Abstract
यहाँ हम तीव्र मस्तिष्क के स्लाइस की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. यह प्रक्रिया काफी हद तक परिणामों की गुणवत्ता निर्धारित करता है कि electrophysiological पैच दबाना प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व है. यह प्रक्रिया काटने के दौरान ठंडा कदम omitting परिपक्व जानवरों से अत्यधिक मेलिनकृत मस्तिष्क संरचना के साथ काम है, खासकर जब स्वस्थ स्लाइस और कोशिकाओं प्राप्त करने में लाभकारी है कि दिखाया गया है. ऊंचा तापमान केवल पर अनुमान लगाया जा सकता है तंत्रिका स्वास्थ्य का समर्थन करता है जिससे सटीक तंत्र, यह है कि कारण खड़ा हालांकि, जब भी संभव हो, टुकड़ा करने की क्रिया किया जाता है जिसमें तापमान तापमान संबंधित कलाकृतियों को रोकने के लिए शारीरिक स्थितियों के करीब होना चाहिए. इस पद्धति का एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ प्रक्रिया की सादगी और इसलिए कम तैयारी समय है. प्रदर्शन विधि में वयस्क चूहों का इस्तेमाल किया जाता है, लेकिन एक ही प्रक्रिया युवा चूहों के साथ ही चूहों के साथ लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, निम्न पैच सीएलamp के प्रयोग क्षैतिज अनुमस्तिष्क स्लाइस पर किया जाता है, लेकिन एक ही प्रक्रिया भी अन्य विमानों के साथ-साथ मस्तिष्क की अन्य पीछे क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
प्रस्तुत विधि का उद्देश्य विशेष रूप से वयस्क या यहां तक कि पुराने पशुओं का उपयोग करते समय, इन विट्रो electrophysiological प्रयोगों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले तीव्र मस्तिष्क के स्लाइस को मिल रहा है.
दो सुंदर वाक्य में Skrede और Westgaard 1 द्वारा वर्णित के रूप में तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया विधि, आधुनिक तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान की नींव में से एक बन गया है और दुनिया भर में असंख्य रूपों में कार्यरत है. स्लाइस की गुणवत्ता टुकड़ा प्रति न्यूरॉन्स रहने वाले की संख्या में परिलक्षित होता है, समय की अवधि के दौरान जो कोशिकाओं ऊतक की अखंडता में और साथ ही उनके electrophysiological और रूपात्मक गुण रहते हैं. इसके अलावा, स्थिर रिकॉर्डिंग के लिए अधिक से अधिक अवधि स्लाइस की गुणवत्ता पर निर्भर करता है. इस प्रकार, दशकों के साथ, मूल टुकड़ा करने की क्रिया विधि आगे काटने की रचना की जटिल संशोधनों द्वारा अक्सर 2-10, काटने के बाद टुकड़ा वसूली बढ़ाने के लिए अलग-अलग अनुसंधान समूह द्वारा विकसित ओ किया गया हैसाथ ही साथ ठंडा शारीरिक समाधान के साथ पशु का इंट्रा-हृदय पूर्व छिड़काव (जैसे एस्कॉर्बेट, Thiourea या यहां तक कि एच 2 ओ 2 जोड़ने के रूप में) आर वसूली समाधान.
हाल ही में 11 दिखाया गया है, टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान शारीरिक तापमान न्यूरोनल स्वास्थ्य के लिए ठंडा करने से ज्यादा फायदेमंद हो रहा है; वयस्क (2-8 महीने) कृन्तकों के साथ काम कर जब सुधार सबसे हड़ताली है. नाटकीय तापमान परिवर्तन से बचाव के कारण इस तरह के plasticity के 13 और आयन चैनल कैनेटीक्स 13,14 के रूप में कोशिकाओं में तापमान पर निर्भर प्रक्रियाओं, कलाकृतियों को रोकता है. इस तरह के बदलाव झिल्ली वोल्टेज और intracellular कैल्शियम संकेतन, कील दहलीज को प्रभावित है, और आकार स्पाइक सकता है.
यहाँ प्रस्तुत 'हॉट' तीव्र टुकड़ा तैयारी विधि, किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र से उच्च गुणवत्ता वाले तीव्र मस्तिष्क के स्लाइस प्राप्त सेरिबैलम, कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस, brainstem 16 नाभिक सहित के लिए एक सामान्य प्रक्रिया है </ समर्थन> के रूप में अच्छी तरह से घ्राण बल्ब के रूप में, दोनों चूहों और चूहों में.
विशेष रूप से, शारीरिक तापमान टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया काटने ब्लेड लगभग पूरी तरह से क्षैतिज vibrates और किसी भी संरचनात्मक दोषों के बिना है कि आवश्यकता है. इस तरह की परिशुद्धता पुराने स्लाइसर मॉडलों के साथ प्राप्य नहीं हो सकता है; कम तापमान चयापचय aberrations की कीमत पर, भले ही यांत्रिक क्षति के लिए ऊतक अधिक प्रतिरोधी बनाने के लिए लगता है के रूप में इस तरह के मामलों में, हम ठंड ठंड की स्थिति में टुकड़ा तैयारी प्रदर्शन की सलाह देते हैं.
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं हिब्रू विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. टुकड़ा करने की क्रिया के लिए समाधान और उपकरण तैयारी
- तालिका 1 में वर्णित आयनों युक्त मानक शारीरिक समाधान (एसपीएस) के 1 एल तैयार करें.
- विआयनीकृत पानी (0.055 μS / सेमी की प्रवाहकत्त्व) के 1,000 मिलीग्राम से भरा एक भंडारण कांच की बोतल में अग्रिम में 10 बार अंतिम एकाग्रता में लवण युक्त एक शेयर समाधान तैयार है. लवण (सोडियम क्लोराइड, KCl, के.एच. 2 पीओ 4, और MgSO 4) जोड़ें, और पूरी तरह भंग जब तक हलचल. 4 डिग्री सेल्सियस में शेयर समाधान स्टोर.
- प्रयोग के दिन पर अंतिम एसपीएस समाधान करें. चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग ग्लूकोज (3.6 ग्राम) और 3 NaHCO (2.18 छ) को भंग करने, शुद्ध पानी की 700 मिलीलीटर शेयर समाधान की 100 मिलीलीटर जोड़ें और फिर 1 एल के लिए शुद्ध पानी को जोड़ें
- Soluti संतुलित करनापर ~ 20 मिनट के लिए 95% ओ के साथ 2/5% सीओ 2 यह बक द्वारा. इस के बाद, 1 एम 2 CaCl समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
- निम्नलिखित उपकरण (चित्रा 1) इकट्ठा.
- खोपड़ी खोलने के लिए बड़ी कैंची या कत्ल के लिए अन्य उपकरण, छोटे सर्जिकल कैंची तैयार करें, मस्तिष्क को बेनकाब मस्तिष्क के वांछित हिस्सा विदारक के लिए ब्लेड के साथ स्केलपेल खोपड़ी उठाने के लिए ठीक टिप संदंश कटा हुआ और जोड़ तोड़ के लिए एक छोटा सा रंग किया जाना है विच्छेदित मस्तिष्क भागों.
- इसके अलावा, मस्तिष्क से अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए फिल्टर पेपर के छोटे टुकड़े को तैयार, मस्तिष्क के लिए दो छोटे पेट्री डिश के लिए मस्तिष्क gluing के लिए युक्त गरम शुद्ध पानी और एसपीएस, और cyanoacrylate गोंद के लिए दो गिलास 500 मिलीलीटर बीकर में विच्छेदित किया जाना है टुकड़ा करने की क्रिया मंच.
- टुकड़ा करने की क्रिया और वसूली चा को टुकड़ा करने की क्रिया स्नान से स्लाइस बढ़ने के लिए एक चौड़े मुँह गिलास पाश्चर पिपेट दौरान स्लाइस से निपटने के लिए एक छोटा सा ब्रश तैयारmber. गर्म टुकड़ा स्नान में बैक्टीरिया की वृद्धि को रोकने के लिए उपकरण कीटाणुरहित. इसके अलावा, स्वच्छ प्रयोगशाला दस्ताने का उपयोग करें.
- गिब और एडवर्ड्स 15 द्वारा वर्णित के रूप में इस तरह के एक जलमग्न टुकड़ा वसूली कक्ष तैयार करें. लगातार 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ उस में एसपीएस गैस और 36 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं. बक स्लाइस को नुकसान पहुंचा सकता है कि स्नान में फंस छोटे बुलबुले में परिणाम नहीं करता है कि सुनिश्चित करें.
- गर्म ~ चुंबकीय उत्तेजक के साथ या एक नहाने के पानी में एक हीटर प्लेट पर 36 डिग्री सेल्सियस के लिए एसपीएस के 300 मिलीलीटर. एक हीटर थाली प्रयोग किया जाता है, आयन वर्षा में हो सकता है जो overheating से समाधान, को रोकने के लिए ध्यान रखना. मामले में यह बजाय पुराने एक ठंडा करने की गर्म ताजा एसपीएस होता है.
- एक इलेक्ट्रिक केतली का उपयोग फोड़ा करने के लिए शुद्ध पानी की ~ 500 मिलीलीटर लाओ और एक बीकर में, टुकड़ा करने की क्रिया के तापमान की तुलना में थोड़ा गरम पानी प्राप्त करने के लिए ठंडे पानी के साथ यह 300 मिलीलीटर गठबंधन. इस कत्ल के दौरान शुद्ध पानी गरम प्रयोग करें और remai उपयोगबाद में टुकड़ा करने की क्रिया स्नान के शारीरिक तापमान को बनाए रखने के लिए उबला हुआ पानी की निंग.
- Intraperitoneally pentobarbital की 0.1 मिलीलीटर (60 मिलीग्राम / एमएल) इंजेक्शन द्वारा माउस चतनाशून्य. कुछ ही मिनटों के बाद पशु सनसनी की कमी का पता लगाने के लिए मजबूत पैर की अंगुली या पूंछ चुटकी का जवाब नहीं है कि जाँच करें.
2. मस्तिष्क विदारक
- खोपड़ी की पीठ के पास बड़ी कैंची से गर्दन काटने से जल्दी माउस सिर काटना, और सिर अतिरिक्त रक्त बंद कुल्ला करने के लिए गरम शुद्ध पानी के साथ बीकर में गिर जाते हैं.
- संभवतः छोटे कैंची से गर्दन की अधिक दूर करने, गर्दन की मांसपेशियों और त्वचा के नीचे खोपड़ी में रंध्र मैग्नम बेनकाब.
- स्पष्ट रूप से खोपड़ी के उद्घाटन का मार्गदर्शन करने के क्रम में खोपड़ी टांके देखने के लिए सक्षम होने के लिए खोपड़ी के शीर्ष पर त्वचा खींचो.
- रंध्र मैग्नम के माध्यम से छोटे कैंची के निचले टिप डालने और तुरंत ओर मोड़ से खुला खोपड़ी कटपार्श्व की ओर. धीरे आँखें और frontoparietal सीवन के पीछे एक स्थान पर पार्श्विका हड्डी के पार्श्व बढ़त के साथ कटौती; तो, (2A चित्रा में हरी धराशायी लाइन देखें) खोपड़ी के केंद्र की ओर मोड़ और खोपड़ी के दूसरी तरफ के midline में कटौती.
- ठीक टिप संदंश का प्रयोग, (2A चित्रा में पीले धराशायी तीर देखें) मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए बगल की ओर frontoparietal कोने से खोपड़ी उठा और तिरछे ऊपर खींच और. खोपड़ी उठाया है जब मस्तिष्क जगह में रहना होगा तो यह है कि खोपड़ी, सिर के किसी भी हड्डी या त्वचा से जुड़ी नहीं है कि सुनिश्चित करें. मस्तिष्क खोपड़ी के साथ बढ़ रहा है उस मामले में, खोपड़ी और मस्तिष्क के बीच किसी भी संयोजी ऊतक को दूर करने के लिए छोटे कैंची का उपयोग करें.
- मस्तिष्क संपर्क में है, मस्तिष्क शुष्क होने की अनुमति नहीं है. खोपड़ी और गरम से भरा एक पेट्री डिश में मस्तिष्क रखते हुए इस प्रकार, अगले चरण का पालन करें, एसपीएस मार डाला.
- ई के लिए इस्तेमाल मस्तिष्क के हिस्से को अलग करेंएक स्केलपेल और एक रंग का उपयोग मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से xperiment. सेरिबैलम का उपयोग करने के मामले में, (आंकड़े 2 बी-डी में लाल लाइनों के साथ) मध्यमस्तिष्क और पोंस के माध्यम से एक भी कटौती से अग्रमस्तिष्क से अलग और ताजा होता है कि एक छोटे से पेट्री डिश के लिए यह कदम, एसपीएस मार डाला.
- क्षैतिज विमान में सेरिबैलम टुकड़ा करने की क्रिया जब मंच काटने के लिए मस्तिष्क gluing के लिए एक सीधी और व्यापक आधार फार्म के लिए brainstem निकालें. अग्रमस्तिष्क से कट गया था कि नीचे की ओर का सामना करना पड़ रहा है इतना है कि संक्षेप में फिल्टर पेपर की एक गीला टुकड़े पर सेरिबैलम जगह है.
- (चित्रा 2B में ब्लू लाइन के साथ संकेत के रूप में) के आधार फार्म के लिए एक स्केलपेल के साथ brainstem कट, और एसपीएस के लिए सेरिबैलम वापसी. काटने के अन्य विमानों की जरूरत है, उसके अनुसार सेरिबैलम ब्लॉक (आंकड़े -2 सी और डी में नीले लाइनों) ट्रिम.
3. मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया
- यह घ है कि जाँच से काटने मंच तैयारRY, मंच के बीच में superglue की एक छोटी सी बूंद लागू करने से पहले.
- सही पक्ष के साथ एक रंग का उपयोग एसपीएस से मस्तिष्क ब्लॉक लिफ्ट, और फिल्टर पेपर के छोटे टुकड़े का उपयोग कर मस्तिष्क से किसी भी अतिरिक्त तरल हटा दें. फिर, एक भी आंदोलन के साथ मंच पर गोंद की बूंद पर रंग से मस्तिष्क स्लाइड.
- सूखने से मस्तिष्क और ऊतक के पक्षों पर चलने से गोंद को रोकने के लिए, एक पाश्चर पिपेट साथ एसपीएस की कुछ बूँदें लागू करते हैं और टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में काटने चरण जगह है. ब्याज के क्षेत्रों (जैसे, अनुमस्तिष्क प्रांतस्था) ब्लेड का सामना कर रहे है, ताकि मस्तिष्क ब्लॉक संरेखित और इस तरह कटा हुआ होने से पहले यांत्रिक दबाव के कम से कम राशि के अधीन हो जाएगा.
- लगातार काटने कक्ष में एसपीएस बक के साथ-साथ 34-37 डिग्री सेल्सियस तापमान को बनाए रखते हुए निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रत्येक टुकड़ा काटें. Extern भरकर इस श्रृंखला में काटने कक्ष का तापमान रखेंगरम शुद्ध पानी और तापमान कम हो जाता है जब भी पानी की जगह के साथ स्लाइसर के अल कक्ष.
नोट: टुकड़ा करने की क्रिया मापदंडों प्रयोगात्मक जांच की जा रही है कि ऊतक और न्यूरॉन्स के प्रत्येक प्रकार के लिए पाया जाना चाहिए. सिरेमिक ब्लेड और अनुमस्तिष्क गोल्गी कोशिकाओं के साथ Campden SMZ 700 स्लाइसर के मामले में 0.75 मिमी कंपन आयाम 65 हर्ट्ज पर और 0.05 मिमी / सेकंड की गति को आगे बढ़ाने का उपयोग करें; अनुमस्तिष्क परमाणु न्यूरॉन्स उच्च आयाम और आवृत्ति (1 मिमी और 90 हर्ट्ज, क्रमशः) और धीमी अग्रिम गति (0.01-0.02 मिमी / सेक) के लिए सिफारिश कर रहे हैं. गोल्गी और अनुमस्तिष्क परमाणु न्यूरॉन्स दोनों के लिए, टुकड़ा मोटाई 300 माइक्रोन होना चाहिए. - टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान, स्लाइस खुद पर गुना करने की अनुमति नहीं है. धीरे अधिमानतः ही नहीं प्रयोग के लिए ब्याज की हैं कि क्षेत्रों में टुकड़ा छू, एक नरम ब्रश के साथ उन्हें समर्थन करके इस रोकें. Vibratome ब्लेड छूने से ब्रश को रोकने के लिए ध्यान रखना; विशेष रूप से चीनी मिट्टी के ब्लेड के मामले में, यहां तक कि एक प्रकाश संपर्कब्लेड को नुकसान पहुंचा सकते हैं.
- एक चौड़े मुँह, आग पॉलिश कांच पाश्चर पिपेट का उपयोग चैम्बर होल्डिंग / एक वसूली के लिए टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष से प्रत्येक टुकड़ा ले जाएँ.
- स्लाइस प्रयोग शुरू करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए कक्ष में आराम करने दो. यह क्षतिग्रस्त या मर ऊतक और कोशिकाओं के क्षरण के लिए अनुमति देता है और इस तरह एक क्लीनर टुकड़ा सतह में यह परिणाम है. पहले घंटे के दौरान, 34-36 डिग्री सेल्सियस की रेंज में चैम्बर में एसपीएस के तापमान रखना; स्लाइस स्लाइस नुकसान या उन्हें नाव बना सकते हैं कि हवा के बुलबुले से छुआ नहीं कर रहे हैं कि सुनिश्चित करते हैं.
4. प्रयोग
- 1 घंटे बाद, वसूली चैम्बर तापमान आर टी (17-25 डिग्री सेल्सियस) से नीचे शांत करते हैं.
नोट: यह स्लाइस जीवाणुओं के विकास के साथ-साथ सेलुलर चयापचय धीमा द्वारा उपयोग किया जा सकता है, जिसके दौरान समय अवधि को लम्बा खींच सकता है. इस अवधि मस्तिष्क क्षेत्र और सेल प्रकार पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, गोल्गी कोशिकाओं के कुछ प्रकार के स्लाइस में स्वस्थ होने के लिए पाया जा सकता है8 घंटा अन्य प्रकार जबकि काटने के बाद केवल 6 घंटे के लिए पिछले. - 1 घंटा टुकड़ा करने की क्रिया से पारित कर दिया है, के बाद विभिन्न electrophysiological प्रयोगों के लिए स्लाइस का उपयोग करें.
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Representative Results
वर्णित ढंग से तैयार स्लाइस विभिन्न electrophysiological और optogenetic प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 3 ए और 3 सी में, हम क्रमशः, अंतर हस्तक्षेप (डीआईसी) प्रकाशिकी के नीचे देखा एक क्षैतिज अनुमस्तिष्क टुकड़ा और एक राज्याभिषेक मस्तिष्क कॉर्टिकल टुकड़ा, के एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाते हैं. अनुमस्तिष्क टुकड़ा में, अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स के कई प्रकार के आसानी से, उनके स्थान और सेल शरीर के आकार के द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है electrophysiological रिकॉर्डिंग लक्षित अनुमति. चित्रा 3B और 3 डी में, उदाहरण दिखाए जाते हैं एक अनायास सक्रिय अनुमस्तिष्क गोल्गी सेल और cortical पिरामिड सेल से वर्तमान दबाना मोड में पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग से बताते हैं. गर्म कटा हुआ दिमाग से प्राप्त electrophysiological और optogenetic रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता के आगे उदाहरण हुआंग और Uusisaari 11 और Lefler एट अल. 16 में पाया जा सकता है.
| एकाग्रता [मिमी] | वजन (ग्राम / एल) | |
| NaCl | 124 | 72.5 |
| KCl | 3 | 2.23 |
| के.एच. 2 पीओ 4 | 1.2 | 1.63 |
| MgSO 4 * 6H 2 हे | 1.9 | 4.3 |
| ग्लूकोज़ | 20 | 3.6 |
| 3 NaHCO | 26 | 2.18 |
| 2 CaCl | 2 | 1.109 |
मानक शारीरिक समाधान की तालिका 1. संरचना.
उपकरणों की 1. व्यवस्था चित्रा. 1. बिग कैंची, 2. लघु शल्य कैंची, ब्लेड # 11 से 3. स्केल्पल, 4. ठीक टिप संदंश, 5. छोटा सा रंग, 6. छोटे पेट्री डिश, विआयनीकृत पानी के लिए 7. ग्लास बीकर, गरम Gasse के लिए 8. ग्लास बीकरडी शारीरिक समाधान, 9. सुपर गोंद, 10 पतला ब्रश, 11. पाश्चर पिपेट, 12. लघु सिरिंज, 13. pentobarbital, 14. फ़िल्टर पत्रों, 15. काटना मंच.
. मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी के उद्घाटन के चित्रण चित्रा 2. खोपड़ी और मस्तिष्क विच्छेदन की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (ए) ड्राइंग (बी - डी). तीन प्रमुख टुकड़ा करने की क्रिया विमानों के लिए मस्तिष्क को काटने के विमानों का वर्णन योजनाबद्ध चित्र. नीली रेखा मस्तिष्क पर चिपका दिया जाएगा जो पर विमान का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 3. विधि के प्रतिनिधि का परिणाम है. (ए) एक क्षैतिज अनुमस्तिष्क टुकड़ा ओप्रदर्शन विधि के साथ btained. तीन अनुमस्तिष्क प्रांतस्था के प्रमुख परतों (छोटा दाना सेल परत, जीसी परत; पुर्किन्जे न्यूरॉन परत, पी.एन. परत, आणविक परत, एमएल) के साथ ही सफेद पदार्थ (WM) संकेत कर रहे हैं. एक पैच दबाना इलेक्ट्रोड रेखाचित्र के रूप में एक गोल्गी सेल (जीओसी) (पैमाने पर पट्टी: 40 माइक्रोन) पर तैयार की है. (बी) उदाहरण रिकॉर्डिंग वर्तमान दबाना में एक पैच दबाना इलेक्ट्रोड के साथ प्राप्त की है ए में दिखाया गोल्गी सेल से रिकॉर्डिंग मोड. (ब्लैक में: छह ग्रे निशान से बाहर प्रतिनिधि ट्रेस). (सी) एक राज्याभिषेक मस्तिष्क कॉर्टिकल टुकड़ा प्रदर्शन विधि के साथ प्राप्त की. Cortical पिरामिड कोशिकाओं एक पैच दबाना इलेक्ट्रोड का एक योजनाबद्ध ड्राइंग के साथ एक साथ दिखाया गया है. (डी) उदाहरण पैच दबाना रिकॉर्डिंग, वर्तमान दबाना मोड में, (सी) में दिखाया पिरामिड सेल. से यहाँ क्लिक करें इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए आंकड़ा.
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Discussion
हम शारीरिक के बजाय ठंडा तापमान में चूहों से तीव्र मस्तिष्क के स्लाइस की तैयारी के लिए एक विधि प्रदर्शित करता है.
यह ठंड शर्तों के साथ तैयार उन लोगों के साथ तुलना में जब गर्म परिस्थितियों में प्राप्त की स्लाइस की गुणवत्ता बेहतर है कि 11 से पता चला स्लाइसर ब्लेड न्यूनतम ऊर्ध्वाधर कंपन है कि प्रदान की गई है. शारीरिक तापमान में टुकड़ा करने की क्रिया ऐसी एकल कोशिका की aberrations के रूप में अच्छी तरह से नेटवर्क व्यवहार में प्रकट हो सकता है कि चयापचय की प्रक्रिया 17-19 में परिवर्तन से संबंधित उन के रूप में कम तापमान के कारण शारीरिक कलाकृतियों, रोक सकता है. इसके अलावा, टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया स्पष्ट रूप से अनावश्यक देरी के बिना पूरा किया जाना चाहिए, भले ही समाधान भी गर्म हो जाते हैं पहले काटने को समाप्त करने के क्रम में बर्फ ठंड की स्थिति में टुकड़ा करने जब यह है के रूप में (टुकड़ा करने की क्रिया के साथ जल्दी करने के लिए, और रोकने के लिए कोई ज़रूरत नहीं है ऊतक के लंबे समय से स्थायी ठंड से नुकसान). इस प्रकार, धीमी काटने गति हमें हो सकता हैएड. यह बहुत ही नाजुक संरचनाओं टुकड़ा करने की क्रिया के मामले में फायदेमंद हो सकता है. पिछले है, दोनों के समाधान की और मस्तिष्क के शीतलन कदम omitting काफी प्रक्रिया के साथ-साथ इसकी जटिलता के लिए आवश्यक समय की राशि कम कर देता है. ठंडा तापमान का हल का ठंडा प्रयोग खुद के लिए और अधिक समय छोड़ने, शारीरिक तापमान का हल की वार्मिंग से लगभग 40 मिनट अधिक की आवश्यकता है.
यह 0 डिग्री सेल्सियस में कटौती के साथ तुलना में 20 डिग्री सेल्सियस में कटौती स्लाइस की जांच जब GAD67-GFP चूहों में cortical न्यूरॉन्स में प्रतिदीप्ति की तीव्रता मजबूत है कि 20 दिखाया गया है. यह आगे ठंडा तापमान में टुकड़ा करने की क्रिया न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता पर फ्लोरिडा uence में एक हानिकारक डाल रही है कि धारणा का समर्थन करता है. दूसरी ओर, एक ही पेपर में यह फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स का घनत्व 20 डिग्री सेल्सियस पर कटौती उन लोगों की तुलना में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्राप्त कटा में कम हो गया था कि दिखाया गया था. परिणाम के साथ विवाद तीव्र श्वसन संक्रमण हो सकता हैZ-विक्षेपन विचार के तहत नहीं लिया गया था कि इस तथ्य से एसई. जैसा कि ऊपर कहा, Z-नीचे को झुकाव ब्लेड की गुणवत्ता और गति और स्लाइसर के अन्य सेटिंग्स के अलावा, शारीरिक तापमान में टुकड़ा करने की क्रिया जब ऊतक गुणवत्ता पर एक मजबूत प्रभाव है.
प्रक्रिया के महत्वपूर्ण भागों में से एक टुकड़ा करने की क्रिया से पहले स्लाइसर ब्लेड के ठीक ट्यूनिंग शामिल है. टुकड़ा करने की क्रिया संभावना कठोर लिपिड झिल्लियों की "खुर" खड़ी है और साथ ही दोनों क्षैतिज काटने शामिल है जहां ठंडा समाधान का उपयोग करते समय विपरीत, शारीरिक शर्तों के तहत जेड दिशा में स्लाइसर ब्लेड के किसी भी आंदोलन के ऊतकों में नुकसान का कारण बन जाएगा. इस को कम करने के लिए, ब्लेड के रूप में कठिन और सीधे संभव के रूप में होना चाहिए; हमारे अनुभव में, पारंपरिक रेज़र ब्लेड प्रयोग करने योग्य होने के लिए भी कई खामियों है. विशेष रूप से vibratome उपयोग के लिए बनाया गया उच्च गुणवत्ता वाले स्टेनलेस स्टील ब्लेड बेहतर कर रहे हैं, लेकिन सबसे अच्छा परिणाम के लिए हम एकल beveled CERAM का सुझावआईसी ब्लेड. इसके अलावा, हम दृढ़ता से यह सीधे टुकड़ा गुणवत्ता को प्रभावित करती है के रूप में ब्लेड का सही क्षैतिज संरेखण के लिए महत्वपूर्ण समय बिताने की सलाह देते हैं. हम जेड विमान में कंपन कम से कम 0.5 माइक्रोन इतना है कि ब्लेड संरेखण की ट्यूनिंग की अनुमति देता है कि Campden 700SMZ स्लाइसर का उपयोग करें. दरअसल, गर्म टुकड़ा करने की क्रिया विधि की सबसे महत्वपूर्ण सीमा स्लाइसर ब्लेड गुणवत्ता और स्थिरता पर अपनी निर्भरता है. इन आवश्यकताओं को पूरा नहीं किया जा सकता है, यह इस तरह के आंशिक रूप से जमी होने से परासारिता अलग रूप में ठंडा समाधान में टुकड़ा करने की क्रिया में नुकसान के बावजूद, बजाय पारंपरिक ठंडा काटने विधि का उपयोग करने की सलाह दी जाती है.
प्रदर्शन विधि सेरिबैलम की क्षैतिज स्लाइस प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है; या मध्यमस्तिष्क के साथ-साथ brainstem - सरल संशोधनों के साथ ही विधि कई अन्य सामने के क्षेत्रों से, राज्याभिषेक या बाण के समान विमान या तो में स्लाइस प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अग्रमस्तिष्क और olfact की सबसे पूर्वकाल भागों के स्लाइस के लिएory प्रणाली, खोपड़ी इन भागों को नुकसान को रोकने के लिए और अधिक पूर्वकाल कटौती की जानी चाहिए. हम उद्देश्यपूर्ण रूप में सरल और संभव के रूप में कम विधि रखने और जानवर के पूर्व छिड़काव को रोजगार नहीं है, न ही हम काटने के लिए शारीरिक समाधान में किसी भी घटक विकल्प है. इस विधि के हित के विशिष्ट neuronal उप-प्रकार के अनुसार संशोधित करने की अनुमति देता है. इसे काटने समाधान (परिचय में संदर्भ में वर्णित) के संशोधनों के आगे परिणामों की स्लाइस की व्यवहार्यता और मजबूती सुधार कर सकते हैं कि संभावना है. सामान्य तौर पर, विधि सामान्यतः electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल सबसे अन्य सामान्य शारीरिक समाधान के साथ संगत होना चाहिए.
यहाँ दिखाया विधि में, स्लाइस 300 माइक्रोन मोटी काट रहे हैं. इष्टतम टुकड़ा मोटाई कटा हुआ मस्तिष्क क्षेत्र और ब्याज की कोशिकाओं पर निर्भर करता है. नेटवर्क अखंडता विचार के लिए, स्लाइस पतले से 250 माइक्रोन, और क्योंकि प्रसार सीमाओं के ऊपर नहीं होना चाहिएटुकड़ा मोटाई की सीमा प्रति ~ 400-450 माइक्रोन है.
ऊतक में भी छोटे अस्थिरता असमान या व्यर्थ स्लाइस में परिणाम कर सकते हैं के रूप में इस विधि में एक महत्वपूर्ण कदम, काटने चरण के लिए मस्तिष्क gluing का संबंध है. इस प्रकार, देखभाल यह गोंद ड्रॉप पर उतारा है जब मस्तिष्क की सतह कोई अतिरिक्त एसपीएस है कि सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए; इसके अलावा, बहुत ज्यादा गोंद मस्तिष्क मंच पर असमान झूठ बोल रही है और संभवतः टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान मंच से detaching में परिणाम होगा. इसके अलावा, अतिरिक्त गोंद ब्लेड को नुकसान पहुंचा सकता है, स्लाइस में inhomogeneity शुरू करने के अलावा, ऊतक पक्षों पर रेंगना और हो सकता है.
प्रदर्शन गर्म विधि को ठंडा विधि से टुकड़ा करने की क्रिया प्रोटोकॉल बदलते जब वृद्धि हो सकती है कि कुछ मुश्किलें हैं. कठिनाइयों में से एक स्लाइस में बैक्टीरिया की उपस्थिति है. इस कारण से यह उपकरण, चैम्बर, और प्रक्रिया से पहले इथेनॉल के साथ टुकड़ा करने की क्रिया स्नान कीटाणुरहित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, मोड़1 घंटे के बाद वसूली स्नान में हीटिंग सिस्टम बंद बैक्टीरिया विकास धीमा कर देती है.
अंत में, यह शारीरिक तापमान में कटौती स्लाइस में न्यूरॉन्स के स्वास्थ्य में सुधार भी उनके आंतरिक गुणों में परिवर्तन में परिणाम हो सकता है कि जोर दिया जाना चाहिए. इसलिए, यह प्रयोगों ठंड विधि का उपयोग किया पहले काम के साथ एक लंबे समय तक परियोजना का हिस्सा हैं, खासकर अगर ठंड और गर्म विधियों दोनों के साथ स्लाइस से प्राप्त परिणामों के एक प्रारंभिक तुलना प्रदर्शन करने की सलाह दी जाती है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg/ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
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