Abstract
ここでは、急性脳スライスを調製するためのプロトコルを提示する。この手順は、主に、結果の品質を決定する電気生理学的パッチクランプ実験のための重要な要素である。これは、成熟した動物からの高度髄脳構造を扱う場合は特に、手順を切削中に冷却工程を省略すると、健康なスライスおよび細胞を得るのに有益であることが示されている。上昇した温度のみに依存推測することができ、神経の健康をサポートすることにより、正確なメカニズムは、それはそれを理にかなっていても、可能な限り、スライシングが行われる温度は、温度関連のアーティファクトを防止するために、生理学的条件に近づけるべきである。この方法の別の重要な利点は、手順の単純さと、したがって、短い準備時間である。実証の方法では、成体マウスが使用されているが、同じ手順が若いマウスならびにラットに適用することができる。また、以下のパッチCLアンプ実験は、水平小脳切片上で実行されるが、同じ手順は、他の面と同様に、脳の他の後方の領域で使用することができる。
Introduction
提示された方法の目的は、特に大人や古い動物を使用した場合、 インビトロ電気生理学的実験のために高品質の急性脳スライスを得ることである。
2エレガントな文章にSkredeとWestgaard 1に記載されているように急性脳スライス方法は、現代の神経科学研究の基礎となっており、世界中の無数のバリエーションで使用される。スライスの品質は、スライス当たりの生きているニューロンの数、細胞は電気生理学的および形態学的特性を保持し、ならびに組織の完全でない期間に反映される。また、安定した録画の最大の持続時間は、スライスの品質に依存します。このように、数十年に沿って、元のスライス方法は、さらに多くの場合、Oの切断物の複雑な修飾により、2-10切断後のスライスの回復を強化するために、個々の研究グループによって開発された同様に冷却された生理的なソリューションと動物の心臓内プレ灌流（例えばアスコルビン酸、チオ尿素あるいはH 2 O 2の追加など）ここで、rリカバリソリューション。
最近11が示されているように、スライス時の生理的温度は、ニューロンの健康への冷却よりも有益であると思われる。大人（2-8月）げっ歯類で作業する場合の改善が最も顕著である。劇的な温度変化を回避することにより、そのような可塑13およびイオンチャネル動態13,14のような細胞内の温度依存性プロセス、アーチファクトを防止する。このような変化は、膜電位および細胞内カルシウムシグナル伝達に影響を与えるしきい値をスパイクし、スパイク形状可能性がある。
ここに提示「ホット」急性スライスの調製方法は、小脳、大脳皮質および海馬を含む任意の脳領域から高品質の急性脳スライスを得るための一般的な手順であり、脳幹核16 </ SUP>だけでなく、嗅球、両方のラット及びマウスで。
注目すべきことに、生理的温度スライス手順は、切断刃がほぼ完全に水平方向に振動し、構造的な欠陥のないことを要求する。このような精度は古いスライサーモデルと達成できない可能性があります。低温は、代謝異常のコストであっても、機械的な損傷に対する組織より耐性にいるようだとして、そのようなケースでは、我々は凍結冷条件のスライス標本を実行することをお勧めします。
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Protocol
このプロトコルで説明されているすべての実験手順はヘブライ大学の動物実験委員会によって承認された。
1.スライスのためのソリューションとツールの準備
- 表1に記載のイオンを含有する標準生理溶液（SPS）の1リットルを準備します。
- 脱イオン水（0.055μS/ cmのコンダクタンス）1000mlので満たされた貯蔵ガラス瓶に予め10倍の最終濃度の塩を含むストック溶液を調製する。塩（塩化ナトリウム、塩化カリウム、KH 2 PO 4、そしてMgSO 4）を追加し、完全に溶解するまで撹拌する。 4℃での原液を保管してください。
- 実験日の最終のSPS溶液を作る。磁気撹拌棒を用いて、グルコース（3.6 g）および炭酸水素ナトリウム（2.18グラム）を溶解し、精製水700ml中にストック溶液100mlを追加し、1 Lに精製水を上に追加
- solutiを平衡〜20分間、95％O 2/5％CO 2でそれをガス処理することによってオン。この後、1MのCaCl 2溶液2mlを加える。
- 以下のツール（ 図1）を構築。
- スライスするための脳と操作するための小さなへらの所望の部分を解剖するための刃でスカルペル、脳を露出するために頭蓋骨を持ち上げるための大きなハサミまたは断頭のために他のツール、頭蓋骨を開くための小さな外科用ハサミ、先端の細い鉗子を準備解剖脳のパーツ。
- 加えて、脳から過剰な液体を除去するためのろ紙の小片を準備、脳のための2つの小さなペトリ皿に脳を接着するために含有する加温した精製水とSPS、およびシアノアクリレート接着剤のために二枚のガラス500mlのビーカー中で解剖するスライシング段階。
- 回復茶にスライス浴からスライスを移動させるためのスライシングおよび広口ガラスパスツールピペット中にスライスを処理するための小さなブラシを準備mber。温かいスライス浴中の細菌増殖を防ぐためのツールを消毒する。さらに、きれいな実験室用手袋を使用しています。
- ギブとエドワーズ15で説明したようにそのような水没スライス回収室を準備します。連続して95％O 2/5％CO 2で、その中にSPSをガスと36℃で保つ。ガス発生がスライスを損傷する可能性が風呂の中に閉じ込め小さな気泡が生じないことを確認してください。
- 暖かい〜マグネチックスターラー又は水浴ヒータプレート上36℃でSPSを300ml。ヒータプレートが使用される場合、イオンの沈殿をもたらし得る過熱からの溶液を、防ぐように注意してください。ケースでは、代わりに古いものを冷却温かい新鮮なSPSを発生します。
- 電気ポットを使用して沸騰させるの精製水〜500ミリリットルを持参して、ビーカーに、スライシング温度より少し暖かい水を得るために、冷たい水で300mlのを兼ね備えています。これは断頭中に精製水を温めて使用してremaiを使用後でスライス浴の生理的温度を維持するためのお湯の寧。
- 腹腔内ペントバルビタール（60 mg / mlの）を0.1ml注入することによってマウスを麻酔し。数分後、動物が感覚の欠如を確認するために、強力なつま先またはテールピンチに応答しないことを確認してください。
2.脳を解剖
- 頭蓋骨の背面近くに大きなはさみで首を切断することにより素早くマウスを斬首し、頭が過剰な血液を洗い流すために温め、精製水を入れたビーカーに分類してみましょう。
- おそらく、小さなはさみで首のより多くを除去し、首の筋肉と皮膚の下の頭蓋骨で大後頭孔を公開します。
- 明らかに頭蓋骨の開放を案内するために頭蓋骨の縫合を見ることができるようにするために頭蓋骨の上に肌を引き出します。
- 大後頭孔を通して小さなハサミの下側の先端を挿入し、すぐに向かって、それらを回して開いた頭蓋骨をカット側面。そっと目と前頭頭頂縫合の背後にある場所までの頭頂骨の側縁に沿って切断。その後、（ 図2Aの緑色の破線を参照）頭蓋骨の中心に向かって切り、頭蓋骨の反対側に正中線を横切る。
- （ 図2（a）の黄色の破線の矢印参照）先端の細い鉗子を使用して、前頭頭頂隅から頭蓋骨を持ち上げ、脳を露出するために起動して側方へ斜めに引き出します。頭蓋骨を持ち上げた時に脳が所定の位置にとどまるように、頭蓋骨が、頭のいずれかの骨や皮膚に付着していないことを確認します。脳が頭蓋骨に移動している場合には、頭蓋骨と脳の間の任意の結合組織を除去するための小さなハサミを使用しています。
- 脳が露出しているときに、脳はドライにすることはできません。頭蓋骨と温めで満たされたペトリ皿の中の脳を維持しながら、このようにして、次のステップを実行し、SPSをガス処刑。
- 電子に使用する脳の部分を切り離す小刀やへらを用いて脳の残りの部分からxperiment。小脳を用いた場合には、（ 図2B-Dの赤い線に沿って）中脳と橋を通ってシングルカットにより前脳から切り離し、新鮮含まれている小型のペトリ皿に移動し、SPSはガス処刑。
- 水平面内で小脳をスライスした段階の切断に脳を接着するためのストレートと広い基盤を形成するために、脳幹を削除します。前脳から切り取った面が下を向くように簡単に説明するとろ紙の濡れた片上に小脳を置く。
- （ 図2Bの青線で示すように）ベースを形成し、SPSに小脳を返すためにメスで脳幹を切った。カッティングの他の面が必要な場合には、それに応じて小脳ブロック（ 図2C＆Dにおける青い線）をトリム。
3.脳をスライスする
- これをdと確認することによって、切削ステージを準備RY、ステージの真ん中に瞬間接着剤の小滴を適用する前に。
- 正しい面を上にしてへらを使用して、SPSからの脳ブロックを持ち上げて、ろ紙の小片を用いて脳から余分な液体を除去。次に、単一の移動に伴って、ステージ上で接着剤の上にドロップへらから脳をスライドさせます。
- 乾燥からの脳組織の両側に駆けから糊を防止するために、パスツールピペットを用いてSPSの数滴を適用し、スライスチャンバ内の切断段階を置く。関心（ 例えば、小脳皮質）の領域は、ブレード対向しているので、スライスされる前に、機械的圧力の最小量に供されるように、脳ブロックを揃える
- 常に切断チャンバ内にSPSをガス発生ならびに34-37℃に温度を維持しながら、製造者の指示に従って、各スライスを切った。 externを充填することにより、この範囲での切断室の温度を維持するスライサーのアルチャンバー温め精製水で、温度が低すぎると落ちるたびに水を交換する。
注：スライスパラメータは実験的に検討されている組織やニューロンの種類ごとに見つけなければならない。セラミックブレードと小脳ゴルジ細胞とカムデンSMZ 700スライサーの場合、65 Hzから0.05ミリメートル/秒の進行速度で0.75ミリメートルの振動振幅を使用する。小脳核のニューロン高い振幅と周波数（1ミリメートルと90ヘルツ、それぞれ）と遅い前進速度（0.01〜0.02ミリメートル/秒）のために推奨されている。ゴルジおよび小脳核のニューロンの両方のために、スライス厚は300μmであるべきである。 - スライシング中に、スライスは自分自身にフォールドすることはできません。優しく好ましくはただの実験のために関心のない領域でスライスを触れ、柔らかいブラシでそれらをサポートすることにより、これを防ぐ。ビブラトーム刃に触れることからブラシを防ぐように注意してください。特にセラミックブレードの場合には、均一な光接触ブレードが破損することがあります。
- 広口、ファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを使用してリカバリ/保持チャンバーにスライシング室から各スライスを移動します。
- スライスは、実験を開始する前に、少なくとも1時間室で休むましょう。これが損傷しているか死んで組織および細胞の劣化を可能にし、したがって、クリーナー、スライス面になる。最初の1時間、34-36℃の範囲のチャンバ内のSPSの温度を保つ。スライスはスライスを損傷したり、それらに浮くことができ、気泡によりタッチされていないことを確認してください。
4.実験
- 1時間後、回収室温度がRT（17-25℃）まで冷却させ。
注：これは、スライスが細菌の増殖ならびに細胞の代謝を遅くすることにより使用することができる期間を延長するかもしれない。この期間は、脳領域および細胞タイプに依存する。例えば、ゴルジ細胞の特定の種類のスライスに健康であることが判明することができ最後の他のタイプのに対し、わずか6時間後に切断後8時間。 - 1時間はスライスから渡された後、様々な電気生理学的実験のためのスライスを使用。
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Representative Results
記載の方法で調製したスライスは、様々な電気および光遺伝学的実験のために使用することができる。 図3A及び図3Cでは、微分干渉（DIC）光学系の下で見、それぞれ水平小脳スライス冠状大脳皮質切片の代表的な例を示している。小脳スライスでは、小脳ニューロンのいくつかのタイプを容易に目標と電気生理学的記録を可能にする、それらの位置及び細胞体形状によって認識することができる。 図3Bおよび3Dにおいては、例えば、自発的にアクティブ小脳ゴルジ細胞および皮質錐体細胞からの電流クランプモードで全細胞パッチクランプ記録からのトレースが示されている。ホットスライスした脳から得られた電気生理学的および光遺伝学的録音の品質の更なる例は、黄とUusisaari 11とレフラーらで見つけることができます。16。
| 濃度[mMの] | 重量（g / L） | |
| NaClを | 124 | 72.5 |
| 塩化カリウム | 3 | 2.23 |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | 1.63 |
| MgSO 4を* 6H 2 O | 1.9 | 4.3 |
| グルコース | 20 | 3.6 |
| のNaHCO 3 | 26 | 2.18 |
| のCaCl 2 | 2 | 1.109 |
標準生理溶液の表1組成物。
ツールの1.配置図。1。ビッグはさみ、2小外科用ハサミ、ブレード＃11 3.スカルペル、4。ファイン先端鉗子、5小へら、6小ペトリ皿、脱イオン水7.ガラス製ビーカー、温めgasse 8.ガラスビーカーD生理溶液、9スーパーのり、10シンブラシ、11パスツールピペット、12小注射器、13ペントバルビタール、14フィルターペーパー、15カッティング段階。
脳を露出させるために頭蓋骨の開口を示す図2の頭蓋骨と脳の解剖の概略図（A）、図面（B - D）。三つの主要なスライス面のために、脳の切断面を説明する模式図。青い線は、脳がオンに釘付けになる、その上に平面を表している。
図3の方法の代表的な結果。（A）の水平小脳スライスoを実証方法でbtained。 3小脳皮質の主要な層（顆粒細胞層、GC層、プルキンエニューロン層、PN層、高分子層、ML）並びに白質（WM）が示されている。パッチクランプ電極を模式的にゴルジ細胞（GOC）（スケールバー：40μm）の上に描画される。（B）の例ゴルジ細胞から記録した記録は、電流固定におけるパッチクランプ電極を用いて得られるA.に示すモード。 （黒：6灰色トレースのうち代表的なトレース）。（C）実証方法で得られた冠状大脳皮質スライス。皮質錐体細胞はパッチクランプ電極の概略図とともに示されている。（D）の例パッチクランプ記録、電流クランプモードでは、（C）に示すよう錐体細胞から。 これの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてくださいフィギュア。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg/ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
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