听觉神经的光遗传学刺激

Summary

人工耳蜗植入（CI）的启用在听取了听神经的直接电刺激。然而，可怜的频率和强度的分辨率限制了听觉与独联体的质量。在这里，我们在小鼠中描述的听觉神经的光遗传学刺激作为听觉的研究和制定未来的独联体的替代策略。

Abstract

螺旋神经节神经元（SGNS）通过人工耳蜗植入（CI）的直接电刺激使开放式的言语理解中的大部分植入聋者^{1 6。}然而，声音编码与当前的证明书有很差的频率和强度的分辨率，由于目前广泛流传的每个电极接触沿着耳蜗^7-9的tonotopic轴激活大量SGNS的。光学刺激，提出作为替代的电刺激，有望在空间上更加狭窄活化SGNS的，因此，编码的更高的频率分辨率。在最近几年中，耳蜗的直接红外照明已被用来唤起应答的听觉神经^10。尽管如此，它需要更高的能量比电刺激^10,11和不确定性仍然是底层机制^12。在这里，我们描述了基于光遗传学的方法来刺激SGNS用低强度蓝光，使用转基因小鼠与channelrhodopsin 2（的^ChR2）13或的ChR2变爪¹⁴的病毒介导的表达的神经元表达。我们使用的微型发光二极管（μLEDs）和光纤耦合激光器通过一个小的人造口（内耳）或圆窗刺激的ChR2表达SGNS。我们测定的反应由光诱发电位（光遗传学听性脑干反应：oABR）头皮录音或从听觉通道微电极记录和声学和电刺激进行比较。

Introduction

根据世界卫生组织，3.6亿人在全球遭受听力损失。在聋者，SGNS独联体的直接电刺激能在大部分^1,2,4,5开言语理解。尽管独联体已植入超过20万人，因此是最成功的神经假，声音编码由目前的人工耳蜗驱动是有限的。证明书是由一定数目的电极，其中每一个激活的听觉神经从而绕过尔蒂的功能失调感觉器官在耳蜗Âtonotopic区域基于电刺激。听力正常的听众可以区分2000多个频率，但今天的独联体只使用到12-22频道^4。这是由于从各刺激电极^7,9，激活大量代表许多不同的声音频率^8,15 SGNS的广泛的电流流动。这限制可使用多极的刺激，但在更高的功耗^16,17为代价得到改善。它们的输出动态范围的声音强度也有限，一般低于6-20分贝^4,18。由于这些原因，提高频率和强度分辨率是用于提高CI性能改善语音识别在嘈杂的环境中，韵律理解和音乐的感知重要目标。

不同的选项来刺激听觉神经的光学刺激。光可以很方便地集中针对一个小SGN人口，并承诺更好的空间约束，提高频率分辨率，并扩大动态范围，从而更好的强度分辨率。事实上，耳蜗刺激红外光表明在动物模型^10,11,19良好的频率分辨率。这种刺激的一个缺点是，它需要更高的能量比电刺激12,20。

作为替代红外线刺激，我们采用光遗传学来呈现SGNS光敏感。光遗传学是一种新颖的方法，结合遗传和光学技术，以非侵入性和特异性对照细胞高时间精度（条^21-23）。目前最常用的方式使用莱茵衣藻的微生物channelrhodopsin 2（的ChR2）基因的表达和其变体，编码光门控阳离子通道^24。的ChR2是7次跨膜螺旋蛋白质，当变换成神经元和由蓝色光激活时，作为非选择性阳离子通道，从而去极化的细胞^{24 27。}的ChR2已被充分表征^{24,28- 31}和许多的变体已经被开发来修改共同行动Ñ ​​谱，门控和渗透性能^32,33。我们工作的目的是建立耳蜗光遗传学的听觉通路的激活。我们注意到，该光遗传学方法来刺激听觉神经需要的螺旋神经节为channelrhodopsin的表达的遗传操作。用小鼠和大鼠的工作允许使用现有的转基因动物^13,34,35，提供channelrhodopsin表达沿tonotopic轴线和整个动物³⁶小变异。组合条件基因³⁷与适当的Cre-线提供细胞特异性表达。基因转移到其它动物的螺旋神经节需要使用病毒，如腺伴随病毒也就是在光遗传学³⁸的标准方法，并且我们发现在小鼠³⁶工作良好。基因操作和转基因的不利影响，如IMMU编码外来蛋白质的熊风险的表达NE的反应和/或增殖，破坏状态，甚至死亡基因操作的细胞。对于本演示的目的，我们使用下THY-1启动子¹³螺旋神经节神经元表达的ChR2基因小鼠光学刺激听觉通路。我们注意到，其他channelrhodopsin变体可以被用于相同的目的，我们证明了使用变爪¹⁴的病毒介导的转移进SGNS ^39。

虽然人工耳蜗光遗传学，需要遗传操作，它提供了分子调整优化SGN刺激相比，电刺激承诺提高频率和强度分辨率。听觉通路的光遗传学刺激听觉的研究具有很强的针对性。例如，它有望在tonotopy的活性依赖性细化的研究进展发展过程中，在对在声localizat频谱整合需求的分析离子与在中枢听觉系统的频率特异性传入突起之间的相互作用程度的。

Protocol

在这项工作中提出的所有实验进行了由德国法律对实验动物的保护规定的道德标准。哥廷根大学董事会对动物福利和下萨克森州的动物福利办公室批准的实验。

1，准备μLED，刺激的

1. 对于μLEDs，首先准备μLED刺激器。使用蓝光LED与200由200微米的活性表面（μLED，见材料表）。
2. 焊接线连接到μLED。然后，封装μLED并用环氧树脂胶的连接。将设备留在一夜之间让环氧固化。
3. 对于机械稳定性和电绝缘性，通过一个薄的玻璃毛细管漏斗的电线，使用1个外径硼硅酸盐毛细管和用环氧树脂密封的交界处（ 图1D），使得所述毛细管可安装在一个机械手。
   注：t这里有一个权衡使得胶囊够厚，以获得良好的电气隔离（避免刺激文物），但足够薄，让LED的自由移动的肺大泡内，以将其定位到内耳开窗。这是一个很好的做法，准备一个以上的LED。
4. 确认良好的电隔离，首先准备陪替氏培养皿用0.9％NaCl和浸3裸端的铜线到液体中。这是为了模拟与ABR电极的动物。将电线连接到ABR放大器，并从那里来的示波器。
5. 然后，发光二极管连接到刺激器和浸在该溶液中，直到它被完全覆盖。驱动LED的脉冲（见步骤3.1.1）的最大允许电流的时间超过20分钟，并检查是否有刺激的文物。如果他们出现，放弃了LED，并尝试一个新的。

2，手术过程

1. 使用4-10周龄的转基因小鼠表达的ChR2在Thy1.2子（9号线在王某等人^13）。操纵动物进行手术，一定要使用干净，很好认的外科手术工具。
2. 麻醉动物用腹腔注射乌拉坦（1.32毫克/千克），甲苯噻嗪（5毫克/千克）的混合物，和丁丙诺啡0.1微克/克稀释在0.9％无菌氯化钠溶液，然后将鼠标上的加热板用于保持体温度在37℃。与此剂量，麻醉通常持续整个实验方案。
   1. 开始后最初的麻醉诱导检查觉醒的缩足反射的迹象10分钟。的情况下的动作，应用维持剂量氨基甲酸酯（0.66毫克/千克）和丁丙诺啡（0.05微克/克）稀释在0.9％无菌氯化钠溶液（不含甲苯噻嗪）的。再次检查缩足反射并继续仅在反射不存在。
3. 小心刮耳后区，准备切口。使用耳的方法来达到大疱（含气中耳腔）。
   1. 用微型镊子仔细解剖和/或删除颈部肌肉scalenes一部分， 例如，颈阔肌，胸锁乳突肌和。
   2. 发现和揭露泡（ 图1A）。识别大疱为骨性结构，其特征球形的泡表面的环表示鼓膜（ 图1A）的插入。使用胰岛素针刚刚低于该环的前端的孔。从那里开始，除去覆盖用细咬骨钳（腐食物）或microforceps的泡在这样一种方式，耳蜗岬暴露（ 图1B）骨。
4. 对于内耳开窗，轻轻刮掉骨胶囊，打开一个小窗口（耳蜗：〜500-800微米），同时注意保留完整的膜迷路（ 图1B）。在第二耳蜗执行内耳开窗转，因为它是远远不够的镫骨动脉和从顶点。打开顶部可以产生包括耳蜗蜗轴的断裂破裂。
5. 对于光纤或μLED植入到鼓阶的圆窗插入，小心地用锋利的手术刀尖端划伤骨利基扩大圆窗龛（叶片数11是一个不错的选择）。请务必使用一个新的刀片或手术刀。要非常小心，因为镫骨动脉的运行速度非常接近圆窗（ 图1B）。

3，光刺激用两种方法

1. 对于transcochlear刺激，使用μLEDs或光纤耦合激光器。
   1. 安装毛细管携带μLED上的机械手，小心地将μLED定位到内耳开窗。使用oABR，从电流源（通常为5-40 mA在2.7 V）在1-5赫兹引起由3-10毫秒长的刺激，以优化位置和或装置ientation的μLED的。
   2. 对于激光刺激，用473 nm的连续波激光器和一个250微米光纤（见材料）。耦合光纤的蓝色激光源的理想情况下提供功率的快速模拟控制（否则使用声光器件或较快的快门来定义的光刺激）。利用显微操作，找出光纤的末端直接到内耳开窗，用牙科水泥（transcochlear刺激）修复它。
2. 为耳蜗内刺激，通过圆窗进入鼓阶插入纤维。然后用10〜30毫瓦（光纤输出的功率）3-10毫秒的激光脉冲在1-5赫兹征求oABR。 oABR的大振幅使实验者观察oABR示波器上诱发由单一刺激来优化发射器的使用oABR振幅作为读出的位置和方向（μLED或纤维）。
3. 一旦良好的oABR已经实现，解决了cyanoacr纤维ylate胶水或牙科水泥，等到胶水固体。
   注：这是正常的，观察到了一些液体的耳蜗出来。然而，以避免与水泥的聚合，最好是干起来使用细棉灯芯的区域。

4，录音oABR的

1. 插入耳廓下方针状电极，在顶点和上邻近的腿后面，并将其连接到放大器。
2. 放大顶点之间的差异潜力及乳突皮下针。样品在50 kHz和过滤器（1-10,000赫兹）的速度。可视化的差异潜力在示波器上理想的记录设置接近最优化的光刺激的位置。使用信号平均（50-1,000x）和数据存储的计算机以供离线分析。

5，录音光学诱发局部场电位

1. 把动物变成立体定位框架。使用镊子分反弹拉扯皮肤覆盖在颅骨，并用剪刀大致从眉心延伸到这种地步，颈部肌肉附着在头骨进行正中切口。
   1. 侧面反映了皮肤。纵向切开骨膜沿矢状缝，并轻轻揉露出颅骨，用棉签将其删除侧面。
2. 一个自定义的金属板位置上暴露颅骨离开板和lambda的尾端之间大约为1毫米的空间。用直径0.7毫米钻仔细钻一个孔进入顶骨。
3. 轻轻地拧在0.85毫米直径的螺杆 - 作为从下丘记录潜能参考（IC） - 持用钳子将螺丝只要螺丝没有拧紧。确保螺丝和硬膜之间的良好接触，但不穿透脑。胶螺丝和金属板到与氰基丙烯酸酯胶的头骨。
4. 松开n个埃克的肌肉轻轻地从头骨。拉颈部肌肉的尾端大约1-2毫米。确定矢状窦（SSS）和横窦（TS）的交叉点。如果需要，通过润湿用生理氯化钠溶液的骨增加头骨的透明度。
   1. 识别出IC小鼠卧直接尾的同店销售和TS交集。识别IC的位置，慢慢地，仔细地后进行环钻延伸约0.5毫米吻侧为1.5mm尾端到TS和大致3毫米横向。
   2. 以免伤到SSS和TS，因为这些会妨碍成功的实验。在这里，测试trepanned骨是否已经松动了轻推它。使用镊子慢慢抬离骨。
5. 用适当的适配器连接多声道阵列和探头到显微。为了防止插入到IC中摧毁了多声道录音阵列，小心地取出硬脑膜用小注射器针头的弯曲末端开始接近骨头的边缘。
   1. 从立体框架中取出的动物。固定金属板到一间酒吧，以保持立体定位固定。定位在记录头在集成电路并将其插入下微观控制，使得最上面的信道是在表面处刚刚可见。
6. 放大的记录阵列和在顶骨的参考螺钉，样品的各个信道之间的差电位在32千赫，低通滤波器（300赫兹），并存储在计算机的脱机分析的速率。
7. 所有的动物都应该先以麻醉复苏，依照有关安乐死的准则应予以人道安乐死的过程结束。安乐死的合适方法可包括颈脱位或CO ₂吸入。

Representative Results

一个最佳的内耳开窗是关键的，增加了成功实验的概率， 这意味着该窗口是规则的，小的，并且有内部的耳蜗结构中的无损伤。例如，出血表示血管纹的损坏。一个很好的例子是在图1B。

使用的ChR2-转基因小鼠，的ChR2表达于耳蜗（ 图1C）内的SGNS。蓝色光照明，或者通过μLED或激光时，引发大oABR，这从声ABR（AABR）在振幅和波形不同。 oABR（ 图1F）具有比AABR（ 图1E）较大的振幅，但它们是可比电ABR（EABR， 图1G），这可以解释为oABR和EABR反射的多SGNS招募和/或SGNS的多个同步激活比声音诱发AABR。

NT“>为了激发EABR啮齿类动物电器CI（MED-EL）插入圆窗，我们用双相电流脉冲（80微秒阶段时间为20微秒间期的持续时间，500μA，6 Hz的刺激速率），以刺激和平均响应100刺激的重复。刺激与2玻璃绝缘钨电极（1内部和耳蜗1外）也是可行的。

要注意的是oABR都不能检测在野生型动物中，抑制电压门控钠通道后或处死动物³⁹后是很重要的。这些控制实验使加热作为一种机制基础光学诱发小留学生的可能性不大。

我们通过听觉通路的中枢听觉系统验证活动的传播通过外记录。为一个例子，耳蜗的光遗传学刺激诱 ​​发也神经活性在听觉中脑（下丘， 图2）。

图1：手术过程，μLED准备，oABR记录 （ 一）解剖颈部的肌肉暴露了肺大泡;观察其特性球形形状并且其中鼓膜插入到骨，它可被用作一个划时代的环。比例尺1毫米。对肺大泡（二）开幕式将公开岬。内耳开窗是在第二耳蜗依次进行。其他地标来表示，其中镫骨动脉。比例尺1毫米。 （C）的ChR2-YFP表达SGNS。免疫标记的GFP（绿色）和鬼笔环肽-AF-568（红色）。比例尺为50μm。 （D）μLED，有线但尚未漏斗进入毛细管。比例尺1毫米。 （E），（F）和（G）的代表例AABR第（点击，20赫兹80 dB为单位）oABR（2毫秒，1赫兹，4毫瓦/ ^平方毫米）引起的，通过玻璃绝缘钨电极的LED刺激EABR（900μA，20赫兹）。 请点击这里查看本图的放大版本。

图2：后声，光遗传学和电刺激耳蜗从IC记录单试用局部场电位的多通道记录头的示意图画在每个面板的左侧。 （一）纯音与各种频率（80分贝声压级）导致了较低的频率，导致较表浅的活化比频率较高活性的区分梯度单介绍。这个观察是用来evaluatË成功插入多声道阵列记录到IC中。 （B）光学刺激（24毫瓦，6毫秒的持续时间）和（C）的电刺激（双相，80微秒的阶段的持续时间，20微秒间期的持续时间，500微安）也导致局部场电位在IC常常表现出类似的响应振幅。 （D）的外科拓扑包括集成电路以及小脑的一部分。比例尺为5mm。 请点击这里查看该图的放大版本。

Discussion

所描述的实验证明了SGNS的光遗传学刺激，并且可以在原则上，也可以用于刺激内和/或外毛细胞，提供视蛋白的表达。这些实验需要极大的耐心和关怀。如之前所提到的，最重要的步骤是一个很好的内耳开窗/圆窗插入所述光源，以及一个适当的位置和方向。

有使用的ChR2时与光遗传学刺激局限性。与光照强度和脉冲持续时间，但我们的情况oABR振幅增大时，减少刺激的速度提高了^15。响应时间也取决于光照强度，减少当刺激强度增大。我们建议，这些响应是的ChR2的动力学，并表示在SGNS信道的数目的结果。此外，的ChR2会导致多余的毛刺，失败和膜电位总和，在高穗率^27,40。已经有不断的努力来克服这些限制^32,33。最近，我们报道了SGNS使用的ChR2变搭上¹⁴病毒介导的表达，从而减少了光的要求，并允许扣球刺激³⁹的比率较高。最近的宝鼎实验室报道的Chronos，具有更快的动力学和高感光度⁴¹ channelrhodopsin。

我们建议，听觉通路的光遗传学刺激可以促进听觉的研究，在未来，耳蜗假肢。我们认为，它可以提高语音识别和感知韵律和音乐。这种方法进入临床的翻译需要很多关键的发展，如channelrhodopsins的优化，多通道光刺激技术的发展对光学耳蜗植入以及生物安全示范光学stimula灰和SGNS的长期遗传操作。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe