Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikel mit einem starken magnetischen Moments und einer starken Nah-Infrarot (NIR)-Absorption. Das Protokoll schließt auch Antikörper-Konjugation in den Nanopartikeln durch die Fc-Teil für verschiedene biomedizinische Anwendungen, die Molekular spezifisches Targeting erforderlich.
Abstract
Magnetische und plasmonischer Eigenschaften in einem einzigen Nanopartikel kombiniert eine Synergie, die vorteilhaft in einer Reihe von biomedizinischen Anwendungen, einschließlich Kontrastverstärkung in neuartigen magnetoBildgebungsModalitäten, gleichzeitige Erfassung und Detektion von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) und multimodaler Molekularabbildungs Kombination mit photothermische Therapie von Krebszellen. Diese Anwendungen haben großes Interesse an der Entwicklung von Protokollen für die Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikel mit einer optischen Absorption im nahen Infrarotbereich (NIR) und ein starkes magnetisches Moment stimuliert. Hier stellen wir ein neues Protokoll für die Herstellung dieser Hybrid Nanopartikel, die auf einer Öl-in-Wasser-Mikroemulsionsverfahren basiert. Die Besonderheit des hier beschriebenen Protokoll ist die Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikel in verschiedenen Größen von der Grundbausteine, die auch magneto-plasmonischen Eigenschaften. Dieser Ansatz führt zu Nanopartikeln mit einem hohen Höhlesität von magnetischen und plasmonischen Funktionalitäten, die gleichmäßig in der Nanopartikel-Volumen verteilt sind. Die Hybrid-Nanopartikel können durch Anbringen Antikörper durch den Fc-Teil Verlassen der Fab-Teil, der für die Antigenbindung für die Ausrichtung verantwortlich ist verfügbar funktionalisiert werden.
Introduction
Hybrid-Nanopartikeln, die aus unterschiedlichen Materialien mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften können neue Möglichkeiten in der biomedizinischen Anwendungen, einschließlich des multimodalen molekularen Bildgebung, Therapieabgabe und Überwachung, neue Früherkennungstest 1-3 öffnen. Die Kombination von Plasmonen und magnetischen Eigenschaften in einem einzigen Nanopartikel ist von besonderem Interesse, da sie eine sehr starke Lichtstreuung und Absorptionsquerschnitte mit Plasmonenresonanzen und Reaktionsfähigkeit auf ein Magnetfeld verbunden. So wurden beispielsweise magneto-Plasmonen-Nanopartikeln verwendet werden, um den Kontrast in Dunkelfeldabbildung der markierten Zellen durch Anwenden eines zeitlichen Signalmodulation durch einen externen Elektromagneten 3-5 zu erhöhen. Magneto-photoakustische Bildgebung, wo magneto-Plasmonen-Nanopartikel ermöglichen große Verbesserungen in Kontrast und Signal-zu-Hintergrund Ratte - Vor kurzem wurde ein ähnliches Prinzip in der Entwicklung eines neuen bildgebenden Verfahren angewendetio 6,7. Es wurde auch gezeigt, dass die Hybrid-Nanopartikel können zur gleichzeitigen Aufnahme und Detektion von zirkulierenden Tumorzellen im Vollblut und in vivo 8,9 verwendet werden. Weiterhin sind magneto-Plasmonen-Nanopartikel verspricht theranostic Mittel, die für die molekulare spezifischen optischen und MR-Bildgebung in Verbindung mit photothermische Therapie von Krebszellen 10 verwendet werden kann.
Verschiedene Ansätze wurden für die Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikel untersucht. B. Yu et al. Verwendet Zersetzung und Oxidation von Fe (CO) 5 auf Gold-Nanopartikel zu hantelartigen bifunktionellen Au-Fe 3 O 4-Nanopartikel 11 bilden. Wang et al., Gold beschichteten Eisenoxid-Nanopartikel unter Verwendung von thermischen Zersetzungsverfahren 12 synthetisiert. Einige andere Ansätze beruhen auf Beschichtungspolymer oder Amin-funktionellen Moleküle auf Magnetkern-Nanopartikel, gefolgt von Abscheiden von Agalte Schale auf die Polymeroberfläche zu erstellen, um das Hybridpartikel 7,13. Ferner wurden Eisen-Nanopartikeln, Gold-Nanostäbchen über elektrostatische Wechselwirkung oder eine chemische Reaktion 14,15 befestigt. Obwohl diese Ansätze ergeben magneto-Plasmonen-Nanostrukturen, in gewissem Umfang Eigenschaften des magneto-Plasmonen Kombination beeinträchtigen, wie optische Absorption im nahen Infrarot (NIR)-Fenster oder ein starkes magnetisches Moment von denen beide in biomedizinischen Anwendungen höchst wünschenswert sind. Beispielsweise hantel Au-Fe 3 O 4-Nanopartikel eine Plasmonresonanz-Peak bei 520 nm, die ihre Nützlichkeit in vivo durch eine hohe Gewebe Trübung in diesem Spektralbereich begrenzt. Weiterhin werden die von Current Protocols magneto-Plasmonen-Nanopartikel nur eine 11 oder weniger (weniger als 10) 14,15 superparamagnetischen Anteile (beispielsweise Eisenoxid-Nanoteilchen) begrenzt, der deutlich kleiner als sein könnte ACH istin einer dicht gepackten Nanostruktur ieved. Zum Beispiel kann ein dicht gepacktes 60 nm Durchmesser sphärische Nanopartikel in der Größenordnung von eintausend 6 nm superparamagnetische Nanopartikel enthalten. Daher besteht ein großer Raum für Verbesserung der magnetischen Eigenschaften der Hybrid-Nanopartikel. Darüber hinaus sind einige der zuvor beschriebenen Protokolle relativ komplex und erfordern eine sorgfältige Optimierung, um Partikelaggregation während der Synthese 14,15 vermeiden.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikel mit einem starken magnetischen Moment und eine starke NIR-Absorption, die wesentliche Einschränkungen der aktuellen Kunst befasst. Die Synthese hat ihren Ursprung in Öl-in-Wasser-Mikroemulsion Verfahren 16. Es wird bei der Montage von Nanopartikeln mit einer gewünschten Größe aus einem viel kleineren Primärpartikel. Dieser Ansatz wurde erfolgreich auf Nanostrukturen aus einem einzigen Material wie Gold, Eisenoxid und Halbleiter pri produzierenmary Partikel 16. Wir erweitern es zur Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikeln durch, erstens, dass 6 nm Durchmesser Goldhülle / Eisenoxid-Kernteilchen, und dann wird die Montage der primären Hybrid-Partikel in der endgültigen kugelförmigen Nanostruktur. Zusammenbau Primärpartikel in Nanoclustern ermöglicht nicht nur die Verbesserung der Eigenschaften der Nanopartikel Bestandteil, wie die stärkere magnetische Moment Beibehaltung superparamagnetischen Eigenschaften, sondern nutzt auch die Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Nanopartikeln somit neue Merkmale fehlen Bestand Nanopartikel wie stark optische Absorption im NIR-Fenster. Dieses Protokoll liefert Hybrid-Nanopartikel mit einer hohen Dichte von magnetischen und plasmonischer Funktionalitäten. Nach Primärpartikel synthetisiert werden, ist unser Verfahren im wesentlichen eine einfache Ein-Topf-Reaktion. Die Gesamtplasmonresonanz Festigkeit und magnetische Moment durch eine Anzahl von Primärpartikeln und ther bestimmtevor, kann leicht optimiert werden, je nach Anwendung. Darüber hinaus haben wir auch ein Verfahren zur Antikörper-Konjugation entwickelt, um die Hybrid-Nanopartikeln für verschiedene biomedizinische Anwendungen, die molekularen spezifisches Targeting erfordern. Antikörper werden durch den Fc-Teil Verlassen der Fab-Teil, der für die Antigenbindung für die Ausrichtung verantwortlich ist verfügbar angebracht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Messgeraete, Glaswaren Herstellung
- Geeignete Schutzausrüstung, dh, einen Laborkittel, Einweghandschuhe und Augenschutz tragen.
- Anschluss eines Rundkolben mit einem Kondensator und tauchen in einem Siliconöl mit einer Temperatur-Überwachung durch ein Thermometer. Legen Sie eine Wärmequelle (zB Hitzeschild) unter dem Ölbad (Abbildung 1). Verwenden Sie ein Thermometer zur Messung der Temperatur von mehr als 260 ° C ist.
2. Synthese von primären Hybrid Magneto-Plasmonen-Nanopartikel
- Herstellung von magnetischen Kern-Nanopartikel
- Hinzufügen 353,2 mg (1 mmol) Eisen (III)-acetylacetonat, 1 ml (2 mmol) Ölsäure, 1 ml (2 mmol) Oleylamin, 1,292 g (5 mmol) 1,2-Hexadecandiol und 10 ml Phenylether in einen Rund -bottom Kolben.
- Rühren Sie die Mischung kräftig mit einem Magnetrührstab und Wärme auf 250-260 ° C für 1 h unter Rückfluss. Dann warten, bis die Lösung abkühlenauf RT. Sicherzustellen, dass die Temperatur unter 260 ° C bis Siedetemperatur des Phenylether verhindern und ein Platzen der Reaktionsmischung aus dem Rundkolben in den Kondensator.
ACHTUNG: Die Reaktionsmischung wird extrem heiß und die Chemikalien kann zu Reizungen führen. Muss unter einem Abzug arbeiten und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung. Für ausreichende Belüftung sorgen für die Öl-Bad.
Hinweis: Das Ölbad bei 250-260 ° C Temperatur für 1 h bei der Synthese der magnetischen Nanopartikel gehalten. Im Prinzip kann ein Pyrex-Glasschale für diesen Zweck verwendet werden. , Die maximale Dauertemperatur für Pyrex Glas ist jedoch ~ 260 ° C laut Herstellerangabe. Daher stellt ein Metallbehälter eine sicherere Option für die Reaktion, da sie eine höhere Temperatur aushalten und länger in mehreren Läufen kann.
- Abscheidung einer Goldschale auf Magnetkern-Nanopartikel
- 411,5 mg hinzufügen (1,1 mmol) gold-AssTate, 0.25 ml (0.75 mmol) Ölsäure, 1,5 ml (3,0 mmol) Oleylamin, 775,3 mg (3 mmol) 1,2-Hexadecandiol und 15 ml Phenylether in einen Rundkolben gegeben.
- 5 ml Suspension von magnetischen Nanopartikeln aus Schritt 2.1. Das Reaktionsgemisch auf 180 ° C und halten unter Rückfluss für 1 Stunde. Warten, bis die Lösung auf RT abkühlen.
- 50 ml Ethanol zu der primären Hybrid-Nanopartikel, gefolgt von einer Zentrifugation bei 3.250 × g für 15 min ausgefällt.
- Resuspendieren den Niederschlag in 25 ml Hexan mit Hilfe eines Ultraschallbad. 25 ml Ethanol, um die primären Hybrid-Nanopartikeln ausfällt. Zentrifuge bei 3.250 g für 15 min und Resuspendieren des Niederschlags in Hexan. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Trocknen Sie die gefällte Grund Hybrid-Nanopartikeln im Vakuumtrockenschrank O / N. Bestätigen Sie, dass die Partikel vollständig trocken sind.
3. Hybrid Magneto-Plasmonen Nanocluster Synthese und Größentrennung
- Zugeben der Lösung aus Schritt 3.1 zu 10 ml wässrige Lösung von Natriumdodecylsulfat (2,8 mg / ml) in einem 20 ml Glasröhrchen mit Kappen angebracht. Fügen Sie die Aussetzung der primären Hybridnanopartikeln Tropfen für Tropfen zu vermeiden Mischen der beiden Phasen vor dem nächsten Schritt.
- Beschallen die zweiphasige Lösung in einem Ultraschallbad für 2 h, gefolgt von Erhitzen in einem Wasserbad bei 80 ° C für 10 min. Warten, bis die Lösung auf RT abkühlen.
- Füllen Sie Wasser in die Arbeitsebene der Linie Ultraschallbad. Zentrieren Sie die Glasflasche in der Ultraschallbad. Eine Emulsion bildet sich sofort zwischen den beiden Phasen. Schütteln Sie die Zwei-Phasen-Lösung mit der Hand nach Beginn der Ultraschallbehandlung; dies erleichtert das Mischen zwischen der Phase, die primäre Hybrid-Nanopartikeln und der unteren wässrigen Phase.
Hinweis: Beachten Sie that der Ultraschallgerät erwärmt sich nach 2 Stunden Betrieb.
- Füllen Sie Wasser in die Arbeitsebene der Linie Ultraschallbad. Zentrieren Sie die Glasflasche in der Ultraschallbad. Eine Emulsion bildet sich sofort zwischen den beiden Phasen. Schütteln Sie die Zwei-Phasen-Lösung mit der Hand nach Beginn der Ultraschallbehandlung; dies erleichtert das Mischen zwischen der Phase, die primäre Hybrid-Nanopartikeln und der unteren wässrigen Phase.
- Zentrifugieren Sie die Hybrid-Nanocluster Suspension bei 100 g für 30 min. Sammeln sowohl des Präzipitats und des Überstandes. Resuspendieren Niederschlag in 0,1 mM Natriumcitrat unter 10 min Beschallung. Die erwartete Größe der Nanocluster beträgt ~ 180 nm im Durchmesser.
- Den Überstand aus Schritt 3.3 auf einen neuen konischen Röhrchen.
- Zentrifugieren der Suspension aus Schritt 3.4 bei 400 × g für 30 min. Sammeln sowohl des Präzipitats und des Überstandes. Resuspendieren Niederschlag in 0,1 mM Natriumcitrat unter 10 min Beschallung. Die erwartete Größe der Nanocluster beträgt ~ 130 nm im Durchmesser.
- Den Überstand aus Schritt 3.5 auf einen neuen konischen Röhrchen.
- Zentrifugieren der Suspension aus Schritt 3.6 bei 1.500 xg für 30 min. Den Niederschlag und resuspendieren in 0,1 mM Natriumcitrat unter 10 min Beschallung. Die erwartete Größe der Nanocluster ist ~ 90 nm Durchmesser.
- Geben Sie 300 _6, l-Nanocluster Suspension zu einer 96-Well-Mikrotiterplatten-Lesegerät zum Messen einer UV-VIS-NIR-Absorptionsspektrum. Fallen 10 ul Nanocluster Suspension auf Kohlenstoff beschichteten Kupfernetz für TEM-Aufnahmen.
4. Konjugation von monoklonalen Antikörpern gegen Nanocluster
- Planen 100 ul monoklonaler Antikörperlösung (1 mg / ml) in PBS, pH 7,2, beispielsweise Anti-Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2)-Antikörper oder Anti-Epidermal Growth Factor Receptor 1 (EGFR)-Antikörper.
- Fügen Sie die Antikörperlösung aus Schritt 4,1 bis 3,9 ml 4 mM HEPES, pH 7,2. Zentrifuge die Lösung durch einen 10 K MWCO Filterzentrifuge bei 3.250 · g für 20 min bei 8 ° C hat. Resuspendieren des Antikörpers in 4 mM HEPES, pH 7,2, auf ein Endvolumen von 100 ul.
HINWEIS: Dieser Schritt wird ausgeführt, um das Originalmedium in der Antikörper-Lösung mit HEPES ersetzen. - Werden 10 ul 100 mM NaIO 4 bis 100 ul der Antikörperlösung. Decken Sie die Reaktionsgefäß mit einem Al-uminum Folie bei RT und mischen für 30 min mit einem Orbitalschüttler.
- Die Reaktion wird durch Zugabe von 500 ul 1x PBS.
- Add 2 ul 46,5 mM Linkerlösung (dithiolaromatic PEG6-CONHNH 2) zu der Antikörperlösung aus Schritt 4.4 und Schütteln für 1 h bei RT.
- Die Lösung wird unter Verwendung eines 10 k MWCO-Filter-Zentrifuge bei 3.250 × g für 20 min bei 8 ° C hat. Resuspendieren Antikörper in 1 × PBS auf ein Endvolumen von 100 ul, die zu einer Antikörperkonzentration von ~ 1 mg / ml führt.
- Mischungs 100 ul Nanocluster Suspension bei OD ~ 1,0 mit 1 ul modifizierter Antikörper aus Schritt 4.6 (1 mg / ml) für 120 min bei RT.
- Fügen Sie 10 ul 10 -3 M 5 kDa PEG Thiol und schütteln für 15 min bei RT.
- Zentrifugieren Sie die Lösung bei 830 x g für 3 min. Überstand verwerfen und das Sediment resuspendieren in 100 ul 2% w / v 5 kDa PEG in PBS, pH 7,2.
- Messen Sie das Absorptionsspektrum der antikörperkonjugierten Nanocluster und vergleichen zu ter Absorptionsspektrum des nackten Nanocluster. Erwarten Sie ein paar Nanometer-Rotverschiebung nach der Konjugation.
- Wenn die Nanopartikel Aggregat durch eine deutliche Verschiebung zu einem Anstieg der OD im Bereich rot-NIR gezeigt, erhöhen die Konzentration der Thiol-PEG bis 5 x 10 -3 M. Auch erhöhen die Inkubationszeit mit Thiol PEG bis 30 min und eine Verringerung der Schleuderdrehzahl in 200 × g-Schritten.
- Für die Krebszellmarkierung Test, fügen Sie die Antikörper konjugiert Nanopartikel aus Schritt 4,9 bis Krebszellsuspension in entweder Medium oder 1x PBS (1 ml ~ 10 6 Zellen) zugeben und 60 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ein Schema für die Synthese von immunotargeted magneto-Plasmonen-Nanocluster in Figur 2 gezeigt. Zuerst werden die magnetischen Fe 3 O 4 Eisenoxid-Nanopartikel durch thermische Zersetzungsverfahren synthetisiert. Dann wird eine dünne ca. 1 nm Gold-Schale an den Eisenoxidkern Teilchen durch thermische Zersetzung abgeschieden. Die primären ca. 6 nm Hybrid-Nanopartikel dienen als Saatgut zu magneto-plasmonischen Nanocluster durch den Einsatz einer Öl-in-Wasser-Mikroemulsion Ansatz zu schaffen. Die Nanocluster mit monoklonalen Antikörpern für die molekulare spezifisches Targeting funktionalisiert.
Die Größe der synthetisierten Eisenoxidkern Nanopartikel ~ 5 nm im Durchmesser. Nach Gold-Schale Abscheidung auf den Magnetkern, zu ~ 6 nm Durchmesser die Größe des Primär Eisenoxid-Kern / Schale-Nanopartikel Gold steigt. Die kolloidalen Farbe von braun zu Eisenoxid-Nanopartikel nach rot-violett nach der Abscheidung der Goldhülle undschließlich zu orange-graue Farbe nach dem Zusammenbau der primären Teilchen in ~ 180 nm Durchmesser kugelförmige Nanocluster (Abbildung 3). UV-Vis-Spektren zeigen, daß primäre Eisenoxid-Kern / Schale-Nanopartikel Gold haben eine ausgeprägte Resonanzspitze bei 530 nm, die in nackten Eisenoxidteilchen vorhanden ist (Abbildung 4). Nach der Clusterbildung, ändert sich das Spektrum deutlich und zeigt eine starke breite NIR-Absorption (Abbildung 4).
Die Nanocluster mit monoklonalen Antikörpern konjugiert, um gezielt Biomoleküle von Interesse. Die Konjugation Protokoll verwendet einen heteroPolyethylenGlykol (PEG)-Linker, die Fc-Region der Antikörper wird an der Oberfläche Nanocluster. Ein Ende der Linker eine Hydrazideinheit die mit oxidierten glykosylierten Antikörpereinheit zusammenwirkt. Das andere Ende der Linker eine Dithiol-Gruppe, die eine starke Affinität zu der Oberfläche der Gold-Nanocluster ist. Um demonstratE Molekulares Targeting wir eine EGFR positiven Hautkrebs-Zelllinie (A-431) und einen HER2-positivem Brustkrebs-Zelllinie (SK-BR-3) gewählt haben. Nanocluster wurden entweder mit Anti-EGFR-oder Anti-HER2-Antikörper, gefolgt von Mischen mit A-431 oder SK-BR-3-Krebszellen, die jeweils funktionalisiert. In 5 ist ein heller gold orange Farbe auf-431 und SK-BR-3-Krebszellen anzeigt Molekular spezifische Bindung von Nanoclustern zu entsprechenden Rezeptoren auf Krebszellen. Im Gegensatz dazu ungezielte PEGyliertem Nanocluster nicht mit Krebszellen interagieren. Diese Ergebnisse zeigen, molekulare Spezifität der funktionalisierten Nanocluster.
Figur 1 einen experimentellen Aufbau für die Synthese von primären Eisenoxid-Kern / Schale-Nanopartikel Gold. Ein Rundkolben wird mit einem Kondensator verbunden ist. Die Reaktion wird in einem Ölbad unter Temperaturkontrolle durch ein Thermometer durchgeführt.
Abbildung 2. Eine schematische Darstellung wichtige Schritte in der Synthese von immunotargeted magneto-plasmonischen Nanocluster. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. TEM-Aufnahmen und die Farbe des kolloidalen Suspensionen von Nanopartikeln: (links) Eisenoxid-Kern-Nanopartikel; (Mitte) mit Gold beschichteten Eisenoxid-Nanopartikel; (Rechts) Hybrid magneto-plasmonischen Nanocluster. Maßstab für TEM-Aufnahmen ist 50 nm auf. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52090/52090fig3highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. (A) UV-VIS-NIR-Spektren von Eisenoxid-Kern-Nanopartikel (blau), mit Gold beschichteten Eisenoxid-Nanopartikel (grün) und Hybrid-Magneto-Plasmonen-Nanoclustern (rot). (B) UV-VIS-NIR-Spektren von Hybrid magneto-plasmonischen Nanocluster mit verschiedenen Größen: 90 nm (blau), 130 nm (grün) und 180 nm (rot). Alle Spektren sind normiert auf eine an der maximalen Absorption, um Unterschiede in der spektralen Profile zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. ank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Molekulare Spezifität der Antikörper konjugiert magneto-plasmonischen Nanocluster: (links) EGFR exprimieren, A-431-Hautkrebs-Zellen mit EGFR-Nanocluster inkubiert; (Mitte) HER2 exprimierenden SK-BR-3-Brustkrebszellen mit HER2-Nanocluster gezielt inkubiert; (Rechts) A-431-Zellen mit ungezielte PEGyliertem Nanocluster inkubiert. Die gelb-orange Farbe der Zellen zeigt die erfolgreiche Kennzeichnung von funktionalisierten Nanocluster; grau-bläuliche Farbe entspricht einer endogenen Streuung von Zellen. Die Bilder wurden mit aufrechten Mikroskop mit 20X Dunkelfeld-Objektiv und Xe-Lampe Anregung erworben. Maßstab ist 10 um._blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1. Dieses Video vergleicht eine Reaktion von A-431 Krebszellen entweder durch primäre Nanopartikel oder Nanocluster zu einem externen Magnetfeld bezeichnet. Beide Partikeltypen, bei denen mit Anti-EGFR-Antikörper für spezifische Ausrichtung der EGFR-(+) A431-Zellen konjugiert. Zuerst wurde ein Eppendorf-Röhrchen mit einer Suspension der markierten Zellen gefüllt. Dann wurde ein Magnet angeordnet neben dem Rohr und der Bewegung der Zellen wurde bei ca. 10 mm von dem Magneten abgebildet. Der Film auf der linken Seite zeigt Zellen, die mit primären Nanopartikel (6 nm im Durchmesser), und der Film auf der rechten Seite markiert - Zellen, die mit magneto-Plasmonen Nanocluster (100 nm Durchmesser) gekennzeichnet. Die Filme wurden mit einem inversen Mikroskop im Hellfeld-Modus mit einem 20x-Objektiv erworben. Maßstab ist 100 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische Schritte in der erfolgreichen Synthese von magneto-plasmonischen Nanocluster gehört es, hoch monodispersen primären Gold-Schale / Eisenoxid-Kern-Nanopartikel und Leitung der Selbstorganisation der Primärpartikel in Nanocluster. Das Molverhältnis zwischen den Primärteilchen und Tenside spielen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Größenverteilung der Nanocluster. Ungleichmäßige Größenverteilung der primären Nanopartikel können die Bildung von großen Aggregaten während der Montage der magneto-plasmonischen Nanocluster verursachen. Darüber hinaus ist die Methode der Mikroemulsion Nanocluster Bildung stützt sich auf amphiphile Tenside: hydrophoben Schwanzgruppen halten primären Nanopartikel zusammen und hydrophile Kopfgruppen stabilisiert Nanocluster in einer wässrigen Lösung. Konzentration der Tenside bestimmt Nanocluster Montage: eine hohe Konzentration würde, um die Bildung von kleineren Nanocluster oder einzelne Primärpartikel und einer niedrigen Konzentration würde in Teilchenaggregation Ergebnis führen.
Ein hydrodynamischer Radius von Nanoclustern steigt um ~ 10-15 nm nach der Antikörper-Konjugation. Diese Durchmesserzunahme korreliert well mit ca. 12 nm Größe eines IgG-Antikörpers, die durch den Fc-Teil an die Oberfläche der Nanopartikel gebunden ist. Daher ist die Änderung des hydrodynamischen Durchmesser in Übereinstimmung mit der Richtungs Konjugationschemie von Antikörper durch den Fc-Teil, der in dem Protokoll durchgeführt wird. Zetapotenzial von Nanopartikeln verlagert sich von -47,6 mV vor Antikörperkonjugation -7,0 mV nach der Konjugation. Die Veränderung der Oberflächenladung liefert zusätzliche Beweise für Antikörper Konjugation an Nanocluster.
Die Besonderheit des hier beschriebenen Protokoll ist die Synthese von magneto-Plasmonen-Nanopartikel in verschiedenen Größen von der Grundbausteine, die auch magneto-plasmonischen Eigenschaften. Diese Methode bietet einen einfachen Weg, um gleichzeitig die Festigkeit der Plasmonen und magnetischen Eigenschaften der resultierenden Nanostrukturen. Im Gegensatz dazu verwendet vorangegangenen Protokolle eine Versammlung von Plasmonen und magnetische Nanomaterials, wo ein Material diente als Matrize für die Abscheidung der anderen; bei diesem Ansatz ein Material befindet Volumen und die andere Oberfläche der resultierenden Nanostrukturen. Magneto-Plasmonen-Nanopartikel in der Literatur berichtet haben signifikant niedrigere Dichte und die Gesamtmenge der superparamagnetischen Teilchen im Vergleich zu den Nanocluster durch unser Protokoll 14,15 hergestellt. In unserem Verfahren magnetischen und Plasmonen-Einheiten sind gleichmäßig über das Volumen des Hybrid magneto-Plasmonen-Nanopartikel verteilt sind.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die NIH Zuschüsse R01 R01 CA103830 EB008101 und unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PYREX 50 ml round bottom boiling flask with short neck & 24/40 [ST] joint | Corning | 4320A-50 | Thermal decomposition reaction |
| PYREX 41 x 300 mm 5-bulb Allihn condenser with 24/40 [ST] outer/inner joints | Corning | 2480-300 | Thermal decomposition reaction |
| Silicone oil | Fisher | S159-500 | Oil bath |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-351 | Heat the reacton with stirring function |
| Thermometer | ThermoWorks | 221-092 | Measure temperature |
| Iron(III) acetylacetonate | Fisher | AC11913-0250 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Oleic acid 99% | Fisher | A195-500 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Gold(III) acetate | Fisher | AA3974206 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Hexane | Fisher | H292-1 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Phenyl ether 99% | Fisher | AC13060-0025 | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| 1,2-Hexadecanediol 90% | Sigma | 213748-50G | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Oleylamine 70% | Sigma | O7805-100G | Material for primary hybrid nanoparticles synthesis |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-100 | Cluster synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma | W302600 | Cluster synthesis |
| Monoclonal anti-EGF receptor antibody | Sigma | E2156 | Cell labeling specificity test |
| Monoclonal anti-HER2 antibody | Sigma | AMAB90627 | Cell labeling specificity test |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | Oxidate Fc region of antibodies |
| Dithiolaromatic PEG6-CONHNH2 | SensoPath Technologies | SPT-0014B | Heterofunctional linker for antibody conjugation to nanoclusters |
| Methoxy-PEG-thiol, 5 k | Creative PEGworks | PLS-604 | Passivate the remaining gold surface after antibody conjugation |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801008 | Protein purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffer |
| PBS, 1x solution | Fisher | BP2438-20 | Buffer |
| UV-Vis spectroscopy | BioTek | Synergy HT | Obtain spectrum |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Separation |
| Transmission Electron Microscope | FEI | TECNAI G2 F20 X-TWIN | Obtain morphology of nanostructures |
| Upright microscope | Leica | DM6000 | Obtain dark-field images |
| Sonicator | Branson | 1510 | Sonication |
| Carbon film 300 mesh grid | EMS | CF300-Cu | TEM imaging |
| 96-well plate | Corning | 09-761-145 | UV-Vis reading plate |
References
- Bigall, N. C., Parak, W. J., Dorfs, D. Fluorescent, magnetic and plasmonic—Hybrid multifunctional colloidal nano objects. Nano Today. 7, 282-296 (2012).
- Gautier, J., Allard-Vannier, E., Herve-Aubert, K., Souce, M., Chourpa, I. Design strategies of hybrid metallic nanoparticles for theragnostic applications. Nanotechnology. 24, 432002 (2013).
- Wei, Q., Wei, A. Optical imaging with dynamic contrast agents. Chemistry. 17, 1080-1091 (2011).
- Aaron, J. S., et al. Increased optical contrast in imaging of epidermal growth factor receptor using magnetically actuated hybrid gold/iron oxide nanoparticles. Optics express. 14, 12930-12943 (2006).
- Song, H. -M., Wei, Q., Ong, Q. K., Wei, A. Plasmon-resonant nanoparticles and nanostars with magnetic cores: synthesis and magnetomotive imaging. ACS nano. 4, 5163-5173 (2010).
- Qu, M., et al. Magneto-photo-acoustic imaging. Biomedical optics express. 2, 385-396 (2011).
- Jin, Y., Jia, C., Huang, S. -W., Donnell O&39, M., Gao, X. Multifunctional nanoparticles as coupled contrast agents. Nature communications. 1, 41 (2010).
- Wu, C. -H., et al. Versatile Immunomagnetic Nanocarrier Platform for Capturing Cancer Cells. ACS. 7, 8816-8823 (2013).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature nanotechnology. 4, 855-860 (2009).
- Larson, T. A., Bankson, J., Aaron, J., Sokolov, K. Hybrid plasmonic magnetic nanoparticles as molecular specific agents for MRI/optical imaging and photothermal therapy of cancer cells. Nanotechnology. 18, 325101 (2007).
- Yu, H., et al. Dumbbell-like bifunctional Au-Fe3O4 nanoparticles. Nano letters. 5, 379-382 (2005).
- Wang, L., et al. Monodispersed core-shell Fe3O4@Au nanoparticles. The journal of physical chemistry. B. 109, 21593-21601 (2005).
- Wang, H., Brandl, D. W., Le, F., Nordlander, P., Halas, N. J. Nanorice: a hybrid plasmonic nanostructure. Nano letters. 6, 827-832 (2006).
- Hu, X., et al. Trapping and Photoacoustic Detection of CTCs at the Single Cell per Milliliter Level with Magneto‐Optical Coupled Nanoparticles. Small. 9, 2046-2052 (2013).
- Truby, R. L., Emelianov, S. Y., Homan, K. A. Ligand-mediated self-assembly of hybrid plasmonic and superparamagnetic nanostructures. Langmuir. 29, 2465-2470 (2013).
- Bai, F., et al. A Versatile Bottom‐up Assembly Approach to Colloidal Spheres from Nanocrystals. Angewandte Chemie International Edition. 46, 6650-6653 (2007).
