Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

श्रवण तंत्रिका की optogenetic उत्तेजना

Published: October 8, 2014 doi: 10.3791/52069
Automatic Translation
1,2,5, 1,3, 3, 1, 1, 3, 1,2,4
1InnerEarLab, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 2Bernstein Focus for Neurotechnology, University of Goettingen, 3Auditory Systems Physiology Group, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 4Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University of Goettingen, 5Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, University of Guanajuato

Summary

कर्णावत प्रत्यारोपण (सीआईएस) श्रवण तंत्रिका के प्रत्यक्ष बिजली की उत्तेजना से सुनवाई सकें. हालांकि, गरीब आवृत्ति और तीव्रता संकल्प सीआईएस के साथ सुनवाई की गुणवत्ता की सीमा. यहाँ हम श्रवण अनुसंधान और भविष्य सीआईएस के विकास के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में चूहों में श्रवण तंत्रिका की optogenetic उत्तेजना का वर्णन.

Abstract

कर्णावत प्रत्यारोपण (सीआईएस) द्वारा सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स (SGNs) की सीधी बिजली की उत्तेजना प्रत्यारोपित बहरा विषयों 1 6 के बहुमत में खुला भाषण समझ में सक्षम बनाता है. बहरहाल, वर्तमान सीआईएस के साथ ध्वनि कोडिंग के कारण कोक्लीअ 7 9 की tonotopic अक्ष के साथ SGNs की एक बड़ी संख्या को सक्रिय प्रत्येक इलेक्ट्रोड संपर्क में आने से व्यापक वर्तमान प्रसार के लिए गरीब आवृत्ति और तीव्रता संकल्प किया है. ऑप्टिकल उत्तेजना स्थानिक अधिक इसलिए, SGNs की सक्रियता ही सीमित है और वादा किया है कि बिजली की उत्तेजना, कोडिंग के उच्च आवृत्ति संकल्प के लिए एक विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया है. हाल के वर्षों में, कोक्लीअ के प्रत्यक्ष अवरक्त रोशनी श्रवण तंत्रिका 10 में प्रतिक्रियाओं का आह्वान किया गया है. बिजली की उत्तेजना 10,11 और अनिश्चितता अंतर्निहित तंत्र से 12 के रूप में बनी हुई है की तुलना में फिर भी यह अधिक ऊर्जा की आवश्यकता है. यहाँ हम SGNs को प्रोत्साहित करने के लिए optogenetics पर आधारित एक विधि का वर्णनchannelrhodopsin 2 (ChR2) 13 या ChR2 संस्करण पकड़ने 14 के वायरस की मध्यस्थता अभिव्यक्ति की न्यूरोनल अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग कम तीव्रता नीले प्रकाश के साथ. हम एक छोटे से कृत्रिम उद्घाटन (cochleostomy) या दौर खिड़की के माध्यम से ChR2 व्यक्त SGNs को प्रोत्साहित करने के लिए डायोड (μLEDs) और फाइबर युग्मित पराबैंगनीकिरण उत्सर्जन सूक्ष्म प्रकाश का इस्तेमाल किया. हम प्रकाश पैदा की क्षमता (optogenetic श्रवण brainstem प्रतिक्रिया: oABR) की खोपड़ी रिकॉर्डिंग से प्रतिक्रियाओं assayed या श्रवण मार्ग से microelectrode रिकॉर्डिंग से और ध्वनिक और बिजली की उत्तेजना के साथ उन्हें तुलना.

Introduction

विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, 360 मिलियन लोग दुनिया भर में सुनवाई हानि से ग्रस्त हैं. बहरा विषयों में, सीआईएस द्वारा SGNs के प्रत्यक्ष बिजली की उत्तेजना उन्हें 1,2,4,5 के बहुमत में खुला भाषण समझ सकें. हालांकि सीआईएस इसलिए सबसे सफल neuroprosthesis जा रहा है, 200,000 से अधिक लोगों में प्रत्यारोपित किया गया है, वर्तमान कर्णावत प्रत्यारोपण द्वारा संचालित ध्वनि एन्कोडिंग सीमित है. सीआईएस हर एक श्रवण तंत्रिका इस प्रकार कोक्लीअ में Corti के बेकार संवेदी अंग को दरकिनार की एक tonotopic क्षेत्र सक्रिय हो जाता है, जहां इलेक्ट्रोड की एक निश्चित संख्या से बिजली की उत्तेजना के आधार पर कर रहे हैं. सामान्य सुनवाई श्रोताओं हालांकि आज के सीआईएस केवल 12-22 आवृत्ति चैनल 4 के लिए उपयोग, 2,000 से अधिक आवृत्तियों भेदभाव कर सकते हैं. इस वजह से कई अलग अलग ध्वनि आवृत्तियों 8,15 का प्रतिनिधित्व करते हैं कि SGNs की एक बड़ी संख्या को सक्रिय प्रत्येक उत्तेजक इलेक्ट्रोड 7,9, से बड़े पैमाने पर वर्तमान प्रवाह करने के लिए है. इससीमा बहुध्रुवीय उत्तेजना का इस्तेमाल, लेकिन उच्च शक्ति की खपत 16,17 की कीमत पर सुधार किया जा सकता है. ध्वनि तीव्रता के लिए अपने उत्पादन में गतिशील रेंज भी आम तौर पर 6-20 डीबी 4,18 नीचे, सीमित है. इन कारणों के लिए, सुधार आवृत्ति और तीव्रता संकल्प शोर के वातावरण, छंदशास्र बूझ और संगीत की धारणा में भाषण मान्यता उन्नति सीआई प्रदर्शन को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण उद्देश्य हैं.

श्रवण तंत्रिका को उत्तेजित करने के लिए एक अलग विकल्प ऑप्टिकल उत्तेजना है. लाइट सुविधा, बेहतर स्थानिक कारावास का वादा आवृत्ति संकल्प बढ़ रही है और यह भी एक बेहतर तीव्रता संकल्प, जिसके परिणामस्वरूप गतिशील रेंज को चौड़ा करने, एक छोटा सा एसजीएन आबादी को लक्षित करने के लिए ध्यान केंद्रित किया जा सकता है. दरअसल, अवरक्त प्रकाश के साथ कर्णावत उत्तेजना पशु मॉडल 10,11,19 में उत्कृष्ट आवृत्ति संकल्प दिखाया है. उत्तेजना के इस तरह का एक नुकसान यह बिजली की उत्तेजना की तुलना में अधिक ऊर्जा की आवश्यकता है 12,20 उठाया गया है.

अवरक्त उत्तेजना के लिए एक विकल्प के रूप में, हम SGNs प्रकाश के प्रति संवेदनशील रेंडर करने optogenetics रोजगार. Optogenetics गैर invasively के लिए आनुवंशिक और ऑप्टिकल तकनीक को जोड़ती है और विशेष रूप से उच्च अस्थायी परिशुद्धता (समीक्षा 21 23) के साथ कोशिकाओं को नियंत्रित कि एक उपन्यास दृष्टिकोण है. वर्तमान में सबसे अक्सर इस्तेमाल साधन Chlamydomonas reinhardtii की माइक्रोबियल channelrhodopsin 2 (ChR2) जीन की अभिव्यक्ति को रोजगार और एक प्रकाश gated कटियन चैनल 24 एन्कोडिंग, उसके वेरिएंट. ChR2, न्यूरॉन्स में transduced और नीले प्रकाश से सक्रिय करते हैं, इस प्रकार की कोशिकाओं को 24 से 27 depolarizing, गैर चयनात्मक कटियन चैनल में कार्य करता है कि एक 7 transmembrane हेलिक्स प्रोटीन है. ChR2 अच्छी तरह से बताया गया है 24,28- 31 और कई वेरिएंट Actio संशोधित करने के लिए विकसित किया गया हैn स्पेक्ट्रम, gating और पारगम्यता गुण 32,33. हमारे काम का उद्देश्य श्रवण मार्ग के सक्रियण के लिए कर्णावत optogenetics स्थापित करना है. हम श्रवण तंत्रिका को उत्तेजित करने के लिए optogenetic दृष्टिकोण channelrhodopsin की अभिव्यक्ति के लिए सर्पिल नाड़ीग्रन्थि की आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता है कि ध्यान दें. चूहों और चूहों के साथ काम करना tonotopic अक्ष के साथ और जानवरों 36 के पार थोड़ा परिवर्तनशीलता के साथ channelrhodopsin की अभिव्यक्ति प्रदान जो उपलब्ध ट्रांसजेनिक जानवरों 13,34,35, के उपयोग की अनुमति देता है. उचित Cre लाइनों के साथ सशर्त alleles 37 का मेल सेल विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए प्रदान करता है. अन्य जानवरों की सर्पिल नाड़ीग्रन्थि में जीन स्थानांतरण ऐसे optogenetics 38 में एक मानक दृष्टिकोण है कि एडिनो से जुड़े वायरस के रूप में और हम चूहों 36 में अच्छी तरह से काम करने के लिए पता चला है कि वायरस के उपयोग की आवश्यकता है. आनुवंशिक हेरफेर और इस तरह immu के रूप में प्रतिकूल प्रभाव के लिए विदेशी प्रोटीन भालू जोखिम एन्कोडिंग transgenes की अभिव्यक्तिपूर्वोत्तर प्रतिक्रियाओं और / या प्रसार, समझौता हालत या आनुवंशिक रूप से चालाकी से कोशिकाओं की भी मौत. इस प्रदर्शन के प्रयोजन के लिए हम ऑप्टिकली श्रवण मार्ग को प्रोत्साहित करने के लिए तेरा -1 प्रमोटर 13 के तहत सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स में ChR2 व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करें. हम SGNs 39 में संस्करण पकड़ने 14 के वायरस की मध्यस्थता हस्तांतरण का उपयोग कर के रूप में प्रदर्शन अन्य channelrhodopsin वेरिएंट में एक ही उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ध्यान दें.

कर्णावत optogenetics आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता है, यह अनुकूलित एसजीएन उत्तेजना के लिए आणविक ट्यूनिंग प्रदान करता है और बिजली की उत्तेजना की तुलना में जब वादे आवृत्ति और तीव्रता संकल्प सुधार हुआ. श्रवण मार्ग के optogenetic उत्तेजना अनुसंधान सुनवाई के लिए प्रासंगिक है. उदाहरण के लिए, यह ध्वनि localizat में वर्णक्रमीय एकीकरण के लिए आवश्यकता के विश्लेषण में, विकास के दौरान tonotopy की गतिविधि पर निर्भर शोधन की पढ़ाई के क्षेत्र में प्रगति का वादा कियाआयन और केंद्रीय श्रवण प्रणाली में आवृत्ति विशिष्ट अभिवाही अनुमानों के बीच बातचीत की हद तक की.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस काम में प्रस्तुत सभी प्रयोगों प्रायोगिक पशुओं के संरक्षण के लिए जर्मन कानून द्वारा परिभाषित नैतिक मानकों के साथ आयोजित किया गया. पशु कल्याण के लिए विश्वविद्यालय Goettingen की बोर्ड और नियडर्साशन राज्य के पशु कल्याण कार्यालय प्रयोगों को मंजूरी दे दी.

ΜLED-उत्तेजक 1. तैयारी

  1. ΜLEDs के लिए, पहली μLED-उत्तेजक तैयार करते हैं. 200 माइक्रोन सक्रिय सतह से 200 के साथ नीले एल ई डी का उपयोग करें (μLED, सामग्री तालिका देखें).
  2. ΜLED को मिलाप तार. फिर, μLED और epoxy गोंद का उपयोग कनेक्शन encapsulate. Epoxy इलाज बताने के लिए डिवाइस रात भर के लिए छोड़ दें.
  3. यांत्रिक स्थिरता और बिजली के इन्सुलेशन एक पतली गिलास केशिका के माध्यम से तारों कीप के लिए, 1 मिमी बाहरी व्यास borosilicate केशिकाओं का उपयोग करें और केशिका एक यांत्रिक जोड़तोड़ पर रखा जा सकता है (चित्रा -1) ऐसा है कि epoxy के साथ जंक्शन सील.
    नोट: टीयहाँ एक मोटी पर्याप्त (उत्तेजना कलाकृतियों से परहेज) एक अच्छा बिजली के अलगाव पाने के लिए कैप्सूल बनाने का व्यापार बंद है, लेकिन एलईडी Bulla के अंदर आसानी से ले जाने के लिए और cochleostomy पर यह पता लगाने में काफी पतली है. यह एक से अधिक एलईडी तैयार करने के लिए एक अच्छा अभ्यास है.
  4. अच्छा बिजली के अलगाव की पुष्टि करने के लिए, पहली बार तरल में 0.9% NaCl और डुबकी 3 नंगे समाप्त तांबे के तार के साथ एक पेट्री डिश तैयार करते हैं. इस ABR इलेक्ट्रोड के साथ एक जानवर अनुकरण करता है. ABR एम्पलीफायर के लिए और वहाँ से एक आस्टसीलस्कप के लिए तारों कनेक्ट.
  5. फिर, उत्तेजक करने के लिए एलईडी कनेक्ट और यह पूरी तरह से कवर किया जाता है जब तक समाधान में विसर्जित कर दिया. अब से 20 मिनट के लिए अधिकतम स्वीकृत वर्तमान में दालों (चरण 3.1.1 देखें) के साथ एलईडी और उत्तेजना कलाकृतियों के लिए जाँच ड्राइव. वे दिखाई देते हैं, एलईडी त्यागने और एक नया एक कोशिश.

2 सर्जिकल प्रक्रिया

  1. Thy1.2 प्रमोटर के तहत ChR2 व्यक्त 4-10 सप्ताह पुराने ट्रांसजेनिक चूहों (लाइन 9 उपयोगवैंग में एट अल. 13). सर्जरी पशु हेरफेर और को करने के लिए हमेशा स्वच्छ और अच्छी तरह से पहचान शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग करें.
  2. Urethane (1.32 मिलीग्राम / किग्रा), xylazine (5 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण के एक आईपी इंजेक्शन के साथ जानवरों चतनाशून्य, और buprenorphine 0.1 माइक्रोग्राम / छ 0.9% बाँझ NaCl समाधान में पतला और शरीर को बनाए रखने के लिए एक हीटिंग थाली पर माउस जगह 37 डिग्री सेल्सियस तापमान. इस खुराक के साथ, आम तौर पर संज्ञाहरण पूरे प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए रहता है.
    1. पंजा वापसी पलटा द्वारा कामोत्तेजना के लक्षण के लिए प्रारंभिक संज्ञाहरण प्रेरण की जांच के बाद 10 मिनट की शुरुआत. आंदोलनों के मामले में, (Xylazine के बिना) 0.9% बाँझ NaCl समाधान में पतला urethane (.66 मिलीग्राम / किग्रा) और buprenorphine (0.05 माइक्रोग्राम / छ) के रखरखाव खुराक लागू होते हैं. फिर पंजा वापसी पलटा जाँच और पलटा अनुपस्थित है तो ही आगे बढें.
  3. ध्यान से चीरा की तैयारी में retroauricular क्षेत्र दाढ़ी. एक retroauricular का प्रयोग करेंBulla (हवा युक्त मध्य कान गुहा) तक पहुँचने के लिए दृष्टिकोण.
    1. एक माइक्रो संदंश ध्यान से काटना और / या जैसे गर्दन की मांसपेशियों का हिस्सा है, platysma, sternocleidomastoid, और scalenes हटाने के साथ.
    2. ढूँढें और Bulla (चित्रा 1 ए) बेनकाब. कान की झिल्ली (चित्रा 1 ए) की प्रविष्टि को इंगित करता है कि Bulla सतह पर एक अंगूठी के साथ एक विशेषता गोलाकार आकृति के साथ एक बोनी संरचना के रूप में Bulla पहचानें. बस इस अंगूठी नीचे एक इंसुलिन सुई की नोक के साथ एक छेद बनाओ. कोक्लीअ के promontorium (चित्रा 1 बी) सामने आ रहा है कि इस तरह से ठीक एक Rongeur (gnawer) या microforceps साथ Bulla को शामिल किया गया है कि हड्डी को हटाने, वहाँ शुरू करो.
  4. बरकरार झिल्लीदार भूलभुलैया (चित्रा 1 बी) छोड़ने के लिए, देखभाल: cochleostomy के लिए, धीरे से एक छोटी सी खिड़की खोलने के लिए (~ 500-800 माइक्रोन cochleostomy) बोनी कैप्सूल दाढ़ी. दूसरा कर्णावत पर cochleostomy प्रदर्शन करनायह stapedial धमनी से और एपेक्स से बहुत दूर है के रूप में बदल जाते हैं. सुप्रीम खुलने modiolus की एक फ्रैक्चर सहित कोक्लीअ का टूटना उत्पादन कर सकता है.
  5. स्काला tympani के लिए एक ऑप्टिकल फाइबर या μLED-प्रत्यारोपण का एक दौर खिड़की प्रविष्टि के लिए, ध्यान से एक तेज छुरी की नोक के साथ बोनी आला scratching द्वारा दौर खिड़की आला विस्तार (एक ब्लेड संख्या 11 एक अच्छा विकल्प है). हमेशा एक नया ब्लेड या स्केलपेल का उपयोग करें. Stapedial धमनी दौर खिड़की (चित्रा 1 बी) के बहुत करीब चलाता है के रूप में बहुत सावधान रहना होगा.

दो दृष्टिकोण का उपयोग 3 ऑप्टिकल उत्तेजना

  1. Transcochlear उत्तेजना, उपयोग μLEDs या एक फाइबर युग्मित लेजर के लिए.
    1. Cochleostomy पर μLED स्थिति को ध्यान से एक यांत्रिक जोड़तोड़ पर μLED ले जाने केशिका माउंट और. स्थिति और या अनुकूलन करने के लिए एक साधन के रूप में, 1-5 हर्ट्ज पर एक वर्तमान स्रोत (2.7 वी में आम तौर पर 5-40 मा) से 3-10 मिसे लंबे उत्तेजना से हासिल उपयोग oABR,μLED की ientation.
    2. लेजर उत्तेजना के लिए, एक 473 एनएम निरंतर तरंग लेजर और एक 250 माइक्रोन ऑप्टिकल फाइबर (सामग्री देखें) का उपयोग करें. युगल आदर्श बिजली की तेजी से एनालॉग नियंत्रण (और ऑप्टिकल उत्तेजना को परिभाषित करने के लिए एक Acousto ऑप्टिकल डिवाइस या एक तेजी से शटर का उपयोग) प्रदान करता है कि एक नीले लेजर स्रोत के लिए ऑप्टिकल फाइबर. एक micromanipulator का प्रयोग, सीधे cochleostomy पर फाइबर की नोक लगाने और यह दंत सीमेंट (transcochlear उत्तेजना) का उपयोग कर वहाँ तय कर लो.
  2. Intracochlear उत्तेजना के लिए, स्काला tympani में गोल खिड़की के माध्यम से फाइबर डालें. फिर oABR बटोर 1-5 हर्ट्ज पर 10-30 मेगावाट (फाइबर उत्पादन की शक्ति) की 3-10 मिसे लेजर दालों का उपयोग करें. oABR के बड़े आयाम एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में oABR आयाम का उपयोग कर emitter की स्थिति और अभिविन्यास (μLED या फाइबर) के अनुकूलन के लिए आस्टसीलस्कप पर एकल उत्तेजनाओं द्वारा पैदा oABR निरीक्षण करने के लिए प्रयोगकर्ता के लिए सक्षम बनाता है.
  3. अच्छा oABR हासिल किया गया है एक बार, cyanoacr साथ फाइबर तयगोंद ठोस है जब तक ylate गोंद या दंत सीमेंट और इंतजार.
    नोट: यह कोक्लीअ से बाहर आने के कुछ तरल निरीक्षण करने के लिए सामान्य है. हालांकि सीमेंट के polymerization के साथ समस्याओं से बचने के लिए, यह ठीक कपास wicks का उपयोग क्षेत्र सूख उचित है.

OABR के 4 रिकॉर्डिंग

  1. शीर्ष पर और पैरों के पास पीठ पर, पंख के नीचे सुई इलेक्ट्रोड डालें और एम्पलीफायर के लिए उन्हें कनेक्ट.
  2. शिखर के बीच अंतर क्षमता बढ़ाना और subdermal सुइयों कर्णमूल. 50 kHz और फिल्टर (1-10,000 हर्ट्ज) की दर से नमूना. ऑप्टिकल उत्तेजक की स्थिति के अनुकूलन के लिए रिकॉर्डिंग सेटअप के पास आदर्श रूप से एक आस्टसीलस्कप पर फर्क संभावित कल्पना. संकेत औसत (50-1,000x) का प्रयोग करें और ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर पर डाटा स्टोर.

ऑप्टिकली पैदा स्थानीय क्षेत्र क्षमता की 5 रिकॉर्डिंग

  1. एक स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में पशु रखें. संदंश प्रतिशत का उपयोगरैली कपाल overlying त्वचा खींच और कैंची मोटे तौर पर गर्दन की मांसपेशियों खोपड़ी को देते मुद्दे पर जहां आंखों के बीच से देने के साथ एक मंझला चीरा प्रदर्शन करते हैं.
    1. पार्श्व त्वचा को दर्शाते हैं. बाण के समान सिवनी साथ लंबाई periosteum कट और धीरे एक कपास झाड़ू के साथ संपर्क में कपाल हड्डी रगड़ से यह बगल की ओर हटा दें.
  2. प्लेट और लैम्ब्डा की दुम अंत के बीच लगभग 1 मिमी जगह छोड़ने उजागर खोपड़ी पर एक कस्टम धातु प्लेट स्थिति. एक 0.7 मिमी व्यास के साथ सावधानी ड्रिल पार्श्विका हड्डी में एक छेद ड्रिल.
  3. धीरे से एक 0.85 एमएम व्यास पेंच में पेंच - अवर colliculus से दर्ज की क्षमता के लिए संदर्भ के रूप में सेवा करने के लिए (आईसी) - जब तक पेंच सुरक्षित रूप से बांधा नहीं है के रूप में संदंश के साथ पेंच पकड़े. मस्तिष्क मर्मज्ञ बिना पेंच और ड्यूरा के बीच अच्छे संपर्क सुनिश्चित करें. पेंच और cyanoacrylate गोंद के साथ खोपड़ी पर धातु की थाली गोंद.
  4. N ढीलाधीरे खोपड़ी से Eck मांसपेशियों. दुमदारी लगभग 1-2 मिमी के लिए गर्दन की मांसपेशियों खींचो. बेहतर बाण के समान साइनस (एसएसएस) और अनुप्रस्थ साइनस (टीएस) के चौराहे को पहचानें. यदि आवश्यक हो, शारीरिक NaCl समाधान के साथ हड्डी moistening द्वारा खोपड़ी की पारदर्शिता को बढ़ाने के.
    1. एसएसएस और टीएस चौराहे पर सीधे दुम झूठ बोल के रूप में चूहों में आईसी पहचानें. धीरे धीरे और सावधानी से आईसी के स्थान की पहचान करने के बाद एक trepanation विस्तार सीए प्रदर्शन 0.5 मिमी rostrally टीएस को दुमदारी 1.5 मिमी और पार्श्व लगभग 3 मिमी.
    2. एक सफल प्रयोग बंद करना होगा क्योंकि ये एसएसएस और टीएस के लिए किसी भी चोट से बचें. इधर, trepanned हड्डी धीरे इसे आगे बढ़ाने से ढीला हो गया है कि क्या परीक्षण. का प्रयोग संदंश धीरे धीरे हड्डी बंद लिफ्ट.
  5. एक उपयुक्त अनुकूलक के साथ एक micromanipulator पर एक multichannel सरणी और headstage देते हैं. ड्यूरा हटाने के ध्यान से, आईसी में सम्मिलन के दौरान मल्टीचैनल रिकॉर्डिंग सरणी को नष्ट करने से रोकने के लिएएक छोटे चमड़े के नीचे सुई की एक तुला टिप एक हड्डी बढ़त के करीब शुरू करने के साथ.
    1. Stereotaxic फ्रेम से पशु निकालें. Stereotaxic निर्धारण रहने के लिए एक बार पर धातु की थाली को ठीक करें. आईसी अधिक रिकॉर्डिंग जांच की स्थिति और शीर्ष सबसे चैनल सतह पर अभी दिख रहा है कि इस तरह के सूक्ष्म नियंत्रण में डालें.
  6. ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए एक कंप्यूटर पर 32 किलोहर्ट्ज़, कम पास फिल्टर (300 हर्ट्ज) और दुकान की दर से रिकॉर्डिंग सरणी और पार्श्विका हड्डी में संदर्भ पेंच, नमूना के व्यक्तिगत चैनल के बीच अंतर क्षमता बढ़ाना.
  7. सभी जानवरों नम्रता से पूर्व प्रासंगिक इच्छामृत्यु दिशा निर्देशों के अनुसार संवेदनाहारी वसूली के लिए प्रक्रिया के अंत में euthanized किया जाना चाहिए. इच्छामृत्यु के उपयुक्त तरीकों ग्रीवा अव्यवस्था या सीओ 2 साँस लेना शामिल हो सकते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक इष्टतम cochleostomy महत्वपूर्ण है और एक सफल प्रयोग की संभावना बढ़ जाती है. इस खिड़की, नियमित रूप से छोटा है इसका मतलब है, और आंतरिक कर्णावत संरचनाओं की कोई चोट नहीं है. उदाहरण के लिए, खून बह रहा हलकी लीक vascularis की क्षति इंगित करता है. एक अच्छा उदाहरण चित्रा 1 बी में प्रस्तुत किया है.

ChR2 ट्रांसजेनिक चूहों का प्रयोग, ChR2 कोक्लीअ (चित्रा 1C) के भीतर SGNs में व्यक्त किया है. , या तो μLED या लेजर द्वारा ब्लू प्रकाश रोशनी आयाम और तरंग में ध्वनिक ABR (aABR) से अलग जो बड़े oABR, elicits. oABR (चित्रा 1F) aABR (चित्रा 1E) से बड़ा आयाम है, लेकिन वे. इस oABR और eABR अधिक SGNs की दर्शाती भर्ती और / या SGNs की एक अधिक सिंक्रनाइज़ सक्रियण के रूप में व्याख्या की जा सकती है बिजली ABR (eABR, चित्रा 1G) के लिए तुलना कर रहे हैं के लिए से aABR ध्वनि पैदा की.

NT "> दौर खिड़की में डाला गया था eABR एक कृंतक बिजली सीआई (मेड ईएल) प्रकाश में लाना. हम Biphasic वर्तमान दालों (80 μsec चरण की अवधि, 20 μsec interphase अवधि, 500 μA, 6 हर्ट्ज उत्तेजना दर) को प्रोत्साहित करने के लिए इस्तेमाल किया और औसतन 2 गिलास अछूता टंगस्टन इलेक्ट्रोड (अंदर 1 और कोक्लीअ के 1 के बाहर) के साथ 100 उत्तेजना repetitions. उत्तेजना की प्रतिक्रियाएं भी संभव है.

यह oABR वोल्टेज gated सोडियम चैनल के निषेध के बाद या जानवरों 39 त्याग के बाद, जंगली प्रकार के पशुओं में पता लगाने योग्य नहीं हैं कि नोट करना महत्वपूर्ण है. ये नियंत्रण प्रयोगों एक तंत्र संभावना नहीं ऑप्टिकली पैदा ABRs अंतर्निहित रूप में हीटिंग प्रस्तुत करना.

हम केंद्रीय श्रवण प्रणाली में कोशिकी रिकॉर्डिंग द्वारा श्रवण मार्ग के माध्यम से गतिविधि के प्रचार सत्यापित. एक उदाहरण के लिए, कोक्लीअ के optogenetic उत्तेजना श्रवण मध्यमस्तिष्क में भी तंत्रिका गतिविधि हासिल (अवर colliculus, चित्रा2).

चित्रा 1
चित्रा 1: सर्जिकल प्रक्रिया, तैयारी, और oABR रिकॉर्डिंग μLED (ए) गर्दन की मांसपेशियों विदारक Bulla उजागर;. इसकी विशेषता गोलाकार आकृति और ढोल एक मील का पत्थर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो हड्डी में सम्मिलित जहां अंगूठी निरीक्षण करते हैं. स्केल बार 1 मिमी. Bulla (बी) खोलने promontorium का खुलासा होगा. cochleostomy दूसरा कर्णावत मोड़ पर प्रदर्शन किया गया था. अन्य स्थलों उनमें से, stapedial धमनी संकेत कर रहे हैं. स्केल बार 1 मिमी. SGNs में (सी) ChR2-YFP अभिव्यक्ति. GFP (हरा) और phalloidin-AF-568 (लाल) के लिए immunolabeling. स्केल बार 50 माइक्रोन. (डी) μLED, वायर्ड लेकिन अभी तक नहीं केशिका में funneled. स्केल बार 1 मिमी. (ई), (एफ), और (छ) प्रतिनिधि उदाहरणaABR की है, oABR (20 हर्ट्ज, 80 डीबी क्लिक करें) (2 मिसे, 1 हर्ट्ज, 4 मेगावाट / 2 मिमी) कांच अछूता टंगस्टन इलेक्ट्रोड के माध्यम से एलईडी उत्तेजना और eABR (900 μA, 20 हर्ट्ज) द्वारा प्रेरित किया. यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

चित्रा 2
चित्रा 2:. ध्वनिक, optogenetic, और बिजली के कर्णावत उत्तेजना के बाद आईसी से दर्ज की एकल परीक्षण स्थानीय क्षेत्र क्षमता मल्टीचैनल रिकॉर्डिंग जांच का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्रत्येक पैनल के बाईं ओर खींचा है. (ए) विभिन्न आवृत्तियों उच्च आवृत्तियों से अधिक सतही सक्रियण के लिए अग्रणी कम आवृत्तियों के साथ गतिविधि का एक अलग पहचाना ढाल करने के लिए (80 डीबी SPL) नेतृत्व के साथ शुद्ध टन की एकल प्रस्तुतियों. इस अवलोकन evaluat के लिए प्रयोग किया जाता हैआईसी में मल्टीचैनल रिकॉर्डिंग सरणी के ई सफल प्रविष्टि. (बी) भी आईसी अक्सर तुलनीय प्रतिक्रिया आयाम प्रदर्शन में स्थानीय क्षेत्र क्षमता के लिए नेतृत्व ऑप्टिकल उत्तेजना (24 मेगावाट, 6 मिसे अवधि) और (सी) बिजली की उत्तेजना (Biphasic, 80 μsec चरण की अवधि, 20 μsec interphase अवधि, 500 μA). (डी) आईसी के साथ ही सेरिबैलम के एक हिस्से को दोनों सहित सर्जिकल situs. स्केल बार 5 मिमी. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वर्णित प्रयोगों SGNs की optogenetic उत्तेजना का प्रदर्शन, और, सिद्धांत रूप में, यह भी आंतरिक और / या बाहरी बालों की कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, opsins की अभिव्यक्ति प्रदान की. इन प्रयोगों बहुत धैर्य और देखभाल की आवश्यकता होती है. पहले उल्लेख किया है, सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रकाश स्रोत का एक अच्छा cochleostomy / दौर खिड़की प्रविष्टि के रूप में भी एक उपयुक्त स्थिति और अभिविन्यास हैं.

ChR2 का उपयोग करते समय optogenetic उत्तेजना के साथ सीमाएं हैं. उत्तेजना की दर 15 से बढ़ जाती है जब प्रकाश की तीव्रता और नाड़ी की अवधि लेकिन साथ हमारे मामले oABR आयाम बढ़ता में कम हो जाती है. प्रतिक्रिया विलंबता भी कम है, प्रकाश की तीव्रता पर निर्भर करता है जब उत्तेजना की तीव्रता बढ़ जाती. हम इन प्रतिक्रियाओं ChR2 के कैनेटीक्स और SGNs में व्यक्त चैनलों की संख्या का परिणाम है कि प्रस्ताव. इसके अलावा, ChR2 उच्च कील पर अतिरिक्त spikes, विफलताओं और झिल्ली क्षमता योग पैदा कर सकता हैदरों 27,40. इन सीमाओं 32,33 काबू पाने के लिए निरंतर प्रयास किए गए हैं. हमने हाल ही में प्रकाश आवश्यकता कम हो और उत्तेजना 39 की उच्च दर को spiking अनुमति दी है जो SGNs में ChR2 संस्करण पकड़ने 14 के वायरस की मध्यस्थता अभिव्यक्ति का उपयोग करते हैं, की सूचना दी है. सबसे हाल ही में Boyden प्रयोगशाला Chronos, तेज कैनेटीक्स और उच्च प्रकाश संवेदनशीलता 41 के साथ एक channelrhodopsin को सूचना दी.

हम श्रवण मार्ग के optogenetic उत्तेजना कर्णावत prosthetics करने, भविष्य में, श्रवण अनुसंधान में योगदान कर सकते हैं और प्रस्ताव है कि. हम यह भाषण मान्यता और छंदशास्र और संगीत की धारणा में सुधार कर सकते हैं पर विचार करें. क्लिनिक में इस दृष्टिकोण का अनुवाद ऐसे channelrhodopsins का अनुकूलन, एक ऑप्टिकल कर्णावत प्रत्यारोपण के लिए मल्टीचैनल ऑप्टिकल उत्तेजना प्रौद्योगिकी के विकास के साथ ही ऑप्टिकल stimula के लिए जैव सुरक्षा के प्रदर्शन के रूप में कई महत्वपूर्ण घटनाक्रम की आवश्यकताtion और SGNs की लंबी अवधि के आनुवंशिक हेरफेर.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Acknowledgments

इस काम एजुकेशन एंड रिसर्च (Neurotechnology के लिए बर्नस्टीन फोकस टी मोजर करने, 01GQ0810 अनुदान, और मेड ईएल जर्मनी) के जर्मन संघीय मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था; एन Strenzke और टी मोजर जर्मन रिसर्च नेनो माइक्रोस्कोपी और मस्तिष्क की आण्विक फिजियोलॉजी के लिए केंद्र के माध्यम से फाउंडेशन (FZT 103, टी मोजर) और SFB889 के माध्यम से,).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Urethane Sigma Aldrich U2500-100G Anesthetic
Xylazine HCl RXV Sedative and analgesic
Buprenorphine Reckitt Benckiser Analgesic
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue 
Dumont #5 - Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20 Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-09 To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs  Fine Science Tools 16004-16 They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser  Changchun New Industries MLL-III473 100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver  Changchun New Industries DPSSL MLL 100 mW TTL operated laser driver
250 µm optical fiber Any comercial ; e.g. Thorlabs M42L05
Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. PCAOM VIS Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. 160T1-8SAR-24-0.8 Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter Gentec-EO Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED Cree C470UT200 It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System  Tucker-Davis Technologies RZ6-A-P1 It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe Neuronexus a1x16-5mm-100-177-CM16LP  These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill World Precision Instruments 503598 Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs any commercial; e.g. Fine Science Tools 19007-07
Self tapping bone screw any commercial; e.g. Fine Science Tools 19010-10 Reference screw
Micromanipulator any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis Positioning of recording probe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubinstein, J. T. Paediatric cochlear implantation: prosthetic hearing and language development. Lancet. 360 (9331), 483-485 (2002).
  2. Middlebrooks, J. C., Bierer, J. A., Snyder, R. L. Cochlear implants: the view from the brain. Current opinion in neurobiology. 15 (4), 488-493 (2005).
  3. Clark, G. M. The multiple-channel cochlear implant: the interface between sound and the central nervous system for hearing, speech, and language in deaf people-a personal perspective. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1469), 791-810 (2006).
  4. Zeng, F. G., Rebscher, S., Harrison, W., Sun, X., Feng, H. Cochlear implants: system design, integration, and evaluation. IEEE reviews in biomedical engineering. 1, 115-142 (2008).
  5. Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: a remarkable past and a brilliant future. Hearing research. 242 (1-2), 3-21 (2008).
  6. Moore, D. R., Shannon, R. V. Beyond cochlear implants: awakening the deafened brain. Nature neuroscience. 12 (6), 686-691 (2009).
  7. Shannon, R. V. Multichannel electrical stimulation of the auditory nerve in man. II. Channel interaction. Hearing research. 12 (1), 1-16 (1983).
  8. Fishman, K. E., Shannon, R. V., Slattery, W. H. Speech recognition as a function of the number of electrodes used in the SPEAK cochlear implant speech processor. Journal of speech, language, and hearing research: JSLHR. 40 (5), 1201-1215 (1997).
  9. Kral, A., Hartmann, R., Mortazavi, D., Klinke, R. Spatial resolution of cochlear implants: the electrical field and excitation of auditory afferents. Hearing research. 121 (1-2), 11-28 (1998).
  10. Izzo, A. D., Suh, E., Pathria, J., Walsh, J. T., Whitlon, D. S., Richter, C. P. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: a comparison of optic and electric stimuli. Journal of biomedical. 12 (2), 021008 (2007).
  11. Richter, C. P., Rajguru, S. M., et al. Spread of cochlear excitation during stimulation with pulsed infrared radiation: inferior colliculus measurements. Journal of neural engineering. 8 (5), 056006 (2011).
  12. Teudt, I. U., Maier, H., Richter, C. P., Kral, A. Acoustic events and “optophonic” cochlear responses induced by pulsed near-infrared laser. IEEE transactions on bio-medical engineering. 58 (6), 1648-1655 (2011).
  13. Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (19), 8143-8148 (2007).
  14. Kleinlogel, S., Feldbauer, K., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nature neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).
  15. Friesen, L. M., Shannon, R. V., Baskent, D., Wang, X. Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels: comparison of acoustic hearing and cochlear implants. The Journal of the Acoustical Society of America. 110 (2), 1150-1163 (2001).
  16. Donaldson, G. S., Kreft, H. A., Litvak, L. Place-pitch discrimination of single- versus dual-electrode stimuli by cochlear implant users (L). The Journal of the Acoustical Society of America. 118 (2), 623-626 (2005).
  17. Srinivasan, A. G., Shannon, R. V., Landsberger, D. M. Improving virtual channel discrimination in a multi-channel context. Hearing research. 286 (1-2), 19-29 (2012).
  18. Zeng, F. G., et al. Speech dynamic range and its effect on cochlear implant performance. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (1 Pt 1), 377-386 (2002).
  19. Matic, A. I., Walsh, J. T., Richter, C. P. Spatial extent of cochlear infrared neural stimulation determined by tone-on-light masking. Journal of biomedical. 16 (11), 118002 (2011).
  20. Verma, R., Guex, A. A., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hearing research. 310, 69-75 (2014).
  21. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual review of neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  22. Hegemann, P., Nagel, G. From channelrhodopsins to optogenetics. EMBO molecular medicine. 5 (2), 173-176 (2013).
  23. Packer, A. M., Roska, B., Häusser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
  24. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  25. Nagel, G., Szellas, T., Kateriya, S., Adeishvili, N., Hegemann, P., Bamberg, E. Channelrhodopsins: directly light-gated cation channels. Biochemical Society transactions. 33 (Pt 4), 863-866 (2005).
  26. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Current biology: CB. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  27. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  28. Bamann, C., Kirsch, T., Nagel, G., Bamberg, E. Spectral characteristics of the photocycle of channelrhodopsin-2 and its implication for channel function. Journal of molecular biology. 375 (3), 686-694 (2008).
  29. Ritter, E., Stehfest, K., Berndt, A., Hegemann, P., Bartl, F. J. Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 283 (50), 35033-35041 (2008).
  30. Berndt, A., Prigge, M., Gradmann, D., Hegemann, P. Two open states with progressive proton selectivities in the branched channelrhodopsin-2 photocycle. Biophysical journal. 98 (5), 753-761 (2010).
  31. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482 (7385), 369-374 (2012).
  32. Hegemann, P., Möglich, A. Channelrhodopsin engineering and exploration of new optogenetic tools. Nature methods. 8 (1), 39-42 (2011).
  33. Mattis, J., Tye, K. M., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature methods. 9 (2), 159-172 (2012).
  34. Arenkiel, B. R., Peca, J., et al. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  35. Tomita, H., Sugano, E., et al. Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter. PLoS ONE. 4 (11), e7679 (2009).
  36. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  37. Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).
  38. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  39. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  40. Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. Ultrafast optogenetic control. Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).
  41. Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 92 श्रवण कर्णावत प्रत्यारोपण optogenetics channelrhodopsin ऑप्टिकल उत्तेजना बहरापन
श्रवण तंत्रिका की optogenetic उत्तेजना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing,… More

Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing, Z., Hoch, G., Jeschke, M., Strenzke, N., Moser, T. Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve. J. Vis. Exp. (92), e52069, doi:10.3791/52069 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter