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Neuroscience

Estimulación Optogenética del nervio auditivo

Published: October 8, 2014 doi: 10.3791/52069
Automatic Translation
1,2,5, 1,3, 3, 1, 1, 3, 1,2,4
1InnerEarLab, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 2Bernstein Focus for Neurotechnology, University of Goettingen, 3Auditory Systems Physiology Group, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 4Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University of Goettingen, 5Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, University of Guanajuato

Summary

Los implantes cocleares (IC) permitir la audición por la estimulación eléctrica directa del nervio auditivo. Sin embargo, la mala frecuencia y la intensidad de la resolución limita la calidad de la audición con entidades de crédito. Aquí se describe la estimulación optogenética del nervio auditivo en ratones como estrategia alternativa para la investigación auditiva y el desarrollo de las futuras entidades de crédito.

Abstract

La estimulación eléctrica directa de las neuronas del ganglio espiral (NEG) por implantes cocleares (IC) permite la comprensión del habla abierto en la mayoría de los sujetos sordos implantados 1-6. No obstante, la codificación de sonido con IC actuales tiene mala frecuencia y la resolución de intensidad debido a la amplia difusión actual de cada contacto de electrodo activación de un gran número de NEG lo largo del eje tonotópica de la cóclea 7 9. Estimulación óptico se propone como una alternativa a la estimulación eléctrica que promete más espacialmente confinada activación de NEG y, por tanto, una mayor resolución de frecuencia de la codificación. En los últimos años, la iluminación de infrarrojos directa de la cóclea se ha utilizado para evocar respuestas en el nervio auditivo 10. Sin embargo se requiere de altas energías que la estimulación eléctrica 10,11 y la incertidumbre se mantiene en cuanto al mecanismo subyacente 12. Aquí se describe un método basado en la optogenética para estimular NEGcon la luz azul de baja intensidad, el uso de ratones transgénicos con expresión neuronal de canalrodopsina 2 (ChR2) 13 o la expresión mediada por virus de la ChR2 variante Catch 14. Utilizamos micro-diodos emisores de luz (μLEDs) y láseres de fibra acoplada para estimular NEG ChR2 expresan a través de una pequeña abertura artificial (cocleostomía) o la ventana redonda. Analizamos las respuestas por las grabaciones del cuero cabelludo de los potenciales evocados (luz optogenética de respuesta auditiva del tronco cerebral: oABR) o mediante grabaciones de microelectrodos de la vía auditiva y los comparamos con la estimulación acústica y eléctrica.

Introduction

Según la Organización Mundial de la Salud, 360 millones de personas en todo el mundo sufren de pérdida de la audición. En los sujetos sordos, la estimulación eléctrica directa de NEG por IC, permite la comprensión del habla abierta en la mayoría de ellos 1,2,4,5. A pesar de que las entidades de crédito han sido implantadas en más de 200.000 personas, siendo así la neuroprótesis más exitoso, codificación de sonido conducido por los actuales implantes cocleares es limitado. IC se basan en la estimulación eléctrica por un cierto número de electrodos donde cada uno se activa una región tonotópico del nervio auditivo evitando así el órgano sensorial disfuncional de Corti en la cóclea. Oyentes con audición normal pueden discriminar más de 2000 frecuencias, sin embargo los IC de hoy utilizan sólo hasta 12-22 canales de frecuencia 4. Esto es debido al flujo de corriente generalizada de cada electrodo de estimulación 7,9, la activación de un gran número de NEG que representan muchas diferentes frecuencias de sonido 8,15. Estelimitación se puede mejorar utilizando la estimulación multipolar pero a costa de un mayor consumo de potencia 16,17. Su salida de rango dinámico para la intensidad del sonido también es limitado, por lo general por debajo de 6-20 dB 4,18. Por estas razones, la mejora de la frecuencia y la intensidad de la resolución son objetivos importantes para aumentar el rendimiento del IC para mejorar el reconocimiento de voz en entornos ruidosos, comprensión de la prosodia y la percepción musical.

Una opción diferente para estimular el nervio auditivo es la estimulación óptica. La luz puede ser convenientemente centrado para apuntar a una pequeña población SGN, prometiendo mejor confinamiento espacial, el aumento de resolución de frecuencia y también ampliar el rango dinámico, lo que resulta en una mejor resolución intensidad. De hecho, la estimulación coclear con luz infrarroja ha demostrado una excelente resolución de frecuencia en modelos animales 10,11,19. Una desventaja de este tipo de estimulación es que requiere energías más altas que la estimulación eléctrica 12,20.

Como alternativa a la estimulación infrarroja, empleamos la optogenética para hacer NEG sensible a la luz. Optogenética es un nuevo enfoque que combina técnicas genéticas y ópticas de manera no invasiva y controlar específicamente las células con alta precisión temporal (opiniones del 21 al 23). La modalidad actualmente más frecuentemente utilizado emplea la expresión del gen microbiana canalrodopsina 2 (ChR2) de Chlamydomonas reinhardtii y variantes de la misma, que codifica un canal de cationes de luz cerrada 24. ChR2 es una proteína transmembrana-7-hélice que, cuando se transduce en neuronas y activado por la luz azul, actúa como canal de cationes no selectivo, por lo tanto las células despolarizante de 24 27. ChR2 ha sido bien caracterizado 24,28- 31 y muchas variantes se han desarrollado para modificar action del espectro, de compuerta y permeabilidad propiedades 32,33. El objetivo de nuestro trabajo es establecer la optogenética coclear para la activación de la vía auditiva. Tomamos nota de que el enfoque optogenética para estimular el nervio auditivo requiere manipulación genética del ganglio espiral para la expresión de canalrodopsina. Trabajando con ratones y ratas permite el uso de animales transgénicos disponibles 13,34,35, que proporcionan la expresión de canalrodopsina con poca variabilidad a lo largo del eje tonotópico y animales a través de 36. Combinando alelos condicionales 37 con Cre-líneas apropiadas proporciona la expresión específica de la célula. La transferencia de genes en el ganglio espiral de otros animales requiere el uso de virus tales como el virus adeno-asociado que es un enfoque estándar en optogenética 38 y que hemos demostrado que funciona bien en ratones 36. La manipulación y la expresión de transgenes que codifican proteínas exóticas oso riesgos de efectos adversos tales como IMMU genéticarespuestas y / o proliferación ne, estado comprometido o incluso la muerte de las células manipuladas genéticamente. Para el propósito de esta demostración usamos ratones transgénicos que expresan ChR2 en las neuronas del ganglio espiral bajo el promotor Thy-1 13 para estimular ópticamente la vía auditiva. Observamos que otras variantes canalrodopsina se pueden utilizar para el mismo propósito que hemos demostrado utilizando la transferencia mediada por virus de la variante de captura 14 en NEG 39.

Mientras que la optogenética coclear requiere la manipulación genética, ofrece tuning molecular para optimizar la estimulación SGN y promesas mejoró la frecuencia y la intensidad de la resolución en comparación con la estimulación eléctrica. Estimulación optogenética de la vía auditiva es muy relevante para la investigación de la audición. Por ejemplo, promete avances en los estudios de la refinamiento dependiente de la actividad de tonotopia durante el desarrollo, en el análisis de los requisitos de integración espectral en localizat sonidode iones y de la extensión de la interacción entre las proyecciones aferentes frecuencia específica en el sistema auditivo central.

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Protocol

Todos los experimentos presentados en este trabajo se llevaron a cabo con los estándares éticos definidos por la ley alemana de protección de los animales de experimentación. La junta de la Universidad de Goettingen para el bienestar animal y la oficina de bienestar animal del estado de Baja Sajonia aprobaron los experimentos.

1 Preparación de μLED-estimulador

  1. Para μLEDs, primero preparar el estimulador μLED. Utilizar LEDs azules con 200 por 200 m de superficie activa (μLED, consulte la Tabla de Materiales).
  2. Cables de soldadura a la μLED. Entonces, encapsular el μLED y las conexiones con pegamento epóxico. Deje el dispositivo durante la noche para permitir que el cura epoxi.
  3. Para la estabilidad mecánica y el aislamiento eléctrico de los cables de embudo a través de un capilar de vidrio fino, usar 1 mm de diámetro exterior capilares de borosilicato y sellar la unión con epoxi (Figura 1D) de manera que el capilar se puede montar en un manipulador mecánico.
    NOTA: Taquí es una solución de compromiso de hacer de la cápsula lo suficientemente gruesa como para conseguir un buen aislamiento eléctrico (evitando artefactos de estimulación), pero lo suficientemente delgada como para permitir que el LED se mueven libremente dentro de la bulla y ubicarlo en el cocleostomía. Es una buena práctica para preparar más de un LED.
  4. Para confirmar un buen aislamiento eléctrico, primero preparar un plato de Petri con 0,9% de NaCl y dip 3 alambres de cobre desnudos finalizados en el líquido. Esto sirve para simular un animal con electrodos ABR. Conecte los cables al amplificador-ABR y de allí a un osciloscopio.
  5. A continuación, conecte el LED al estimulador y sumergirlo en la solución hasta que esté totalmente cubierto. Conducir el LED con pulsos (consulte el paso 3.1.1) a la corriente máxima permitida por más de 20 minutos y compruebe si hay artefactos de estimulación. Si aparecen, deseche el LED y probar uno nuevo.

2. Procedimiento Quirúrgico

  1. Utilice 4-10 ratones transgénicos semanas de edad, que expresan ChR2 bajo el promotor Thy1.2 (línea 9en Wang et al. 13). Para manipular el animal y realizar la cirugía, siempre use las herramientas quirúrgicas limpias y bien identificados.
  2. Anestesiar a los animales con una inyección ip de una mezcla de uretano (1,32 mg / kg), xilazina (5 mg / kg), y la buprenorfina 0,1 mg / g diluido en solución de NaCl al 0,9% estéril y colocar el ratón sobre una placa de calentamiento para mantener el cuerpo la temperatura a 37 ° C. Con esta dosis, la anestesia normalmente dura para toda el protocolo experimental.
    1. A partir de 10 minutos después de la hora inicial de inducción de la anestesia para detectar signos de la excitación por el reflejo de retirada de la pata. En caso de movimientos, aplicar dosis de mantenimiento de uretano (0,66 mg / kg) y buprenorfina (0,05 mg / g) diluido en 0,9% de solución NaCl estéril (sin xilazina). Vean de nuevo el reflejo de retirada de la pata y proceder sólo si el reflejo está ausente.
  3. Afeitarse cuidadosamente el área retroauricular en la preparación de la incisión. Use un retroauricularabordar para llegar a la bulla (cavidad del oído medio que contiene aire).
    1. Con un micro fórceps diseccionar cuidadosamente y / o eliminar parte de los músculos del cuello, por ejemplo, cutáneo del cuello, esternocleidomastoideo y escalenos.
    2. Encuentra y exponer la bulla (Figura 1A). Identificar la bulla como una estructura ósea con una forma esférica característica con un anillo en la superficie bulla que indica la inserción de la membrana timpánica (Figura 1A). Hacer un agujero con la punta de una aguja de insulina justo debajo de este anillo. Empezar por ahí, retirar el hueso que cubre la ampolla con una fina Pinzas (gnawer) o microforceps de tal manera que el Promontorium de la cóclea está expuesto (Figura 1B).
  4. Para el cocleostomía, afeitarse suavemente la cápsula ósea para abrir una pequeña ventana (cocleostomía: ~ 500-800 micras), teniendo cuidado de dejar intacto el laberinto membranoso (Figura 1B). Realice el cocleostomía en el segundo coclearvuelta ya que es lo suficientemente lejos de la arteria estapedial y desde el vértice. La apertura de los ápice podría producir la rotura de la cóclea incluyendo una fractura de la modiolo.
  5. Para una inserción ventana redonda de una fibra óptica o μLED-implante a escala timpánica, agrandar cuidadosamente el nicho de la ventana redonda por rascarse el nicho óseo con la punta de un bisturí afilado (un número cuchilla 11 es una buena opción). Utilice siempre una nueva cuchilla o bisturí. Tenga mucho cuidado ya que la arteria estapedial corre muy cerca de la ventana redonda (Figura 1B).

3. óptico Estimulación aplicando dos criterios

  1. Para la estimulación transcoclear, uso μLEDs o un láser de fibra acoplada.
    1. Montar el capilar que lleva el μLED en un manipulador mecánico y cuidadosamente coloque el μLED sobre la cocleostomía. Uso oABR, provocada por la estimulación a largo 3-10 mseg a partir de una fuente de corriente (típicamente 5-40 mA a 2,7 V) a 1-5 Hz, como un medio para optimizar la posición y oientation del μLED.
    2. Para la estimulación láser, utilizar una nm láser de onda continua 473 y una fibra óptica de 250 micras (ver Materiales). Pareja de la fibra óptica a una fuente de láser azul que, idealmente, ofrece un control analógico rápido de potencia (bien utilizar un dispositivo acústico-óptico o una obturación rápida para definir el estímulo óptico). El uso de un micromanipulador, localizar la punta de la fibra directamente sobre la cocleostomía y fijarlo allí con cemento dental (estimulación transcoclear).
  2. Para la estimulación intracoclear, inserte la fibra a través de la ventana redonda en la rampa timpánica. A continuación, utilice 3-10 pulsos láser ms de 10 a 30 mW (potencia de salida de la fibra) a 1-5 Hz para obtener oABR. La gran amplitud de oABR permite al experimentador observar oABR evocada por estímulos individuales en el osciloscopio para optimizar la posición y orientación del emisor (μLED o fibra) utilizando oABR amplitud como una lectura de salida.
  3. Una vez bien oABR haberse logrado, fijar la fibra con cyanoacrpegamento ylate o cemento dental y esperar hasta que el pegamento es sólido.
    NOTA: Es normal observar un poco de líquido que sale de la cóclea. Sin embargo, para evitar problemas con la polimerización del cemento, es aconsejable secar la región utilizando mechas de algodón finas.

4. Grabaciones de oABR

  1. Insertar electrodos de aguja debajo de la oreja, en el vértice y en la parte posterior cerca de las piernas y conectarlos al amplificador.
  2. Amplificar la diferencia de potencial entre el vértice y mastoides agujas subdérmicos. Muestra a una velocidad de 50 kHz y el filtro (1-10.000 Hz). Visualizar la diferencia de potencial en un osciloscopio idealmente cerca de la configuración de la grabación para la optimización de la posición del estimulador óptico. Utilice promedio de la señal (50-1,000x) y almacenar los datos en un ordenador para análisis fuera de línea.

5. Grabaciones de Potenciales Evocados ópticamente Campo Local

  1. Colocar el animal en un marco estereotáxico. Con unas pinzas cientorally de tirar de la piel que cubre el cráneo y realizar una incisión media con unas tijeras que se extiende aproximadamente desde entre los ojos hasta el punto que los músculos del cuello se unen al cráneo.
    1. Reflejar la piel lateralmente. Cortar el periostio longitudinalmente a lo largo de la sutura sagital y retírela hacia los lados frotando suavemente el hueso craneal expuesta con un hisopo de algodón.
  2. Coloque una placa de metal por encargo en el cráneo expuesto dejando aproximadamente 1 mm de espacio entre el extremo caudal de la placa y lambda. Con un diámetro de 0,7 mm perforar cuidadosamente perforar un agujero en el hueso parietal.
  3. Tornillo suavemente en un tornillo de diámetro de 0,85 mm - para servir como referencia para potenciales registrados desde el colículo inferior (IC) - que sostiene el tornillo con fórceps, siempre y cuando el tornillo no esté bien sujeta. Asegurar un buen contacto entre el tornillo y la duramadre sin penetrar el cerebro. Pegar el tornillo y la placa de metal en el cráneo con pegamento de cianoacrilato.
  4. Afloje el nEck músculos suavemente desde el cráneo. Tire de los músculos del cuello en sentido caudal para alrededor de 1-2 mm. Identificar la intersección del seno sagital superior, (SSS) y el seno transversal (TS). Si es necesario, aumentar la transparencia del cráneo humedeciendo el hueso con solución fisiológica de NaCl.
    1. Identificar la IC en ratones como mentir directamente caudal a la intersección SSS y TS. Después de la identificación de la ubicación de la IC lenta y cuidadosamente realizar una ca. extiende trepanación 0,5 mm a 1,5 mm rostral caudal a la TS y aproximadamente 3 mm lateralmente.
    2. Evite cualquier daño a la SSS y TS ya que impediría un experimento exitoso. Aquí, probar si el hueso trepanned ha aflojado por suavemente empujándolo. Utilizando unas pinzas lentamente quitan el hueso.
  5. Con un adaptador adecuado adjuntar una matriz multicanal y cabezal de la platina en un micromanipulador. Para evitar la destrucción de la matriz de grabación multicanal durante la inserción en la IC, retire con cuidado la duramadrecon una punta doblada de una pequeña aguja hipodérmica de partida cerca de un borde de hueso.
    1. Quite el animal del marco estereotáxico. Fije la placa de metal sobre una barra de permanecer fijación estereotáxica. Coloque la sonda de grabación sobre el IC y la inserta bajo control microscópico de tal manera que el canal superior más es apenas visible en la superficie.
  6. Amplificar la diferencia de potencial entre los canales individuales de la matriz de grabación y el tornillo de referencia en el hueso parietal, muestra a una velocidad de 32 kHz, filtro de paso bajo (300 Hz) y almacenar en un ordenador para análisis fuera de línea.
  7. Todos los animales deberán ser sacrificados humanitariamente al final del procedimiento antes de la recuperación anestésica de acuerdo con las directrices pertinentes de la eutanasia. Los métodos apropiados de eutanasia pueden incluir dislocación cervical o inhalación de CO2.

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Representative Results

Un cocleostomía óptima es crítica y aumenta la probabilidad de un experimento exitoso. Esto significa que la ventana es regular, pequeña, y no hay ninguna lesión de las estructuras internas cocleares. Por ejemplo, sangrado indica daño de la estría vascular. Un buen ejemplo se presenta en la Figura 1B.

Utilizando ratones transgénicos ChR2, ChR2 se expresa en las NEG dentro de la cóclea (Figura 1C). Azul de luz de iluminación, ya sea por μLED o láser, provoca gran oABR, que difieren de ABR acústica (AABR) en la amplitud y forma de onda. oABR (Figura 1F) tienen amplitudes mayores que AABR (Figura 1E) pero son comparables a ABR eléctrica (EABR, Figura 1G). Esto se puede interpretar como oABR y EABR reflejando el reclutamiento de más NEG y / o una activación más sincronizada de NEG que para el sonido-evocó AABR.

nt "> para obtener EABR un CI eléctrica roedor (MED-EL) se insertó en la ventana redonda. Utilizamos pulsos de corriente bifásica (80 microsegundos duración de la fase, 20 microsegundos de duración interfase, 500 μA, 6 tasa de estimulación Hz) para estimular y promediamos las respuestas a las 100 repeticiones de estímulo. Estimulación con 2 electrodos de tungsteno con aislamiento de vidrio (1 interior y 1 exterior de la cóclea) también es posible.

Es importante señalar que oABR no son detectables en los animales de tipo salvaje, después de la inhibición de los canales de sodio dependientes de voltaje o después de sacrificar los animales 39. Estos experimentos de control hacen que la calefacción como mecanismo subyacente improbable ABRs ópticamente evocados.

Verificamos propagación de la actividad a través de la vía auditiva por grabaciones extracelulares en el sistema auditivo central. Por ejemplo, la estimulación optogenética de la cóclea provocó una actividad también neural en el cerebro medio auditivo (colículo inferior, Figura2).

Figura 1
Figura 1: Procedimiento quirúrgico, μLED preparación y grabación oABR (A) La disección de los músculos del cuello expone la bulla;. observar su forma esférica característica y el anillo donde el tímpano se inserta en el hueso, que puede ser utilizado como un punto de referencia. La barra de escala 1 mm. (B) Apertura de la bulla expondrá el Promontorium. El cocleostomía se realizó en la segunda vuelta coclear. Otros puntos de referencia se indican, entre ellos la arteria estapedial. La barra de escala 1 mm. Expresión (C) ChR2-YFP en NEG. Immunolabeling para GFP (verde) y faloidina-AF-568 (rojo). La barra de escala 50 m. (D) μLED, cable pero todavía no canalizado en el capilar. La barra de escala 1 mm. (E), (F) y (G) ejemplo representativos de AABR (haga clic en, 20 Hz, 80 dB), oABR (2 ms, 1 Hz, 4 mW / mm 2) inducida por la estimulación LED y EABR (900 μA, 20 Hz) a través de los electrodos de tungsteno con aislamiento de vidrio. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: el juicio individual. Potenciales de campo locales grabadas desde la IC después de acústica, optogenética, y la estimulación coclear eléctrica Una representación esquemática de la sonda de grabación de múltiples canales se dibuja en el lado izquierdo de cada panel. (A) las presentaciones individuales de tonos puros con diferentes frecuencias (80 dB SPL) conducen a un gradiente distinguible de la actividad con frecuencias más bajas conducen a la activación más superficiales que las frecuencias más altas. Esta observación se utiliza para EVALUAe inserción exitosa de la matriz de grabación de múltiples canales en la IC. (B) la estimulación óptica (24 mW, 6 mseg de duración) y (C) La estimulación eléctrica (bifásica, 80 microsegundos de duración de fase, 20 microsegundos de duración interfase, 500 μA) también dio lugar a potenciales de campo locales en el IC menudo exhibe amplitudes de respuesta comparables. (D) situs quirúrgico incluyendo tanto IC, así como una parte del cerebelo. La barra de escala 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los experimentos descritos demuestran la estimulación optogenética de las NEG, y pueden, en principio, también pueden utilizarse para estimular las células ciliadas internas y / o externas, siempre que la expresión de opsinas. Estos experimentos requieren mucha paciencia y cuidado. Como se ha mencionado antes, los pasos más críticos son una buena cocleostomía inserción / ventana redonda, así como una posición adecuada y la orientación de la fuente de luz.

Existen limitaciones con estimulación optogenética al utilizar ChR2. En nuestro caso oABR amplitud aumenta con la intensidad de la luz y la duración del pulso, pero disminuye cuando la frecuencia de estimulación aumenta 15. Latencia de respuesta también depende de la intensidad de luz, disminuyendo cuando la intensidad del estímulo aumenta. Proponemos que estas respuestas son el resultado de la cinética de la ChR2 y el número de canales expresadas en las NEG. Además, ChR2 puede causar picos adicionales, los fracasos y el potencial de membrana sumatoria de alto picotasas de 27,40. Se han realizado esfuerzos continuos para superar estas limitaciones 32,33. Recientemente hemos informado de la utilización de la expresión mediada por virus de la ChR2 variante Catch 14 en NEG, lo que redujo el requisito de la luz y permite clavar a mayores tasas de estimulación 39. Más recientemente, el laboratorio Boyden informó sobre Chronos, un canalrodopsina con cinética más rápida y alta sensibilidad a la luz 41.

Proponemos que la estimulación optogenético de la vía auditiva puede contribuir a la investigación auditivo y, en el futuro, a prótesis cocleares. Consideramos que puede mejorar el reconocimiento de voz y la percepción de la prosodia y la música. La traducción de este enfoque a la clínica requiere muchos desarrollos críticos, tales como la optimización de channelrhodopsins, el desarrollo de la tecnología de estimulación óptico multicanal para un implante coclear óptica, así como la demostración de la seguridad de la biotecnología para STIMULA ópticoción y la manipulación genética a largo plazo de NEG.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (Bernstein Focus para Neurotechnology conceder 01GQ0810, a T. Moser, y MED-EL Alemania); la Fundación Alemana de Investigación a través del Centro de Nanotecnología Microscopía y Fisiología Molecular del Cerebro (FZT 103, T. Moser) ya través de la SFB889, a N. Strenzke y T. Moser).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Urethane Sigma Aldrich U2500-100G Anesthetic
Xylazine HCl RXV Sedative and analgesic
Buprenorphine Reckitt Benckiser Analgesic
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue 
Dumont #5 - Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20 Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-09 To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs  Fine Science Tools 16004-16 They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser  Changchun New Industries MLL-III473 100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver  Changchun New Industries DPSSL MLL 100 mW TTL operated laser driver
250 µm optical fiber Any comercial ; e.g. Thorlabs M42L05
Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. PCAOM VIS Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. 160T1-8SAR-24-0.8 Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter Gentec-EO Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED Cree C470UT200 It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System  Tucker-Davis Technologies RZ6-A-P1 It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe Neuronexus a1x16-5mm-100-177-CM16LP  These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill World Precision Instruments 503598 Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs any commercial; e.g. Fine Science Tools 19007-07
Self tapping bone screw any commercial; e.g. Fine Science Tools 19010-10 Reference screw
Micromanipulator any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis Positioning of recording probe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing, Z., Hoch, G., Jeschke, M., Strenzke, N., Moser, T. Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve. J. Vis. Exp. (92), e52069, doi:10.3791/52069 (2014).

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