Introduction
Дрожжи модели proteinopathy были разработаны для белок-неправильного сворачивания расстройств, включая боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD) 1-3. Экспрессия белков TDP-43 и FUS, которые misfold у пациентов с БАС, являются токсичными и mislocalize с образованием агрегатов цитоплазматические в дрожжах 1,2. Аналогично, выражение α-синуклеина (α-син), который участвует в PD, является токсичным и mislocalizes с образованием агрегатов цитоплазматические в дрожжах 3. Эти особенности резюмировать фенотипы у больных с этими расстройствами 4,5. Таким образом, модели дрожжей обеспечить полезную платформу для скрининга белков или малых молекул, которые предотвратить или обратить вспять эти фенотипы 2,6-13. Мы заинтересованы в развитии белков, которые способны перевернуть агрегацию и токсичность из-за TDP-43, FUS, и α-син. Мы делаем ставку на Hsp104, в AAA + белка из дрожжей, который однозначно способен разбивке белки и птOM аморфные агрегаты и амилоида в дрожжах, пока это не имеет никакого человеческий гомолог 14,15. Hsp104 тонко настроенный разбить эндогенные дрожжевых прионов и имеет лишь ограниченную способность разбить субстраты, причастных к нейродегенеративных заболеваний человека, которые он никогда не обычно сталкивается 16,17. Таким образом, мы стремимся инженер расширенные версии Hsp104, которые способны действенно детализировать эти человеческие субстраты. Чтобы сделать это, мы строим большие библиотеки из Hsp104 варианты использования ошибкам ПЦР; эти библиотеки могут быть подвергнуты скринингу с использованием моделей дрожжи proteinopathy 17. Мы приняли домена целевой подход к построению и скрининга библиотек, как Hsp104 очень большой 17. Мы изначально была ориентирована на средней области (MD) из Hsp104 17, при том, что аналогичные подходы могут быть использованы для скрининга других доменов. Эти модели позволяют скрининг на disaggregase активности непосредственно, в отличие от альтернативных способов, таких как поверхности дисплея, который является Остальноеricted использовать для мониторинга связывания 18.
Наш протокол базируется на двух шагов скрининга (рисунок 1). Во-первых, варианты Hsp104, которые подавляют токсичность болезни подложки в дрожжах выбраны. Чтобы сделать это, Hsp104 варианты и болезни, связанные подложка котрансформировали в Δ Hsp104 дрожжей. Мы используем Δ Hsp104 дрожжей, чтобы исследовать последовательности пространство Hsp104 в отсутствие дикого типа (WT) Hsp104 17. Важно отметить, что удаление Hsp104 не влияет α-син, FUS или TDP-43 токсичность в дрожжах, и выражение Hsp104 WT обеспечивает минимальное спасение 1,13,17. Дрожжи затем высевали на средств индукции, чтобы индуцировать экспрессию обоих белков. Дрожжей, несущих варианты Hsp104, которые подавляют токсичность заболеваний, ассоциированных роста подложки придают колонии. Эти варианты отобраны для дальнейшего анализа, в то время как колонии поддержания варианты, которые не подавляют токсичности кубик. Тем не менее,ложные срабатывания существенной проблемой в этом экране. Выражение TDP-43, FUS, и α-син являются высокотоксичными, которая создает сильное селективное давление для возникновения спонтанных генетических супрессоров токсичности, не связанной с вариантом Hsp104 выражается. Таким образом, мы использовали среднее экран, который также сравнительно высокая пропускная устранить эти неспецифические супрессоры токсичности 17. В этом вторичном экране, выбранный дрожжи обрабатывают 5-Fluorootic кислоты (5-FOA), чтобы противостоять выберите для Hsp104 плазмиды 19. Штаммы затем оценивали на подложке (TDP-43, FUS, или α-син) токсичность через пятнистость анализа, чтобы гарантировать, что токсичность подложки восстанавливается после потери плазмиды Hsp104. Таким образом, дрожжи, в которых токсичность восстанавливается в этом вторичном экране по-видимому, первоначально отображается подавление токсичность из-за присутствия в варианте Hsp104. Эти дрожжи обозначаются как "хитов" и плазмиды Hsp104 должны затем бытьвосстановлены и последовательность, чтобы определить мутации в Hsp104 ген 17 (рисунок 1). Любые удары должны быть подтверждена путем построения мутацию независимо с помощью сайт-направленного мутагенеза, а затем повторное тестирование для подавления токсичности. Потенциальные приложения для этого протокола широки. С помощью этих методов, библиотеки любого типа белка может быть подвергнуты скринингу на вариантах, которые подавляют токсичность любой подложки белком, который является токсичным в дрожжах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Библиотека поколения
- Для построения библиотеки Hsp104 помощью предметно-ориентированный подвержены ошибкам ПЦР, сначала усиливается область интереса с ошибкой склонны ДНК-полимеразы 20.
- Очищают путем ПЦР-продукт экстракции геля.
- Выполните шаг расширения megaprimer с использованием стандартного протокола сайт-направленного мутагенеза: объединить 50 нг шаблона плазмиды, 250 нг megaprimer, 200 мкМ дНТФ, и с высокой точностью воспроизведения ДНК-полимеразы в ПЦР буфере, и доводят до 50 мкл общего объема с ПЦР воду, содержащую 20 , Запустите стандартную программу ПЦР.
Примечание: специфические праймеры, используемые будет меняться в зависимости от конкретного области гена, который должен быть усилен.- После ПЦР, переварить родительского матричной ДНК с 1 мкл Dpn I рестрикционным ферментом в течение 2 ч при 37 ° С.
- Transform библиотеку, электропорации или другими средствами в ultracompetent Е. палочка и очистить его от минипрепаративную.
ПРИМЕЧАНИЕ: Библиотека поколениеизменяется существенно основывается на целях данного эксперимента. Hsp104 очень большой белок, так что это непрактично, чтобы рандомизировать полный ген, и именно поэтому мы используем конкретному домену ошибкам ПЦР. Кроме того, структура Hsp104 еще недостаточно изучена, что делает конструкцию направленных библиотек захватывающих 21. Библиотеки могут быть построены с использованием направленные или случайные подходы к мутагенеза, с единственным ограничением в том, что шаблон плазмиду основой должны содержать ген URA3, чтобы позволить 5-FOA выбора счетчика на декстрозы массовой информации.
2. Трансформация Hsp104 библиотеки
- Интеграция с заболеванием связаны субстрат в W303aΔ Hsp104 дрожжей с использованием стандартной ацетат лития / PEG протокол 22 преобразования. Выберите отдельных колоний и экран их токсичности для выделения штамма с высокой токсичности заболевания, связанного субстрата 23.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте интегрированную напряжение и Изолат.е одну колонию, чтобы обеспечить равный выражение во всех клетках. Клон болезни субстрата в плазмиды, позволяющей осуществлять интеграцию гена под любой маркер, кроме урацил (мы используем гистидин) и библиотеки Hsp104 в pAG416GAL плазмиды (урацил маркер) 24. Для обеспечения 5-FOA counterselection, гарантировать, что библиотека выражается из плазмиды с урацил маркера. Также могут быть использованы другие штаммы дрожжей. Мы отметили, сходный фенотип подавления токсичности, используя W303a и BY4741 штаммов дрожжей в обоих WT и Δ Hsp104 фонов (Мэй и JS, неопубликованные данные). - Преобразование библиотеки Hsp104 в этом штамме, используя тот же ацетат лития / PEG протокол 22 преобразования. Расширить трансформацию соответствующим образом поддерживать последовательность пространство библиотеки и сохранить предсказанный размер библиотеки.
- Пластина преобразование смесь на noninducing, селективные пластины (например SD-Его-Ura), используя достаточно тарелки вобеспечить рост большого числа колоний. Используйте большие чашки Петри (150 мм), чтобы свести к минимуму количество пластин, необходимых. Восстановление трансформантов с использованием пластин позволяет эффективность трансформации в оценке.
- Transform Hsp104 WT и векторные отрицательных контролей параллельно.
3. Скрининг на борьбе Proteotoxicity
- Вымойте колонии от пластин с помощью раффинозу дополнить отсева СМИ (например SRaff-Его-УРА). Используйте серологические пипетки и стерильные деревянные аппликаторы, чтобы ослабить колонии из чашек. Передача жидкости промывки на 50 мл коническую пробирку и тщательно вихря, чтобы отделить любые скопления клеток. Развести в слегка пасмурную культуры, ОД 600 ~ 0,025.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь раффиноза служит для снятия нагрузки клетки глюкозы опосредованной репрессии индукции, таким образом, грунтовки клетки для галактозы-опосредованной индукции. - Растут разбавленный культуру на ночь в рафиноза отсева СМИ при встряхивании на 30 ºC. Растут Hsp104 WT и векторных элементов управления параллельно.
- На следующее утро, пластины диапазон концентраций на отдельные галактозы (например, SGal-His-URA) пластины (1 мкл до 2 мл концентрированной культуры в 400 мкл общего объема). Покрытие широкий диапазон концентраций будет гарантировать, что пластина будет иметь отдельных колоний. Фактическая концентрация, необходимая зависит от токсичности заболевания подложки, представляющей интерес.
- Нормализовать вектор и Hsp104 WT культур в OD 600 библиотеки и пластины равные объемы сравнить рост библиотеки по сравнению с контролем.
- Для оценки выбора жесткости, пластины библиотеку на глюкозу (гнет) СМИ. Выдержите пластины на 2-3 дней при 30 ° С, пока колонии не появляются (рисунок 2). Оценить полученные колонии и по сравнению с контрольной группой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Часто больших и малых колонии получаются, но нет корреляции между размером колоний и актаivity наблюдается. Экран эти потенциальные хиты, используя технику отбора счетчик 5-ФА (шаг 4), чтобы свести к минимуму ложные срабатывания, перенесенные в последовательности.
4. 5-FOA Counterselection и Зрительные по ликвидации ложных срабатываний
- Серия из отдельных колоний в двух экземплярах на двуспальной и односпальной отсева СМИ (например, SD-Его-Ura и SD-His пластин) и растут в течение ночи при 30 ° С. Повторите с векторными и Hsp104 WT управления. Покрытие на SD-His до 5-FOA повышает эффективность на стадии 5-FOA, увеличивая вероятность того, что клетки будут потеряны плазмиду Hsp104, когда они помещают на 5-FOA.
- Для предотвращения пластины от высыхания, оберните SD-Его-УРА пластин в парафильмом и хранить при температуре 4 ° С при выполнении экран 5-ФА. Эти пластины в конечном итоге будут использоваться для секвенирования.
- Серия колонии от SD-Его пластины до отдельных колоний на 5-FOA пластин (YPD СМИ + 1 г / л 5-FOA) и выдержать в течение 1-2 дней при 30 &# 186; C, пока не появятся отдельные колонии. Здесь, 5-FOA преобразуется в токсичного продукта (5-fluorodeoxyuridine) в клетках, которые содержат ген URA3. Таким образом, любые клетки еще несущие плазмиды Hsp104 умрет.
- Подряд отдельные колонии из пластин 5-FOA в двух экземплярах на SD-Ura и SD-His пластин. Тестовые 3 колонии для каждого удара, чтобы увеличить вероятность того, что по крайней мере одна колония для каждого удара будет потеряли плазмиды Hsp104. Инкубируют в течение 1-2 дней при 30 ° С. Колонии, которые потеряли плазмиды Hsp104 будет расти на SD-His пластин но не SD-Ura пластин.
- Растут штаммы, которые потеряли плазмид Hsp104 для пятнистость анализов. Растут штаммов к насыщению в рафиноза отсева СМИ (например SRaff-His) в 96 шахтах 2 мл пластин в течение ночи при 30 ° С при встряхивании. Не забудьте включить в 5-FOA обработанных контрольных штаммов.
- Подготовка пластин для пятнистость анализа. Используя многоканальную пипетку, аликвоту 200 мкл раффиноза отсева СМИ (например SRaff-His) ва из 96-луночного планшета, оставляя колонны 1 и 7 для аккуратных культур. Аликвоты 250 мкл каждого из 16 насыщенных культур в колонках 1 и 7 пластине.
- Серийно разбавить культур 5 раз в каждом столбце пластины, тщательно перемешивая с помощью многоканальной пипетки. Удалить 50 мкл разбавленного культуры из колонн 6 и 12, чтобы обеспечить конечный объем каждой лунки 200 мкл. Это имеет важное значение для обеспечения даже кровянистые выделения.
- Используя 96-болт репликатора инструмент (FROGGER), определить культуру в двух экземплярах на SD-его и SGal-His пластин. Инкубируйте пластин при 30 ° С в течение 2-3 дней.
- Выбрать для секвенирования штаммы, которые обладают токсичностью по SGal-His пластин, аналогичных средств управления. Откажитесь также ложные штаммов срабатываний, которые не так токсичен, как в контрольной группе. 5-FOA также часто токсичны по себе, так отбросить штаммы, которые проявляют дефект роста на SD-His пластин или которые демонстрируют существенно больше, чем только токсичности заболевания субстрата (
5. Секвенирование Hsp104 Варианты ПЦР колоний
- Скрип ~ 10 мкл дрожжей из пластин SD-Его-Ura в 3 мкл 20 мМ NaOH в ПЦР стрип труб и лизиса клеток путем замораживания-оттаивания. Поместите полосы трубки в морозильной камере -80 ºC в течение 10 мин или в жидком азоте, а затем инкубируют при 99 ° С в амплификаторе в течение 10 мин. Развести штаммов к 100 мкл ПЦР с начальной воды.
- Подготовка ПЦР реакции: 5 мкл ПЦР шаблон, 0,5 мкл 100 мкМ каждого праймера, 0,5 мкл 10 мМ дНТФ, 0,25 мкл ДНК-полимеразы в ПЦР буфере, и составляют до 25 мкл общего объема с ПЦР класса водой. Дизайн праймеров для амплификации рандомизированное регион плюс примерно 100 б.п. на обоих концах. Минимизировать размер усиленного региона увеличить вероятность успешной амплификации. Запустите стандартную программу ПЦР.
- Анализ проб с помощью электрофореза в агарозном геле, чтобы подтвердить амплификацию ПЦР-продукта в соответствующем SIZе. Повторите ПЦР, если нет ни одного присутствует.
ПРИМЕЧАНИЕ: отказ ПЦР обычно из-за слишком большого количества дрожжей используется в шаге 5.1. - Подготовка образцов для секвенирования ДНК. Удалить ПЦР-праймеров либо путем очистки ПЦР или с помощью ПЦР-продукт очистки реагентом, таким как Экзонуклеазой I и креветок фермента щелочной фосфатазы (ExoSAP-IT) деградировать одноцепочечной ДНК. Этот реагент ферментативно ухудшает некорпоративные праймеры и дНТФ, что позволяет более высокой пропускной способности.
- Последовательность ПЦР-продуктов. Не забудьте тщательно проанализировать секвенирования хроматограммы для мутаций. Мутации можно наблюдать в виде смеси двух нуклеотидов в данном месте (рисунок 4), как дрожжи часто питают множество плазмид.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы построили библиотеку вариантов Hsp104 рандомизированных в средней области и отбор ее для подавления TDP-43 токсичности. Библиотека была преобразована и высевали на глюкозу и галактозу пластин (рисунок 2) для оценки жесткости экрана. Единичные колонии отбирали и штаммы были выбраны с помощью счетчика к 5-FOA для удаления плазмиды Hsp104. Эти штаммы были тогда оценены подтвердить, что токсичность было связано с TDP-43 только, без вариантов Hsp104. Зрительные анализы из подмножества вариантов, выбранных на начальном экране, показали, что из 4 колоний, выбранных, 2 отображается Hsp104-опосредованной супрессии TDP-43 токсичность, 1 было ложное срабатывание, и 1 отображается повышенную токсичность после обработки 5-FOA (рис 3). Эти 2 истинные хиты были тогда последовательность ПЦР колоний для идентификации мутаций среднего доменные (рисунок 4). После того, как эти мутации были идентифицированы, мутации был сконструирован Hsp104 заново в родительской плазмиды Hsp104 с помощью сайт-направленного мутагенеза, чтобы подтвердить подавление токсичности. Варианты, выбранные с помощью этих методов были подтверждены для подавления агрегации в дрожжах, четкие предварительно приготовленных агрегатов в биохимических анализах, и подавить дофаминергическую нейродегенерацию в С. Элеганс модель PD 17.
Рисунок 1:. Блок-схема выделения потенцированные варианты Hsp104 Hsp104 библиотеки (URA3 маркерные, GAL1 промоутер) превращаются в дрожжах, содержащего подложек заболевания (HIS3 маркеров, GAL1 промоутер) и обследование на токсичность супрессоров при посеве на вызывающих СМИ. Потенциальные хиты затем отбирают еще раз, используя counterselection шаг 5-ФА для устранения неспецифических супрессоров токсичности. Варианты, выбранные в этой второй стадии, затем секвенировали с помощью ПЦР колоний. HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg" цель = "_ пустой"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Скрининг токсичности супрессоров Дрожжи котрансформировали pAG303GAL-TDP-43 и библиотеке pAG416GAL-Hsp104 высевали на глюкозу (подавляя) или галактозы (вызывающих) СМИ. TDP-43 обладает высокой токсичностью, поэтому очень немногие варианты Hsp104 способны подавлять эту токсичность, и этот экран очень жесткими. Единичные колонии отбирают, как попадает из галактозы пластины для вторичного скрининга 5-FOA. И крупные, и небольшие колонии, как правило, получается, но мы не наблюдали каких-либо тенденций, которые диктуют, как размер колонии коррелирует с активностью.
s.jpg "/>
Рисунок 3:. 5-FOA вторичный экран Дрожжи обрабатывали 5-FOA, чтобы противостоять выберите для плазмиды Hsp104 оценивались путем выявления анализа. Штаммы выращивали в SRaff-His СМИ, серийно разводили 5 раз, и заметил в двух экземплярах на SD-его и SGal-His пластин. Hsp104 A503V является истинным удар, который мы ранее проверены и показывают здесь в качестве контроля вместе с только 17 вектора. Строки 3 и 4 библиотеки хиты, которые сохраняют TDP-43 токсичность следующую потерю подавитель Hsp104. Ряд 5 показывает ложное срабатывание, где TDP-43 больше не токсичны, поэтому неспецифические токсичность подавитель присутствует. Строка 6 показывает напряжение, которое является более токсичным, чем TDP-43, как правило, является, возможно, из-за 5-FOA токсичности. Этот штамм может все еще быть упорядочены, но не может быть допустимым удар.
Рисунок 4. Анальныйyzing результатов секвенирования. Выбранный дрожжи часто содержит несколько плазмид. Таким образом, после секвенирования колония продуктов ПЦР, необходимо позаботиться, чтобы обеспечить любые мутации не забывают в хроматограмм. В этом хроматограмме, два потенциальных мутаций (обозначаемые *) может быть пропущено. В первом случае, существует смесь А и Т, а во втором, смесь T и C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем наш подход к изоляции потенцированные варианты Hsp104, которые подавляют токсичность, ассоциированных с заболеваниями подложек с использованием моделей дрожжи proteinopathy. Используя этот подход, большие библиотеки вариантов может быть показан в высокой пропускной способности, с единственным ограничением является количество вариантов, которые проходят вторичную экран 5-ФА. Выполнив эти действия в 96 формате также, мы обычно экран до 200 ударов в то время, на этапе 5-FOA на протяжении 1-2 недель. Число обращений, полученных на первоначальном этапе скрининга будет варьироваться в значительной степени в зависимости от подложки токсичности и составе каждой конкретной библиотеки. При секвенировании ударов, важно тщательно анализировать все секвенирования хроматограммы, так как смеси плазмид обычно присутствуют в каждой клетке.
Мы иногда отметил большой процент Hsp104 WT изолироваться как "хитов". Это, вероятно, связано с наличием спонтанной генетическойсупрессоров или очень слабая активность. Чтобы обойти эту проблему, мы обнаружили, что скрининг при повышенных температурах (например, 34 ° C) может уменьшить процент "хитов", которые Hsp104 мас. Важно также, чтобы вновь клон любые виртуализированных хиты самостоятельно оценить активность любых новых вариантов и для обеспечения чистоты плазмиды. После того, как новые удары определены, они могут быть оценены для подавления агрегации в дрожжах и характеризуется биохимически.
Мы использовали эти методы, чтобы изолировать потенцированной Hsp104 варианты против TDP-43, FUS, и α-синуклеина и проверить их деятельность с помощью чистой биохимии белков анализов 17. В конечном счете, эти методы могут быть использованы для скрининга библиотек белков против любого субстрата интереса, который токсичен в дрожжах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., et al. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons. Science. 342 (6161), 979-983 (2013).
- Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms. The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).
- Kim, H. J., et al. Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models. Nature. 46 (2), 152-160 (2014).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).
- DeSantis, M. E., et al. Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients. Cell. 151 (4), 778-793 (2012).
- Jackrel, M. E., et al. Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events. Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).
- Wittrup, K. D., Verdine, G. L. Methods in Enzymology. Wittrup, K. D., Verdine, G. L. 503, Academic Press. 13-14 (2012).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. Methods in Enzymology. 154, Academic Press. Lawrence Grossman Ray Wu. 164-175 (1987).
- Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. eds FrancesH Arnold & George Georgiou. 231, Humana Press. 23-28 (2003).
- Saibil, H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D.
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).
