Abstract
Aquí se presenta un protocolo para la preparación de cortes de cerebro agudas. Este procedimiento es un elemento crítico para los experimentos de patch-clamp electrofisiológicos que determina en gran medida la calidad de los resultados. Se ha demostrado que la omisión de la etapa de enfriamiento durante el procedimiento de corte es beneficioso en la obtención de rebanadas y las células sanas, especialmente cuando se trata de estructuras cerebrales altamente mielinizadas de animales maduros. Aunque el mecanismo exacto por el que la temperatura elevada favorece la salud de los nervios sólo puede especular sobre, es lógico pensar que, siempre que sea posible, la temperatura en la que se realiza el corte debe estar cerca de las condiciones fisiológicas para evitar los artefactos relacionados con la temperatura. Otra ventaja importante de este método es la simplicidad del procedimiento y por lo tanto el tiempo de preparación corto. En el método demostrado se utilizan ratones adultos pero el mismo procedimiento se puede aplicar con ratones más jóvenes, así como las ratas. También, las siguientes cl parcheamp experimento se realiza en rebanadas horizontales cerebelosos, pero el mismo procedimiento se puede utilizar también en otros planos, así como otras áreas posteriores del cerebro.
Introduction
El objetivo del método presentado es conseguir cortes de cerebro agudos de alta calidad para experimentos electrofisiológicos in vitro, especialmente cuando se utiliza adulto o incluso los animales de edad.
El método de corte cerebral agudo, tal como se describe por Skrede y Westgaard 1 en dos frases elegantes, se ha convertido en uno de los fundamentos de la investigación de la neurociencia moderna y está empleado en innumerables variaciones en todo el mundo. La calidad de las rodajas se refleja en el número de neuronas por rebanada viviente, el período de tiempo durante el cual las células mantienen sus propiedades electrofisiológicas y morfológicas, así como en la integridad del tejido. Además, la duración máxima para las grabaciones estables depende de la calidad de las rodajas. Por lo tanto, a lo largo de las décadas, el método de la división original ha sido desarrollado por los grupos individuales de investigación para mejorar la recuperación después de cortar la rebanada 2-10, a menudo por modificaciones complejas de la composición de corte osoluciones de recuperación r (tales como la adición de ascorbato, tiourea o incluso H 2 O 2), así como pre-perfusión intra-cardiaca del animal con soluciones fisiológicas enfriado.
Como se ha demostrado recientemente 11, temperatura fisiológica durante el corte parece ser más beneficiosa que la refrigeración para la salud neuronal; la mejora es más notable cuando se trabaja con adultos (2-8 meses) los roedores. Evitar cambios drásticos de temperatura evita artefactos debido a los procesos dependientes de la temperatura en las células, tales como la plasticidad y 13 canales de iones cinética de 13,14. Tales cambios podrían influir en la tensión de la membrana y la señalización del calcio intracelular, el umbral de pico y pico de forma.
El método "caliente" rebanada aguda preparación que aquí se presenta es un procedimiento general para la obtención de cortes de cerebro agudos de alta calidad desde cualquier región del cerebro, incluyendo el cerebelo, la corteza y el hipocampo, núcleos de helio tronco cerebral 16 </ Sup> así como el bulbo olfatorio, tanto en ratas y ratones.
En particular, el procedimiento de corte en lonchas temperatura fisiológica requiere que la cuchilla de corte vibra casi perfectamente horizontal y es sin defectos estructurales. Tal precisión podría no ser alcanzable con los modelos de máquina de cortar de edad avanzada; en tales casos, se recomienda la realización de la preparación rebanada en condiciones de congelación frío como la temperatura baja parece tener el tejido más resistente a los daños mecánicos, aunque a costa de las aberraciones metabólicas.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales descritos en este protocolo fueron aprobados por Cuidado de Animales de la Universidad Hebrea y el empleo.
1. Preparación de las soluciones y herramientas para rebanar
- Preparar 1 L de solución fisiológica estándar (SPS) que contiene los iones descritos en la Tabla 1.
- Preparar una solución madre que contiene las sales en 10 veces la concentración final de antemano en una botella de vidrio de almacenamiento lleno de 1000 ml de agua desionizada (conductancia de 0,055 mS / cm). Añadir sales (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, y MgSO4), y revuelva hasta que se disuelva por completo. Guarde la solución madre en 4 ° C.
- Hacer la solución final MSF en el día del experimento. Añadir 100 ml de la solución madre a 700 ml de agua purificada, disolver la glucosa (3,6 g) y NaHCO3 (2,18 g) usando una barra de agitación magnética y luego añadir agua purificada hasta 1 L.
- Equilibrar los solutien por gaseamiento con 95% O2 / 5% de CO 2 durante ~ 20 min. Después de esto, añadir 2 ml de solución M CaCl 2 1.
- Montar las herramientas siguientes (Figura 1).
- Prepare grandes tijeras u otra herramienta para la decapitación, pequeñas tijeras quirúrgicas para abrir el cráneo, fórceps de punta fina para levantar el cráneo para exponer el cerebro, con hoja de bisturí para diseccionar la parte deseada del cerebro para ser cortado en lonchas y una pequeña espátula para manipular la partes del cerebro disecados.
- Además, preparar pequeños trozos de papel de filtro para eliminar el exceso de líquido del cerebro, dos pequeñas placas de Petri para el cerebro para ser diseccionados en dos vasos de precipitados de vidrio de 500 ml para contener agua caliente y MSF purificado, y el pegamento de cianoacrilato para pegar el cerebro a la etapa de corte.
- Preparar un pequeño cepillo para el manejo de las rebanadas durante el corte en lonchas y una pipeta Pasteur de vidrio de boca ancha para mover las rebanadas del baño de corte para el cha recuperaciónmbre. Desinfectar las herramientas para prevenir el crecimiento de bacterias en los baños rebanada cálidos. Por otra parte, el uso de guantes de laboratorio limpios.
- Preparar una cámara de recuperación rebanada sumergida tal como se describe por Gibb y Edwards 15. Continuamente gas del SPS en ella con un 95% de O 2/5% de CO 2 y mantener a 36 ° C. Asegúrese de que el gaseamiento no da lugar a pequeñas burbujas atrapadas en el baño que podría dañar las rebanadas.
- ~ Caliente de 300 ml de la MSF a 36 ° C en una placa de calefacción con agitador magnético o en un baño de agua. Si se utiliza una placa de calefacción, tenga cuidado para evitar que la solución de un sobrecalentamiento, lo que puede dar lugar a la precipitación de iones. En caso de que suceda, cálidos MSF frescas en lugar de enfriar la antigua.
- Llevar ~ 500 ml de agua purificada a ebullición usando un hervidor de agua eléctrico y, en un vaso de precipitados, se combinan 300 ml de la misma con agua fría para obtener agua ligeramente más caliente que la temperatura de corte. Utilice esta calentó agua purificada durante la decapitación y el uso de la RemaiNing del agua hervida posteriormente para mantener la temperatura fisiológica del baño de corte.
- Anestesiar el ratón mediante la inyección de 0,1 ml de pentobarbital (60 mg / ml) por vía intraperitoneal. Después de unos minutos comprobar que el animal no responde a los fuertes de los pies o la cola pellizcos para determinar la falta de sensación.
2. Disección del cerebro
- Decapitar el ratón rápidamente cortando el cuello con las grandes tijeras cerca de la parte posterior del cráneo, y dejó que la cabeza caiga en el vaso con agua purificada caliente para enjuagar el exceso de sangre.
- Exponer el agujero occipital en el cráneo debajo de los músculos del cuello y la piel, posiblemente, la eliminación de más del cuello con las tijeras pequeñas.
- Tire de la piel en la parte superior del cráneo para ser capaz de ver claramente las suturas del cráneo con el fin de guiar la abertura del cráneo.
- Cortar el cráneo abierto mediante la inserción de la punta inferior de las tijeras pequeñas a través del agujero magno y de inmediato convertirlos haciael lado lateral. Cortar suavemente a lo largo del borde lateral del hueso parietal hasta un lugar detrás de los ojos y la sutura frontoparietal; a continuación, girar hacia el centro del cráneo y cortar a través de la línea media al otro lado del cráneo (véase la línea discontinua verde en la Figura 2A).
- Con unas pinzas de punta fina, levante el cráneo desde la esquina frontoparietal y tire de ella en diagonal hacia arriba y hacia los lados para exponer el cerebro (ver flecha amarilla discontinua en la Figura 2A). Asegúrese de que el cráneo no está conectado a ningún hueso o la piel de la cabeza, por lo que el cerebro se mantendrá en su lugar cuando se levantó el cráneo. En caso de que el cerebro se está moviendo con el cráneo, utilizar las tijeras pequeñas para retirar cualquier tejido conectivo entre el cráneo y el cerebro.
- Cuando se expone el cerebro, no permita que el cerebro esté bien seco. Por lo tanto, lleve a cabo los siguientes pasos mientras se mantiene el cráneo y el cerebro en una placa de Petri llena de calentado, gaseados MSF.
- Separe la parte del cerebro que se utiliza para el correoXperiment del resto del cerebro usando un escalpelo y una espátula. En caso de utilizar el cerebelo, desprenda del cerebro anterior por un solo corte a través del mesencéfalo y protuberancia (a lo largo de líneas rojas en las figuras 2B-D) y moverlo a una pequeña placa de Petri que contiene frescos, gaseados MSF.
- Retire el tronco cerebral para formar una base recta y ancha para pegar el cerebro para cortar etapa al rebanar el cerebelo en el plano horizontal. Brevemente colocar el cerebelo en un trozo de papel de filtro húmedo de manera que el lado que fue cortado de la prosencéfalo esté orientada hacia abajo.
- Cortar el tallo cerebral con un bisturí para formar la base (como se indica con la línea azul en la Figura 2B), y devolver el cerebelo a la MSF. Cuando se necesitan otros planos de corte, recorte el bloque cerebelo en consecuencia (líneas azules en las figuras 2C y D).
3. Cortando el Cerebro
- Preparar la etapa de corte determinando que es dry, antes de aplicar una pequeña gota de pegamento en el centro del escenario.
- Levante el bloque de cerebro de la SPS utilizando una espátula con correcto hacia arriba, y eliminar el exceso de líquido del cerebro utilizando pequeños trozos de papel de filtro. Luego, con un solo movimiento, deslice el cerebro de la espátula sobre la gota de pegamento en el escenario.
- Para evitar que el cerebro de secado y el pegamento de corriendo hacia arriba en los lados del tejido, se aplican unas pocas gotas de SPS con una pipeta Pasteur y colocar la etapa de corte en la cámara de corte. Alinear el bloque de cerebro, de modo que las regiones de interés (por ejemplo, la corteza cerebelar) se enfrentan a la hoja y por lo tanto serán sometidos a menor cantidad de presión mecánica antes de ser cortado.
- Cortar cada rebanada de acuerdo con las instrucciones del fabricante mientras que constantemente gasificación al SPS en la cámara de corte, así como manteniendo la temperatura a 34-37 ° C. Mantener la temperatura de la cámara de corte en este rango llenando el external cámara de la máquina de cortar con agua purificada calentada y reemplazar el agua cuando la temperatura baja demasiado.
NOTA: Los parámetros de corte en lonchas deben ser encontrados experimentalmente para cada tipo de tejido y las neuronas que están siendo examinadas. En el caso de la máquina de cortar Campden SMZ 700 con cuchillas de cerámica y células de Golgi del cerebelo, utilice 0,75 mm amplitud de la vibración a 65 Hz y velocidad de avance de 0,05 mm / seg; para las neuronas cerebelosas nucleares mayor amplitud y frecuencia (1 mm y 90 Hz, respectivamente) y velocidad de avance más lenta (0,01-0,02 mm / seg) se recomienda. Por tanto Golgi y las neuronas cerebelosas nucleares, grosor de corte debe ser de 300 micras. - Durante el corte, no permita que las rebanadas se plieguen sobre sí mismos. Para prevenir esto, apoyando suavemente con un cepillo suave, tocando preferentemente la rebanada sólo en regiones que no son de interés para el experimento. Tenga cuidado para evitar que el cepillo toque la cuchilla vibratome; especialmente en el caso de las hojas de cerámica, incluso un ligero contactopuede dañar la hoja.
- Mueva cada rebanada de la cámara de corte para una recuperación / celebración de cámara utilizando una boca ancha, Pasteur de vidrio pipeta pulida al fuego.
- Deje que las rebanadas de descanso en la cámara durante al menos 1 hora antes de comenzar el experimento. Esto permite la degradación de los tejidos y las células dañadas o moribundas y por lo tanto resulta en una superficie de loncha más limpio. Durante la primera hora, mantener la temperatura de la SPS en la cámara en el intervalo de 34-36 ° C; asegúrese de que las rebanadas no son tocados por las burbujas de aire que pueden dañar las rodajas o hacer flotar.
4. Experimento
- Después de 1 hora, deje que la temperatura de la cámara de recuperación se enfríe a temperatura ambiente (17-25 ° C).
NOTA: Este podría prolongar el período de tiempo durante el cual las rebanadas se pueden utilizar por ralentizar el crecimiento de bacterias, así como el metabolismo celular. Este periodo depende de la región del cerebro y tipo de célula. Por ejemplo, ciertos tipos de células de Golgi se pueden encontrar para estar sano en rodajas8 hr después de cortar mientras que otros tipos durar sólo 6 hr. - Después de 1 hora ha pasado de la corte, utilizar las rodajas de varios experimentos electrofisiológicos.
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Representative Results
Rebanadas preparadas en la forma descrita se puede utilizar para diversos experimentos electrofisiológicos y optogenética. En la Figura 3A y 3C, se muestra un ejemplo representativo de una rebanada horizontal cerebelosa cortical y una rebanada coronal cerebral, respectivamente, se observa bajo (DIC) óptica de interferencia diferencial. En el trozo del cerebelo, varios tipos de neuronas del cerebelo pueden ser fácilmente reconocidos por su forma y localización de células del cuerpo, lo que permite registros electrofisiológicos dirigidos. En la Figura 3B y 3D, ejemplo de traza de células enteras patch-clamp grabaciones en el modo de pinza de corriente de una célula de Golgi cerebelosa espontáneamente activo y de células piramidales corticales se muestran. Otros ejemplos de la calidad de las grabaciones electrofisiológicas y optogenética obtenidos a partir de cerebros-rodajas calientes se pueden encontrar en Huang y Uusisaari 11 y Lefler et al. 16.
| concentración [mm] | peso (g / L) | |
| NaCl | 124 | 72.5 |
| KCl | 3 | 2.23 |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | 1.63 |
| MgSO4 * 6H 2 O | 1.9 | 4.3 |
| Glucosa | 20 | 3.6 |
| De NaHCO3 | 26 | 2.18 |
| CaCl 2 | 2 | 1.109 |
Tabla 1. Composición de la solución fisiológica estándar.
Figura 1. Disposición de las herramientas. 1. Grandes tijeras, tijeras pequeñas 2. quirúrgicos, 3. bisturí con hoja # 11, 4. pinzas de punta fina, 5. pequeña espátula, 6. pequeños platos de Petri, 7. vaso de vidrio para el agua desionizada, 8. vaso de vidrio para Gasse calentadod solución fisiológica, 9. Super Glue, 10. pincel fino, 11. pipeta Pasteur, 12. Pequeño jeringa, 13. El pentobarbital, 14. Filtro de papeles, 15. etapa de corte.
. Figura 2. Representación esquemática de la disección cráneo y el cerebro (A) Dibujo que representa la abertura del cráneo para exponer el cerebro (B - D). Dibujos esquemáticos que describen los planos de corte del cerebro para los tres planos principales de rebanar. La línea azul representa el plano sobre el cual el cerebro se pueden pegar en.
Figura 3. Los resultados representativos del método. (A) una rebanada horizontal o cerebelosabtained con el método demostrado. Las tres capas principales de la corteza cerebelosa (capa de células gránulo, la capa de GC; neurona de la capa de Purkinje, la capa de PN; capa molecular, ML), así como la materia blanca (WM) se indican. Un electrodo de patch-clamp se dibuja esquemáticamente en una célula de Golgi (GdC) (barra de escala: 40 micras). (B) Ejemplo de grabación de Golgi de la célula se muestra en A. La grabación se obtiene con un electrodo de patch-clamp en la corriente-clamp de modo. (En negro: trace representante de cada seis huellas grises). (C) una rebanada cortical cerebral coronal obtenidos con el método demostrado. Células piramidales corticales se muestran junto con un dibujo esquemático de un electrodo de patch-clamp. Grabación abrazadera (D) ejemplo de parche, en el modo de pinza de corriente, a partir de la célula piramidal se muestra en (C). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de este figura.
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Discussion
Se demuestra un método para la preparación de cortes de cerebro de ratones agudas en lugar de la temperatura fisiológica enfriada con hielo.
Se ha demostrado 11 que la calidad de las rebanadas obtenidas en condiciones de calor es superior en comparación con los preparados con condiciones de frío, a condición de que la cuchilla rebanadora tiene vibración vertical mínima. El rebanar de la temperatura fisiológica puede evitar artefactos fisiológicos causados por la baja temperatura, tales como los relacionados con los cambios en los procesos metabólicos 17-19 que pueden manifestarse en las aberraciones de una sola célula, así como el comportamiento de la red. Además, aunque el procedimiento de corte en lonchas, obviamente, debe ser completado sin demoras innecesarias, no hay necesidad de prisa con el corte en lonchas (como lo es al rebanar en condiciones de frío de hielo con el fin de terminar de cortar antes de soluciones se calientan demasiado, y para impedir la los daños causados por la congelación de larga duración de los tejidos). Por lo tanto, más lentas velocidades de corte pueden ser nosotrosed. Esto puede ser beneficioso en caso de corte de estructuras muy delicadas. Última, omitiendo la etapa de enfriamiento de ambos las soluciones y del cerebro reduce significativamente la cantidad de tiempo requerido para el procedimiento, así como su complejidad. El enfriamiento de la solución a temperatura enfriada con hielo requiere aproximadamente 40 min más que el calentamiento de la solución a la temperatura fisiológica, dejando más tiempo para el propio experimento.
Se ha demostrado 20 que la intensidad de fluorescencia en las neuronas corticales en ratones-GAD67 GFP es más fuerte cuando se examina rebanadas cortadas en 20 ° C en comparación con aquellos cortar en 0 ° C. Esto apoya la idea de que rebanar en la temperatura fría de hielo ejerce una influencia perjudicial sobre la viabilidad de las neuronas. Por otro lado, en el mismo documento se demostró que la densidad de las neuronas fluorescentes se redujo en el queso rebanado obtenido a 37 ° C en comparación con aquellos cortar a 20 ° C. La controversia con los resultados podría arise a partir de el hecho de que el z-deflexión no fue tomada en virtud de consideraciones. Como se mencionó anteriormente, el Z-deflexión tiene una fuerte influencia en la calidad del tejido al rebanar de la temperatura fisiológica, además de la calidad de la cuchilla y la velocidad y otros ajustes de la máquina de cortar.
Una de las partes cruciales del procedimiento implica la puesta a punto de la máquina de cortar la hoja antes de cortar. A diferencia de cuando se utiliza soluciones frías de hielo donde el corte en lonchas probablemente implica tanto de corte horizontal así como vertical "cracking" de las membranas de lípidos rígidos, en condiciones fisiológicas cualquier movimiento de la cuchilla de la máquina de cortar en la dirección z puede causar daños en el tejido. Para minimizar esto, la hoja debe ser tan duro y directo como sea posible; en nuestra experiencia, hojas de afeitar convencionales tienen demasiadas imperfecciones para ser utilizable. Cuchillas de acero inoxidable de alta calidad diseñados específicamente para el uso vibratome son mejores, pero para obtener mejores resultados que sugieren Ceram solo biseladocuchillas ic. Además, le recomendamos pasar tiempo significativo para la alineación horizontal perfecta de las hojas, ya que esto influye directamente en la calidad del corte. Usamos la máquina de cortar Campden 700SMZ que permite el ajuste de la alineación de la cuchilla de modo que la vibración en el plano z es inferior a 0,5 micras. De hecho, la limitación más importante del método de corte en caliente es su dependencia de la calidad de la máquina de cortar la hoja y la estabilidad. Si no se pueden cumplir estos requisitos, es aconsejable utilizar el método de corte en frío con hielo tradicional en lugar, a pesar de las desventajas en rebanar en solución enfriada con hielo tales como variar la osmolaridad de ser parte congelada.
El método demostrado se utiliza para obtener rebanadas horizontales del cerebelo; con modificaciones sencillas el mismo método puede ser utilizado para obtener rebanadas ya sea en el coronal o el plano sagital, a partir de muchas otras regiones del primer plano - o cerebro medio así como el tronco cerebral. Para rebanadas de las partes más anterior del cerebro anterior y olfactsistema ORY, el cráneo se debe cortar más anterior para evitar daños a estas partes. Nos mantenemos deliberadamente el método más simple y más corto posible y no empleamos pre-perfusión del animal, ni tampoco sustituimos los componentes en la solución fisiológica para el corte. Esto permite que el método que se modifica de acuerdo con el subtipo neuronal específica de interés. Es probable que las modificaciones de las soluciones de corte (como se describe en las referencias en la introducción) pueden mejorar aún más la viabilidad de las rebanadas y la solidez de los resultados. En general, el método debería ser compatible con la mayoría de otras soluciones fisiológicas comunes usados comúnmente para registro electrofisiológico.
En el método que se muestra aquí, se cortan rebanadas de 300 m de espesor. El espesor óptimo rebanada depende de la región del cerebro en rodajas y las células de interés. Por consideraciones de integridad de la red, las rebanadas no deben ser más delgado que 250 micras, y debido a limitaciones de difusión hasta lapor límite del grosor de corte es ~ 400-450 micras.
Un paso crítico en este método se refiere a pegar el cerebro a la etapa de corte, ya que incluso pequeñas inestabilidad en el tejido puede resultar en rodajas desiguales o inutilizables. Por lo tanto, se debe tener cuidado para asegurarse de que la superficie del cerebro no tiene exceso de MSF cuando se baja sobre la gota de pegamento; También, el exceso de pegamento se traducirá en el cerebro miente de manera desigual en el escenario y posiblemente se separe de la fase durante el rebanado. Además, el exceso de pegamento puede arrastrarse para arriba en los lados del tejido y, además de la introducción de la falta de homogeneidad en las rodajas, podría dañar la cuchilla.
Hay algunas dificultades que podrían elevarse al cambiar el protocolo de corte a partir del método helada con el método caliente demostrado. Una de las dificultades es la aparición de bacterias en los cortes. Por esta razón, es importante para la desinfección de las herramientas, la cámara, y el baño de corte en lonchas con etanol antes del procedimiento. También, girandoapagar el sistema de calefacción en el baño de la recuperación después de 1 hora ralentiza el crecimiento de bacterias.
Finalmente, debe hacerse hincapié en que la mejora de la salud de las neuronas en rodajas cortadas en la temperatura fisiológica también puede resultar en cambios en sus propiedades intrínsecas. Por lo tanto, es aconsejable realizar una comparación inicial de los resultados obtenidos de rebanadas con ambos métodos fríos y calientes, especialmente si los experimentos son parte de un proyecto más largo con trabajos anteriores realizados utilizando el método de frío.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg/ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
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