Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

İşitsel Sinir optogenetic uyarılması

Published: October 8, 2014 doi: 10.3791/52069
Automatic Translation
1,2,5, 1,3, 3, 1, 1, 3, 1,2,4
1InnerEarLab, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 2Bernstein Focus for Neurotechnology, University of Goettingen, 3Auditory Systems Physiology Group, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 4Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University of Goettingen, 5Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, University of Guanajuato

Summary

Koklear implantlar (CI) işitme siniri doğrudan elektriksel stimülasyon ile işitme sağlarlar. Bununla birlikte, kötü sıklığı ve yoğunluğu çözünürlüğü CI ile işitme kalitesini sınırlar. Burada işitsel araştırma ve gelecekteki CI'ler geliştirmek için alternatif bir strateji olarak farelerde işitme sinirinin Optogenetic uyarılmasını açıklamaktadır.

Abstract

Koklear implant (CI) spiral ganglion nöronları (SGNs) Doğrudan elektrik stimülasyonu implante sağır konularda 1- 6 çoğunluğunda açık konuşma anlama sağlar. Yine de, mevcut CI ile ses kodlama nedeniyle koklea 7-9'un tonotopic ekseni boyunca SGNs çok sayıda aktive her elektrot temas geniş akımı yaymak için zayıf sıklığı ve şiddeti çözünürlüğe sahiptir. Optik stimülasyon uzaysal fazla dolayısıyla, SGNs aktivasyonunu sınırlı ve sözler elektriksel stimülasyon, kodlama yüksek frekans çözünürlüğü için bir alternatif olarak önerilmiştir. Son yıllarda, koklea doğrudan kızılötesi aydınlatma işitme siniri 10 tepkiler uyandırmak için kullanılır olmuştur. Elektriksel stimülasyon 10,11 ve belirsizlik altında yatan mekanizma 12 olarak kalır daha Yine de yüksek enerjileri gerektirir. Burada SGNs uyarma optogenetik dayanan bir yöntem açıklanmaktadırchannelrhodopsin 2 (CHR2) 13 veya ChR2 varyant catch 14 virüs aracılı ifade nöronal ifadesi ile transgenik fareler kullanılarak düşük yoğunlukta mavi ışık ile. Biz küçük bir yapay açıklık (cochleostomy) veya yuvarlak pencereden ChR2 ifade SGNs uyarmak için diyotlar (μLEDs) ve fiber lazerler yayan mikro-ışık kullanılır. Biz ışık uyarılmış potansiyeller (Optogenetic işitsel beyinsapı cevabı: oABR) arasında kafa derisi kayıtları ile yanıtları analiz veya işitsel yolundan mikroelektrod görüntüleri ve akustik ve elektrik stimülasyonu ile karşılaştırıldı.

Introduction

Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, 360 milyon insan dünyada işitme kaybına muzdarip. Sağır deneklerde, CI'lerin tarafından SGNs doğrudan elektriksel uyarım bunların 1,2,4,5 çoğunluğunda açık konuşma anlama etkinleştirin. Olsa bile CIs nedenle en başarılı neuroprosthesis olmaktan, 200.000 'den fazla insan implante edilmiş, mevcut koklear implant ile tahrik ses kodlama sınırlıdır. CIs her biri işitme siniri böylece kokleadaki Corti işlevsiz duyusal organı atlayarak bir tonotopic bölgesini aktive elektrotlar belli sayısına göre elektrik stimülasyonu dayanmaktadır. Normal işitme dinleyici Ancak bugünün CI sadece yukarı 12-22 frekans kanalları 4 için kullanmak, 2.000 'den fazla frekansları ayırt edebilir. Bu, pek çok farklı ses frekanslarının 8,15 temsil SGNs çok sayıda aktive her Uyarıcı elektrotun 7,9, geniş çaplı bir akım akışına etmektir. Buçok-kutuplu bir sınırlama stimülasyonu kullanılarak, ancak bu daha yüksek bir güç tüketimi 16,17 pahasına geliştirilebilir. Ses yoğunluğu için kendi çıkış dinamik aralığı da genellikle 6-20 dB 4,18 aşağıda, sınırlıdır. Bu nedenlerle, iyileştirilmesi sıklığı ve yoğunluğu çözünürlüğü gürültülü ortamlarda, prozodi anlama ve müzik algısı konuşma tanıma iyileştirmek CI performansını artırmak için önemli hedeflerdir.

Işitme siniri uyarmak için farklı bir seçenek optik stimülasyon. Işık uygun, daha iyi mekansal hapsini vaat frekans çözünürlüğü artırmak ve aynı zamanda daha iyi bir yoğunluk çözünürlükle sonuçlanır, dinamik yelpazemizi genişleterek, küçük bir SGN nüfusu hedef odaklı olabilir. Nitekim, kızılötesi ışık ile koklear uyarım hayvan modellerinde 10,11,19 mükemmel frekans çözünürlüğü göstermiştir. Uyarım bu tür dezavantajlarından biri, elektrik uyarımı daha yüksek enerjili gerektirmesidir 12,20 artmıştır.

Kızılötesi stimülasyon alternatif olarak, SGNs ışığa duyarlı hale getirmek için optogenetik kullanır. Optogenetik non-invaziv genetik ve optik tekniklerini birleştiren ve özellikle yüksek zamansal hassasiyet (yorum 21-23) ile kontrol hücreleri yeni bir yaklaşımdır. Şu anda en sık kullanılan yöntem Chlamydomonas reinhardtii mikrobiyal channelrhodopsin 2 (CHR2) geninin ifadesini kullanan ve bir ışık geçişli katyon kanalı 24 şifreleyen, bunların türevleri olabilir. CHR2 nöronlar dönüştürülebilen ve mavi ışık ile aktive edildiğinde, böylece hücreler, 24-27, depolarize edici olmayan-selektif katyon kanal hareket eden bir 7-transmembran-sarmal bir proteindir. ChR2, iyi karakterize edilmiştir 24,28- 31 ve pek çok çeşidi Actio değiştirmek için geliştirilmiştirn spektrumu, yolluk ve geçirgenlik özellikleri 32,33. Çalışmalarımızın amacı, işitme yollarının aktivasyonu için koklear optogenetik kurmaktır. Bu işitsel siniri uyarmak için Optogenetic yaklaşım channelrhodopsin ekspresyonu için spiral ganglion genetik manipülasyonu gerektirir unutmayın. Fare ve sıçanlarla yapılan çalışma tonotopic eksenleri boyunca ve 36 hayvan içinde çok az değişkenlik olan channelrhodopsin üretilmesini sağlamak mevcut transgenik hayvanların 13,34,35 kullanımını sağlar. Uygun Cre çizgilerle koşullu alelleri 37 birleştiren hücreye spesifik eksprese edilmesini sağlar. Diğer hayvanların spiral ganglion gen transferi gibi optogenetik 38, standart bir yaklaşımdır adeno-ilişkili virüs ve 36 farelerde iyi çalışması için gösterdi virüsün kullanılmasını gerektirir. Genetik manipülasyon ve bu immünohistokimyası gibi yan etkileri için yabancı proteinlerin ayı riskleri kodlayan Transgenlerin ifadesiNE reaksiyonu ve / veya çoğalması dahil, tehlikeye durum ya da genetik olarak manipüle edilmiş hücrelerden hatta ölüm. Bu gösteri amaçla optik işitsel yolu uyarmak için Thy-1 yükselticisi 13 altında sarmal gangliyon nöronlarındaki ChR2 ifade eden transgenik fareler kullanır. Biz SGNs 39 içine varyant yakalamak 14 virüs kaynaklı transfer ile gösterildiği gibi, diğer channelrhodopsin varyantları, aynı amaç için kullanılabilir unutmayın.

Koklear optogenetik genetik manipülasyon gerektirir iken, optimize SGN uyarılması için moleküler ayar sunar ve elektriksel stimülasyon ile kıyaslandığında sözler sıklığı ve yoğunluğu çözünürlüğü geliştirilmiş. Işitsel yolun optogenetic uyarılması araştırma işitme için son derece önem taşımaktadır. Örneğin, ses localizat spektral entegrasyon için gereksinimi analizi, gelişim sırasında tonotopy bir aktivite-bağımlı arıtma çalışmalarında ilerlemeler vaatiyonu ve merkezi işitme sistemine frekansa özgü iletici çıkıntılar arasındaki etkileşim ölçüde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada sunulan tüm deneyler deney hayvanlarının korunması için Alman yasalarına göre belirlenen etik standartlara yapılmıştır. Hayvan refahı için Üniversitenin Göttingen'de kurulu ve Aşağı Saksonya devletin hayvan refahı ofis deneyleri onaylamıştır.

ΜLED-güdüleyici hazırlanması 1.

  1. ΜLEDs için ilk olarak μLED-stimülatör hazırlar. 200 mikron aktif yüzeyi ile 200 ile mavi LED'ler kullanın (μLED, Malzeme Tablo).
  2. ΜLED için lehim teli. Ardından, μLED ve epoksi yapıştırıcı kullanarak bağlantıları çevreliyor. Epoksi kürü izin cihaz gecede bırakın.
  3. Mekanik stabilite ve elektrik yalıtım ince bir cam kılcal borular vasıtasıyla huni teller için, 1 mm dış çapı borosilikat kılcal kullanmak ve kılcal mekanik bir manipülatöre de monte edilebilir (Şekil 1D), böylece epoksi ile bir bağlantı mühür.
    NOT: TBurada yeterince kalın bir (stimülasyon eserler kaçınarak) iyi elektriksel yalıtım almak için kapsülü yapma trade-off, ancak LED bül içinde serbestçe hareket izin ve cochleostomy üzerine bulmak için yeterince ince. Birden fazla LED hazırlamak için iyi bir uygulamadır.
  4. Iyi elektrik izolasyonu onaylamak için, önce sıvı içine% 0.9 NaCl ve daldırma 3 çıplak erdi bakır teller ile Petri hazırlamak. Bu ABR elektrotlar ile bir hayvanı taklit etmek hizmet vermektedir. ABR-amplifikatör ve oradan bir osiloskop teller bağlayın.
  5. Daha sonra, stimülatörü LED bağlanmak ve tamamen üzerine kadar solüsyon içine daldırın. Daha uzun, 20 dakika boyunca maksimum izin akımında bakliyat (adım 3.1.1) ile LED ve stimülasyon eserler için kontrol Sürücü. Göründükleri takdirde, LED atmak ve yeni bir deneyin.

2. Cerrahi Prosedür

  1. Thy1.2 promotörün kontrolü altında eksprese ChR2 4-10 haftalık transjenik fareler (hat 9 kullanarakWang ve ark. 13). Ameliyat hayvanı işlemek ve gerçekleştirmek için, her zaman temiz ve iyi tanımlanmış cerrahi araçlarını kullanın.
  2. Üretan (1.32 mg / kg), ksilazin (5 mg / kg) karışımı bir IP enjeksiyonu ile hayvanlar anestezi ve buprenorfin 0.1 ug / gr% 0.9 steril sodyum klorür çözeltisi içinde seyreltilmiş ve vücut bakımı için bir ısıtma plakası üzerine yerleştirin fare 37 ° C sıcaklığında karıştırılır. Bu doz ile, tipik olarak anestezi Tüm deney protokolü sürer.
    1. Pençe geri çekme refleksi ile uyarılma belirtileri ilk anestezi indüksiyon kontrolünden sonra 10 dk başlayan. Hareketleri durumunda, (Xylazine olmadan),% 0.9 steril NaCI çözeltisi içinde seyreltilmiş üretan (0,66 mg / kg) ve buprenorfinin (0.05 mg / g) bakım dozu uygulanır. Yine pençe çekme refleksini kontrol ve refleks yoktur sadece devam edin.
  3. Dikkatle kesi hazırlanmasında retroauriküler alan tıraş. Bir retroauriküler kullanınbülü (hava içeren orta kulak boşluğu) ulaşmak için yaklaşım.
    1. Bir mikro forseps dikkatle incelemek ve / veya örneğin boyun kaslarının bir bölümünü, platysma, sternocleidomastoid ve scalenes kaldırmak ile.
    2. Bul ve bül (Şekil 1A) maruz kalmaktadır. Timpanik membrana (Şekil 1A) sokulmasını gösterir bül yüzeyi üzerinde bir halka ile karakterize edilen bir küresel bir şekle sahip olan kemik yapısının olarak bül belirlenmesi. Sadece bu halkanın altındaki bir insülin iğne ucu ile bir delik açın. Koklea promontoryumdan (Şekil 1B) maruz kalmasını sağlayacak şekilde iyi bir Rongeur (kemirgen) veya mikroforcepslerle bül kapsayan kemiği kaldırmak, başla.
  4. Bozulmadan membranöz labirent (Şekil 1B) bırakmak için özen: cochleostomy için, yavaşça küçük bir pencere açmak için (~ 500-800 mikron cochleostomy) kemik kapsül traş. İkinci koklear üzerine uygulayın cochleostomyBu stapedial arter ve apeks yeterince uzak olduğu gibi açın. Apeks Açılış modiolus bir kırığı dahil kokleanın rüptürü üretmek olabilir.
  5. Scala timpani için bir optik fiber veya μLED-implant yuvarlak pencere yerleştirilmesi için, dikkatli bir keskin neşter ucu ile kemik niş çizilerek yuvarlak pencere niş Ayrıntı (bir bıçak sayı 11 iyi bir seçenektir). Her zaman yeni bir bıçak ya da neşter kullanabilirsiniz. Stapedial arter yuvarlak pencere (Şekil 1B) çok yakın çalışır gibi çok dikkatli olun.

İki Yaklaşımlar Kullanılması 3. Optik Uyarım

  1. Transcochlear stimülasyon, kullanım μLEDs veya fiber birleştiğinde lazer için.
    1. Cochleostomy üzerine dikkatli bir şekilde yerleştirin μLED mekanik bir manipülatörde μLED taşıyan kılcal montaj. Konumu ve ya da optimize etmek için bir araç olarak, 1-5 Hz'lik bir akım kaynağı (2,7 V, tipik olarak 5-40 mA) 3-10 ms uzun uyarısıyla gösterilen kullanımlar oABR,μLED bir ientation.
    2. Lazer uyarılması için, bir 473 nm sürekli dalga lazer ve 250 mikron fiber optik (Malzeme) kullanın. Çift ideal güç hızlı analog kontrolü (başka optik uyarıcı tanımlamak için bir akustik-optik cihaz veya hızlı çekim kullanın) sunan bir mavi lazer kaynağına optik fiber. Bir mikromanipülatör kullanarak, doğrudan cochleostomy üzerine fiberin ucunu bulmak ve diş çimentosu (transcochlear stimülasyonu) ile düzeltme var.
  2. Intrakoklear uyarılması için, skala timpani'ye içine yuvarlak pencereden lif yerleştirin. Sonra oABR ortaya çıkarmak için 1-5 Hz 10-30 mW (lif çıkış gücü) 3-10 msn lazer darbeleri kullanın. OABR büyük genlik, bir okuma olarak oABR genliği kullanarak damlatıcının konumunu ve yönünü (μLED veya fiber) optimize etmek için osiloskop tek bir uyarıya cevabın oABR gözlemlemek için deneyci sağlar.
  3. İyi oABR ulaşıldığı zaman, elyaf cyanoacr ile tamirtutkal katı kadar diizopropilazadikarboksilat tutkal veya diş çimento ve bekleyin.
    NOT: Bu kokleadan çıkan bazı sıvı gözlemlemek için normaldir. Ancak çimento polimerizasyonu ile sorunları önlemek için, ince pamuk fitilleri kullanarak bölgeyi kurutmak için önerilir.

OABR 4. Kayıtlar

  1. Tepe üzerinde ve bacaklar yanında arkasında, kulak kepçesi altından iğne elektrotları yerleştirin ve amplifikatör bağlayın.
  2. Tepe arasındaki fark potansiyelini yükseltmek ve cilt altı iğneler mastoidin. 50 kHz ve filtre (1-10,000'dir Hz) oranında örnek. Optik uyancısının pozisyonunu optimize etmek için kayıt kurulumu yakınında ideal bir osiloskopta fark potansiyeli canlandırın. Sinyal ortalamasını (50-1,000x) kullanın ve çevrimdışı analiz için bir bilgisayarda veri depolamak.

Optik Uyarılmış Yerel Alanı Potansiyellerin 5. Kayıtlar

  1. Stereotaktik çerçeve içine hayvan yerleştirin. Forseps cent kullanmaralli kafatası örten deri çekin ve makas kabaca boyun kasları kafatası eklemek noktaya gözleri arasında uzanan bir medyan kesi gerçekleştirmek.
    1. Yanal cildi Reflect. Sagital sütür boyunca uzunlamasına periosteum kesin ve hafifçe bir pamuklu çubukla maruz kraniyal kemik ovularak o yanlamasına kaldırın.
  2. Plaka ve lambda kaudal sonu arasında yaklaşık 1 mm boşluk bırakarak maruz kafatası üzerine özel yapılmış metal plaka yerleştirin. 0.7 mm çaplı dikkatle matkap paryetal kemiğin içine bir delik açın.
  3. Yavaşça 0.85 mm çaplı vida vida - alt colliculus kaydedilmiş potansiyeller için referans olarak hizmet (IC) - sürece vida sabitlendi¤inden değil gibi forseps ile vidayı tutan. Beyin delmeden vida ve dura arasındaki iyi temas sağlamak. Vida ve siyanoakrilat yapıştırıcı ile, kafatası üzerine metal plakanın Tutkal.
  4. N gevşetinyavaşça kafatası eck kaslar. Kaudale dolaylarında 1-2 mm boyun kaslarınızı gerin. Superior sagittal sinüs (SSS) ve transvers sinüsün (TS) kesişimini tanımlayın. Gerekirse fizyolojik NaCI solüsyonu ile kemiği nemlendirilerek kafatası saydamlığı artırır.
    1. SSS ve TS kavşak doğrudan kuyruk yalan olarak farelerde IC belirleyin. Yavaş ve dikkatli bir IC yere tespit edilmesinden sonra bir trepanasyon uzanan ca. gerçekleştirmek 0.5 mm'lik rostral TS kaudal 1.5 mm yanal olarak yaklaşık 3 mm arasındadır.
    2. Başarılı bir deney engel olur, bu gibi SSS ve TS için herhangi bir yaralanma kaçının. Burada, trepanned kemik yumuşak iterek gevşek hale olup olmadığını test edin. Forseps yavaş yavaş kemik kaldırın.
  5. Uygun bir adaptör ile bir micromanipulator üzerine çok kanallı bir dizi ve headstage takın. Dura kaldırmak dikkatlice IC içine yerleştirilmesi sırasında, çok kanallı bir kayıt dizi bozmamak içinKüçük bir derialtı iğne bükük bir ucu kemik kenarına yakın başlayan.
    1. Stereotaksik çerçeve hayvan çıkarın. Stereotaksik sabitleme kalması için bir bara üzerine metal plakayı sabitleyin. IC üzerinde kayıt sonda yerleştirin ve en üst kanal yüzeyinde sadece görünür şekilde mikroskopik kontrol altına sokun.
  6. Çevrimdışı analiz için bir bilgisayar 32 kHz, düşük geçiş filtresi (300 Hz) ve mağaza bir oranda kayıt dizisi ve parietal kemik referans vida, örneğin bir kanal arasında fark artrmaktadr.
  7. Tüm hayvanlar dikkatli biçimde önceden ilgili ötenazi kurallara uygun olarak, anestezik iyileşme prosedürün ardından kurban olmalıdır. Ötenazi uygun yöntemler servikal dislokasyon veya CO 2 solumaktan içerebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optimal bir cochleostomy kritiktir ve başarılı bir deney olasılığını arttırır. Bu pencere, düzenli küçük olduğu anlamına gelir ve iç Kohleanın yaralanma yok yoktur. Örneğin, kanama stria vaskularis hasar gösterir. Bunun iyi bir örneği Şekil 1B 'de verilmiştir.

ChR2 transgenik fareler kullanılarak, ChR2 koklea (Şekil 1C) içindeki SGNs ifade edilir. Ya, μLED veya lazer ile mavi ışık aydınlatma genlik ve dalga akustik ABR (AABR) farklı büyük oABR, ortaya çıkarır. oABR (Şekil 1F) AABR (Şekil 1E) daha büyük amplitüdlere sahiptir ama. bu oABR ve EABR daha SGNs yansıtılması alımı ve / veya SGNs daha senkronize aktivasyon olarak yorumlanabilir elektrik ABR (EABR Şekil 1G), karşılaştırılabilir için daha AABR ses-uyarılmış.

nt "> yuvarlak pencerenin içine sokuldu EABR bir kemirgen elektrik CI (MED-EL) açığa çıkması için. Biz iki fazlı akım darbeleri (80 mikro saniye olduğu faz süresini, 20 mikro saniye olduğu interfaz süresi, 500 uA, 6 Hz stimülasyon oranı) uyarmak için kullanılan ve ortalama 2 cam izolasyonlu tungsten elektrotlar (1 iç ve kokleanın 1 dışından) 100 uyaran tekrarlar. Uyarım tepkiler de mümkündür.

Bu oABR voltaj bağımlı sodyum kanallarının engellenmesi veya sonra hayvanlar kurban ettikten sonra, 39, yabani tip hayvanlardaki algılanamaz olduğunu not etmek önemlidir. Bu kontrol deneyleri bir mekanizmanın olası optik uyarılmış Abrs yatan, ısıtma işlemek.

Biz merkezi işitme sisteminde dışı kayıtların işitsel yolu boyunca faaliyet yayılmasını doğrulanmadı. Bir Örneğin, kokleanın Optogenetic uyarılması işitsel orta beyindeki nöral aktiviteyi ortaya (aşağı kollikuluslar, Şekil2).

Şekil 1
Şekil 1: Cerrahi işlem, hazırlık ve oABR kayıt μLED (A) boyun kaslarını Diseksiyon bülü ortaya koyar;. onun karakteristik küresel şeklini ve kulak zarı bir dönüm noktası olarak kullanılabilir kemik içine ekler halkasını gözlemleyin. Ölçek çubuğu 1 mm arasındadır. Bül (B) Açılış promontoryumdan gösterecektir. Cochleostomy ikinci koklear sırayla gerçekleştirildi. Diğer yerler aralarında, stapes arteri belirtilmiştir. Ölçek çubuğu 1 mm arasındadır. SGNs (C) ChR2 YFP ifadesi. GFP (yeşil) ve Phalloidin-AF-568 (kırmızı) için immünoyaftalama. Ölçek çubuğu 50 mikron. (D) μLED, kablolu ancak henüz kılcal içine akıttığını. Ölçek çubuğu 1 mm arasındadır. (E), (F) ve (G) temsili bir örneği,AABR s, oABR (20 Hz, 80 dB tıklayın) (2 msn, 1 Hz, 4 mW / mm 2) cam izolasyonlu tungsten elektrotlar aracılığıyla LED uyarılması ve EABR (900 uA, 20 Hz) tarafından uyarılan. tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil 2
Şekil 2:. Akustik, optogenetic, ve elektrik koklear uyarıldıktan sonra IC kaydedilen Tek deneme yerel alan potansiyelleri çok kanallı kayıt probunun bir şematik her panelin sol tarafında çizilir. (A) çeşitli frekanslarda daha yüksek frekanslarda daha yüzeysel aktivasyonuna yol açan alt frekansları ile bir etkinlik ayırt Degradeye (80 dB SPL) kurşun ile saf tonlar Tek sunumları. Bu gözlem için kullanılan değerlendirme,IC içine çok kanallı kayıt dizinin E başarılı ekleme. (B) ayrıca IC genellikle karşılaştırılabilir tepki genlikleri gösteren yerel alan potansiyelleri yol Optik stimülasyonu (24 mW, 6 msn süre) ve (C) Elektrik stimülasyon (bifazik, 80 mikro saniye olduğu faz süresi, 20 mikro saniye olduğu interfaz süresi, 500 uA). (D) 'IC yanı sıra beyincik de dahil olmak üzere bir kısmının, hem cerrahi Situs. Ölçek çubuğu 5 mm. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tarif edilen deneyler SGNs en Optogenetic uyarılmasını göstermektedir, ve prensip olarak, aynı zamanda, iç ve / veya dış saç hücrelerini uyarmak için kullanılabilir opsins ekspresyonunu sağladı. Bu deneyler çok sabır ve özen gerektirir. Daha önce de belirtildiği gibi, en önemli adımlar ışık kaynağının iyi cochleostomy / yuvarlak bir pencere ekleme hem de uygun bir konumu ve yönelimi vardır.

ChR2 kullanarak Optogenetic stimülasyonu ile sınırlamaları vardır. Stimülasyon hızı 15 artar ışık yoğunluğu ve darbe süresiyle ama bizim durum oABR genlik artar azalır. Tepki gecikme de azalmaktadır, ışık yoğunluğuna bağlıdır zaman uyaran yoğunluğu artar. Biz bu cevaplar CHR2 kinetikleri ve SGNs ifade kanal sayısının bir sonucudur öneriyoruz. Ayrıca, ChR2 yüksek başak ekstra sivri, arızaları ve membran potansiyeli toplamını neden olabiliroranları 27,40. Bu sınırlamaları aşmak için 32,33 sürekli çaba olmuştur. Son zamanlarda ışık gereksinimi azaltılmış ve uyarım 39 oranlarına izin SGNs spike olarak ChR2 varyant catch 14 virüs aracılı ifade kullanımını bildirmiştir. En son Boyden laboratuvar Chronos, hızlı kinetik ve yüksek ışık hassasiyeti 41 ile bir channelrhodopsin bildirdi.

Biz işitsel yolun Optogenetic uyarılması koklear protezler için, gelecekte, işitsel araştırma katkıda bulunabileceğini düşünmekteyiz. Biz konuşma tanıma aruz ve müzik algısını artırmak olduğunu düşünün. Kliniğe bu yaklaşımın yaptı böyle channelrhodopsins optimizasyonu, optik koklear implant için çok kanallı optik stimülasyon teknolojisinin gelişimi yanı sıra optik stimula için biyogüvenlik gösteri gibi birçok kritik gelişmeleri gerektiriryon ve SGNs uzun Genetik manipülasyon terimi,.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Bu çalışma Eğitim ve Araştırma (Neurotechnology Bernstein Odak T. Moser, 01GQ0810 hibe ve MED-EL Almanya) Alman Federal Bakanlığı tarafından desteklenen; N. Strenzke ve T. Moser Alman Araştırma Nanoseviyede Mikroskopi ve Beyin Moleküler Fizyoloji Merkezi aracılığıyla Vakfı (FZT 103, T. Moser) ve SFB889 yoluyla).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Urethane Sigma Aldrich U2500-100G Anesthetic
Xylazine HCl RXV Sedative and analgesic
Buprenorphine Reckitt Benckiser Analgesic
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue 
Dumont #5 - Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20 Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-09 To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs  Fine Science Tools 16004-16 They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser  Changchun New Industries MLL-III473 100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver  Changchun New Industries DPSSL MLL 100 mW TTL operated laser driver
250 µm optical fiber Any comercial ; e.g. Thorlabs M42L05
Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. PCAOM VIS Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. 160T1-8SAR-24-0.8 Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter Gentec-EO Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED Cree C470UT200 It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System  Tucker-Davis Technologies RZ6-A-P1 It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe Neuronexus a1x16-5mm-100-177-CM16LP  These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill World Precision Instruments 503598 Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs any commercial; e.g. Fine Science Tools 19007-07
Self tapping bone screw any commercial; e.g. Fine Science Tools 19010-10 Reference screw
Micromanipulator any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis Positioning of recording probe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubinstein, J. T. Paediatric cochlear implantation: prosthetic hearing and language development. Lancet. 360 (9331), 483-485 (2002).
  2. Middlebrooks, J. C., Bierer, J. A., Snyder, R. L. Cochlear implants: the view from the brain. Current opinion in neurobiology. 15 (4), 488-493 (2005).
  3. Clark, G. M. The multiple-channel cochlear implant: the interface between sound and the central nervous system for hearing, speech, and language in deaf people-a personal perspective. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1469), 791-810 (2006).
  4. Zeng, F. G., Rebscher, S., Harrison, W., Sun, X., Feng, H. Cochlear implants: system design, integration, and evaluation. IEEE reviews in biomedical engineering. 1, 115-142 (2008).
  5. Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: a remarkable past and a brilliant future. Hearing research. 242 (1-2), 3-21 (2008).
  6. Moore, D. R., Shannon, R. V. Beyond cochlear implants: awakening the deafened brain. Nature neuroscience. 12 (6), 686-691 (2009).
  7. Shannon, R. V. Multichannel electrical stimulation of the auditory nerve in man. II. Channel interaction. Hearing research. 12 (1), 1-16 (1983).
  8. Fishman, K. E., Shannon, R. V., Slattery, W. H. Speech recognition as a function of the number of electrodes used in the SPEAK cochlear implant speech processor. Journal of speech, language, and hearing research: JSLHR. 40 (5), 1201-1215 (1997).
  9. Kral, A., Hartmann, R., Mortazavi, D., Klinke, R. Spatial resolution of cochlear implants: the electrical field and excitation of auditory afferents. Hearing research. 121 (1-2), 11-28 (1998).
  10. Izzo, A. D., Suh, E., Pathria, J., Walsh, J. T., Whitlon, D. S., Richter, C. P. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: a comparison of optic and electric stimuli. Journal of biomedical. 12 (2), 021008 (2007).
  11. Richter, C. P., Rajguru, S. M., et al. Spread of cochlear excitation during stimulation with pulsed infrared radiation: inferior colliculus measurements. Journal of neural engineering. 8 (5), 056006 (2011).
  12. Teudt, I. U., Maier, H., Richter, C. P., Kral, A. Acoustic events and “optophonic” cochlear responses induced by pulsed near-infrared laser. IEEE transactions on bio-medical engineering. 58 (6), 1648-1655 (2011).
  13. Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (19), 8143-8148 (2007).
  14. Kleinlogel, S., Feldbauer, K., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nature neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).
  15. Friesen, L. M., Shannon, R. V., Baskent, D., Wang, X. Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels: comparison of acoustic hearing and cochlear implants. The Journal of the Acoustical Society of America. 110 (2), 1150-1163 (2001).
  16. Donaldson, G. S., Kreft, H. A., Litvak, L. Place-pitch discrimination of single- versus dual-electrode stimuli by cochlear implant users (L). The Journal of the Acoustical Society of America. 118 (2), 623-626 (2005).
  17. Srinivasan, A. G., Shannon, R. V., Landsberger, D. M. Improving virtual channel discrimination in a multi-channel context. Hearing research. 286 (1-2), 19-29 (2012).
  18. Zeng, F. G., et al. Speech dynamic range and its effect on cochlear implant performance. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (1 Pt 1), 377-386 (2002).
  19. Matic, A. I., Walsh, J. T., Richter, C. P. Spatial extent of cochlear infrared neural stimulation determined by tone-on-light masking. Journal of biomedical. 16 (11), 118002 (2011).
  20. Verma, R., Guex, A. A., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hearing research. 310, 69-75 (2014).
  21. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual review of neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  22. Hegemann, P., Nagel, G. From channelrhodopsins to optogenetics. EMBO molecular medicine. 5 (2), 173-176 (2013).
  23. Packer, A. M., Roska, B., Häusser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
  24. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  25. Nagel, G., Szellas, T., Kateriya, S., Adeishvili, N., Hegemann, P., Bamberg, E. Channelrhodopsins: directly light-gated cation channels. Biochemical Society transactions. 33 (Pt 4), 863-866 (2005).
  26. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Current biology: CB. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  27. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  28. Bamann, C., Kirsch, T., Nagel, G., Bamberg, E. Spectral characteristics of the photocycle of channelrhodopsin-2 and its implication for channel function. Journal of molecular biology. 375 (3), 686-694 (2008).
  29. Ritter, E., Stehfest, K., Berndt, A., Hegemann, P., Bartl, F. J. Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 283 (50), 35033-35041 (2008).
  30. Berndt, A., Prigge, M., Gradmann, D., Hegemann, P. Two open states with progressive proton selectivities in the branched channelrhodopsin-2 photocycle. Biophysical journal. 98 (5), 753-761 (2010).
  31. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482 (7385), 369-374 (2012).
  32. Hegemann, P., Möglich, A. Channelrhodopsin engineering and exploration of new optogenetic tools. Nature methods. 8 (1), 39-42 (2011).
  33. Mattis, J., Tye, K. M., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature methods. 9 (2), 159-172 (2012).
  34. Arenkiel, B. R., Peca, J., et al. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  35. Tomita, H., Sugano, E., et al. Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter. PLoS ONE. 4 (11), e7679 (2009).
  36. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  37. Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).
  38. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  39. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  40. Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. Ultrafast optogenetic control. Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).
  41. Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).

Tags

Nörobilim Sayı 92 işitme koklear implant optogenetik channelrhodopsin optik stimülasyon sağırlık
İşitsel Sinir optogenetic uyarılması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing,… More

Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing, Z., Hoch, G., Jeschke, M., Strenzke, N., Moser, T. Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve. J. Vis. Exp. (92), e52069, doi:10.3791/52069 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter