежи, описывающие самолеты резки мозг для трех основных плоскостях срезов. Синяя линия представляет собой плоскость, на которую мозг будет приклеена на.
Рисунок 3. Типичные результаты метода. (А) горизонтальная мозжечковая ломтик оbtained с демонстрируемой метода. Три основные слои коры мозжечка (слой ЗК, ГК слой; Пуркинье нейрон слоя, PN слой; молекулярный слой, ML), а также белое вещество (WM) указаны. Патч-зажим электрода схематически отображен на Гольджи клетки (ГПЦ) (масштаб бар: 40 мкм). (Б) пример записи из клетки Гольджи, показанном на A. записи, полученной с патч-зажим электрода в текущем зажима Режим. (В черный: представитель след из шести серых следов). (С) корональной коры головного мозга срез, полученный с продемонстрированной метода. Кортикальные пирамидальные клетки показаны вместе со схематическим рисунком на патч-зажим электрода. Запись зажим (D) пример патч, в текущем режиме зажим, с пирамидальной клетки, показанной на (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Показано, способ получения острых срезах мозга мышей в физиологическом вместо ледяной температуры.
Было показано 11, что качество срезов, полученных в теплых условиях превосходит по сравнению с теми, подготовлен с холодных условиях, при условии, что резки лезвие имеет минимальную вертикальную вибрацию. Нарезка в физиологической температуре может предотвратить физиологические артефакты, вызванные низкой температурой, например, те, которые связаны с изменениями в обменных процессах 17-19, которые могут проявиться в аберраций одноклеточных, а также поведения сети. Кроме того, даже при том, что процедура нарезки, очевидно, должно быть завершено без лишних задержек, нет необходимости спешить с нарезки (как это, когда нарезка в ледяных условиях, чтобы закончить резку до решения стала слишком теплой, и, чтобы предотвратить Ущерб от длительный замораживания ткани). Таким образом, более медленные скорости резания может быть намиздание Это может быть полезным в случае нарезки очень тонких структур. Последнее, опуская стадии охлаждения обоих растворов и головного мозга значительно уменьшает количество времени, необходимого для процедуры, а также его сложность. Охлаждение решения ледяной температуры требуется примерно 40 мин больше, чем потепление решения физиологической температуре, оставляя больше времени для самого эксперимента.
Было показано, что 20 интенсивность флуоресценции в корковых нейронов в GAD67-GFP мышей сильнее при рассмотрении ломтики разрезать на 20 ° C по сравнению с теми, сократить в 0 ° С. Это еще больше подтверждает мнение, что нарезка в ледяной температуры оказывает вредное в эт uence на жизнеспособность нейронов. С другой стороны, в той же работе было показано, что плотность нейронов флуоресцентных была снижена в нарезанный получены при 37 ° С по сравнению с теми, сократить при 20 ° С. Спор с результатами может АриSE из того, что Z-отклонение не был взят под соображений. Как упоминалось выше, Z-отклонение имеет сильное влияние на качество ткани при нарезки в физиологической температуре, в дополнение к качеству лезвия и скорости и других настроек резки.
Одним из важнейших элементов процедуры включает в себя тонкую настройку Слайсер лезвия до нарезки. В отличие при использовании ледяные решения, где нарезка всего охватывает как горизонтальные резку, а также вертикальная "взлома" из жестких липидных мембран, в физиологических условиях любое движение лезвия слайсера в направлении г может привести к повреждению в ткани. Чтобы свести к минимуму этот, лезвие должно быть так сложно, и по возможности прямой; в нашем опыте, обычные ножи бритва слишком много недостатков, чтобы быть полезной. Высококачественные лезвия из нержавеющей стали, специально разработанные для vibratome использования лучше, но для достижения лучших результатов мы предлагаем один-скошенный СерамIC лезвия. Кроме того, мы настоятельно рекомендуем проводить значительное время для идеального выравнивания по горизонтали лопастей как это напрямую влияет на качество среза. Мы используем срез Campden 700SMZ, что позволяет настройку выравнивания лезвия, так что вибрация в плоскости г составляет менее 0,5 мкм. В самом деле, наиболее важным недостатком метода горячей нарезки является его зависимость от качества резки лезвия и стабильности. Если эти требования не могут быть удовлетворены, то целесообразно использовать традиционный метод резки ледяной вместо этого, несмотря на недостатки в нарезая в ледяной решения, такие как изменения осмолярности от того, частично заморожены.
Метод продемонстрировал используется для получения горизонтальных ломтиков мозжечка; с простыми изменениями и тот же метод может быть использован для получения срезов в любом короны или сагиттальной плоскости, от многих других регионов на первый план - или среднего мозга, а также ствола мозга. Для ломтиками самых передних отделах переднего мозга и Olfactрии система, череп должны быть сокращены более передним, чтобы предотвратить повреждение этих частей. Мы целенаправленно продолжать метод, как простыми и короткими, насколько это возможно, и не используют предварительный перфузию животного, а также не подставить какие-либо компоненты в физиологическом растворе для резки. Это позволяет метод должен быть изменен в зависимости от конкретного нейронального подтипа интерес. Вполне вероятно, что модификации режущих решений (как описано в ссылках в введении) может дополнительно улучшить жизнеспособность срезов и надежность результатов. В общем, способ должен быть совместим с большинством других общих физиологических растворов, обычно используемых для электрофизиологические записи.
В способе, показанном здесь, ломтики разрезают толщиной 300 мкм. Оптимальная толщина среза зависит от нарезанный области мозга и клеток, представляющих интерес. Для соображений целостности сети, ломтики не должны быть тоньше, чем 250 мкм, и из-за диффузионных ограничений доза предел толщины среза составляет ~ 400-450 мкм.
Важным шагом в этом методе касается приклеивания мозг на сцену резки, так как даже небольшая нестабильность в ткани может привести к неровной или непригодных ломтиками. Таким образом, следует соблюдать осторожность, чтобы убедиться, что поверхность головного мозга не имеет избыточную SPS, когда она опускается на капли клея; Также, слишком много клея приведет мозг лежал неровно на сцене и, возможно, снятие со сцены во время нарезки. Кроме того, избыток клея может ползти по бокам ткани и, в дополнение к введению неоднородность в срезах, могут повредить лопасти.
Есть несколько трудностей, которые могут расти, когда изменения протокола нарезки из метода ледяной на продемонстрированной горячим способом. Одна из трудностей является появление бактерий в срезах. По этой причине важно, чтобы дезинфицировать инструменты, камеры, и нарезки ванну с этанолом до процедуры. Кроме того, обращаясьот системы отопления в ванной восстановления после 1 часа замедляет рост бактерий.
Наконец, следует подчеркнуть, что улучшение здоровья нейронов в срезах, вырезанных в физиологической температуре может также привести к изменениям в их внутренних свойств. Поэтому, желательно, чтобы выполнить начальную сравнение полученных результатов с ломтиками с обеих холодных и теплых методов, особенно если эксперименты являются частью более длительного проекта с более ранних работ, выполненных с использованием холодного метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg/ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M.
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , 2nd edition, Company of Biologists. Cambridge, UK. (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
