Sintesi di Immunotargeted magneto-plasmonica nanocluster

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica con un forte momento magnetico e un forte vicino infrarosso (NIR) assorbanza. Il protocollo include anche anticorpi coniugazione alle nanoparticelle attraverso la porzione Fc per varie applicazioni biomediche che richiedono il targeting molecolare specifico.

Abstract

Proprietà magnetiche e plasmoniche combinati in una singola nanoparticella forniscono una sinergia che è vantaggioso in un certo numero di applicazioni biomediche, tra cui aumento del contrasto in nuove modalità di imaging magnetomotrice, la cattura simultanea e il rilevamento delle cellule tumorali circolanti (CTC), e imaging molecolare multimodale combinato con la terapia fototermica delle cellule tumorali. Queste applicazioni hanno stimolato notevole interesse per lo sviluppo di protocolli per la sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica con assorbanza ottica nel vicino infrarosso (NIR) regione e un forte momento magnetico. Qui, presentiamo un nuovo protocollo per la sintesi di tali nanoparticelle ibride che si basa su un metodo di microemulsione olio-in-acqua. La caratteristica unica del protocollo qui descritto è la sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica di varie dimensioni dai blocchi principali che hanno anche caratteristiche magneto-plasmonici. Questo approccio produce nanoparticelle con elevata densità di funzionalità magnetici e plasmoniche che sono distribuiti in modo uniforme in tutto il volume di nanoparticelle. Le nanoparticelle ibride possono essere facilmente funzionalizzati collegando anticorpi attraverso la porzione Fc lasciando la porzione Fab che è responsabile per il legame disponibili per il targeting antigene.

Introduction

Nanoparticelle ibride costituite da materiali diversi con diverse proprietà fisico-chimiche possono aprire nuove opportunità in applicazioni biomediche, tra cui l'imaging molecolare multimodale, l'erogazione della terapia e monitoraggio, nuovi screening e test diagnostici ^1-3. La combinazione di proprietà plasmonici e magnetiche in una singola nanoparticella è di particolare interesse perché fornisce molto forti diffrazione della luce e di assorbimento sezioni associati risonanze plasmon e risposta ad un campo magnetico. Ad esempio, le nanoparticelle magneto-plasmonica sono stati usati per aumentare il contrasto in campo scuro imaging cellule marcate applicando un segnale di modulazione temporale tramite un elettromagnete esterno ^3-5. Più di recente, un principio simile è stato applicato nello sviluppo di una nuova modalità di imaging - di imaging magneto-fotoacustica, dove nanoparticelle magneto-plasmonica consentono grandi miglioramenti in contrasto e segnale-fondo rattoio ^6,7. È stato anche dimostrato che le nanoparticelle ibride possono essere usate per la cattura e la rilevazione di cellule tumorali circolanti nel sangue intero e in vivo ^8,9 simultanea. Inoltre, le nanoparticelle magneto-plasmonica sono promettenti agenti Theranostic che possono essere utilizzati per l'imaging ottico e RM specifico molecolare combinato con la terapia fototermica delle cellule tumorali ^10.

Diversi approcci sono stati esplorati per la sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica. Ad esempio, Yu et al. Decomposizione utilizzati e ossidazione di Fe (CO) ₅ su nanoparticelle di oro per formare manubri come bifunzionali Au-Fe ₃ O ₄ nanoparticelle ^11. Wang et al. Hanno sintetizzato oro rivestite di ferro ossido di nanoparticelle utilizzando il metodo di decomposizione termica ^12. Alcuni altri approcci si basano su polimeri di rivestimento o di ammine molecole funzionali su nanoparticelle magnetiche di base seguita dalla deposizione di agguscio vecchio sulla superficie del polimero per creare l'ibrido particelle ^7,13. Inoltre, le nanoparticelle di ossido di ferro sono state allegate alla nanotubi d'oro tramite interazioni elettrostatiche o una reazione chimica ^14,15. Sebbene questi approcci producono nanostrutture magneto-plasmoniche, compromettono ad alcune proprietà misura della combinazione magneto-plasmonica come assorbanza ottica nella finestra vicino infrarosso (NIR) o un forte momento magnetico che sono entrambi altamente auspicabile in applicazioni biomediche. Ad esempio, manubri Au-Fe ₃ O ₄ nanoparticelle hanno un picco di risonanza plasmonica a 520 nm, che limita la loro utilità in vivo a causa della elevata torbidità tessuto in questo intervallo spettrale. Inoltre, le nanoparticelle magneto-plasmonica prodotti da protocolli attuali sono limitate a un solo ¹¹ o pochi (meno di 10) ^14,15 frazioni superparamagnetiche (ad esempio, nanoparticelle di ossido di ferro) che è significativamente inferiore potrebbe essere achieved in una nanostruttura densamente. Ad esempio, una densamente diametro 60 nm nanoparticelle sferiche può contenere dell'ordine di un migliaio di 6 nanoparticelle superparamagnetiche nm. Pertanto, non vi è spazio per migliorare le proprietà magnetiche delle nanoparticelle ibride un grande. Inoltre, alcuni dei protocolli precedentemente descritti sono relativamente complesse e richiedono un'attenta ottimizzazione per evitare l'aggregazione delle particelle durante la sintesi ^14,15.

Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica con un forte momento magnetico e una forte assorbanza NIR che affronta i principali limiti della tecnica attuale. La sintesi ha le sue origini nel metodo ¹⁶ olio-in-acqua microemulsione. Si basa su assemblaggio di nanoparticelle di una dimensione desiderata di una molto più piccole particelle primarie. Questo approccio è stato utilizzato con successo per la produzione di nanostrutture da un unico materiale come l'oro, ossido di ferro, e semiconduttori primary particelle ^16. Abbiamo esteso alla sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica da, prima, rendendo le particelle fondamentali ossido di 6 nm di diametro shell oro / ferro e, quindi, l'assemblaggio delle particelle ibride primarie nella nanostruttura sferica finale. Montaggio particelle primarie in nanocluster non solo consente di migliorare le proprietà delle nanoparticelle costituenti, come ad esempio il raggiungimento di un momento magnetico più forte preservando le proprietà superparamagnetiche, ma si avvale anche delle interazioni tra i singoli nanoparticelle creando così nuove caratteristiche assenti dalle nanoparticelle costituenti, come forte assorbanza ottica nella finestra NIR. Questo protocollo produce nanoparticelle ibride ad alta densità di funzionalità magnetici e plasmoniche. Dopo particelle primarie vengono sintetizzati, il nostro metodo è essenzialmente una semplice reazione one-pot. La forza complessiva di risonanza plasmonica e momento magnetico sono determinati da una serie di particelle primarie e, therrima, può essere facilmente ottimizzato a seconda dell'applicazione. Inoltre, abbiamo anche sviluppato una procedura per la coniugazione di anticorpi alle nanoparticelle ibride per varie applicazioni biomediche che richiedono il targeting molecolare specifico. Gli anticorpi sono collegati attraverso la frazione Fc lasciando la porzione Fab che è responsabile per l'associazione disponibili per il targeting antigene.

Protocol

1. Strumentazioni e Cristalleria Preparazione

1. Indossare attrezzature adeguate di protezione, vale a dire, un camice da laboratorio, guanti monouso e protezione per gli occhi.
2. Collegare un pallone a fondo rotondo da un condensatore ed immergerlo in un bagno di olio di silicone con un monitoraggio della temperatura da un termometro. Inserire una fonte di calore (ad esempio, Piastra) sotto il bagno d'olio (Figura 1). Utilizzare un termometro in grado di misurare la temperatura superiore a 260 ° C.

Nanoparticelle 2 Sintesi di Hybrid Primaria magneto-plasmonica

1. Fare magnetica core nanoparticelle
   1. Aggiungere 353,2 mg (1 mmol) di ferro (III) acetilacetonato, 1 ml (2 mmol) di acido oleico, 1 ml (2 mmol) Oleilamina, 1.292 g (5 mmol) 1,2-hexadecanediol, e 10 ml di fenil etere per un giro pallone -bottom.
   2. Lavorare l'impasto energicamente con un stir-bar e di calore magnetico di 250-260 ° C per 1 ora a riflusso. Quindi, attendere che la soluzione si raffreddifino a RT. Assicurarsi che la temperatura è sotto 260 ° C per evitare di ebollizione dell'etere fenile ed impedire uno scoppio della miscela di reazione dal pallone a fondo rotondo al condensatore.
      ATTENZIONE: La miscela di reazione è estremamente caldo e le sostanze chimiche può causare irritazione. Deve operare sotto una cappa aspirante e indossare adeguati dispositivi di protezione individuale. Garantire una ventilazione adeguata per il bagno d'olio.
      NOTA: Il bagno d'olio viene mantenuto a temperatura di 250-260 ° C per 1 ora durante la sintesi delle nanoparticelle magnetiche. In linea di principio, un piatto di vetro Pyrex può essere utilizzato per questo scopo. Tuttavia, la temperatura massima continua di vetro Pyrex è ~ 260 ° C secondo le informazioni del fornitore. Pertanto, un contenitore di metallo fornisce una soluzione più sicura per la reazione in quanto può sopportare una temperatura più alta e durare più a lungo durante multiple.
2. Deposizione di una conchiglia d'oro su nanoparticelle nucleo magnetico
   1. Aggiungere 411,5 mg (1,1 mmol) di oro acetate, 0,25 ml (0,75 mmol) di acido oleico, di 1,5 ml (3,0 mmol) Oleilamina, 775,3 mg (3 mmol) 1,2-hexadecanediol, e 15 ml di fenil etere per un pallone a fondo rotondo.
   2. Aggiungere 5 ml di sospensione di nanoparticelle magnetiche dal punto 2.1. Riscaldare la miscela di reazione a 180 ° C e mantenere sotto riflusso per 1 ora. Attendere che la soluzione si raffreddi a RT.
   3. Aggiungere 50 ml di etanolo per precipitare le nanoparticelle primarie ibridi seguita da centrifugazione a 3.250 × g per 15 min.
   4. Risospendere il precipitato in 25 ml di esano utilizzando un bagno sonicatore. Aggiungere 25 ml di etanolo per precipitare le nanoparticelle ibride primarie. Centrifugare a 3.250 xg per 15 min e risospendere il precipitato in esano. Ripetere questa operazione tre volte.
   5. Asciugare le nanoparticelle ibride primario precipitati in un essiccatore a vuoto O / N. Verificare che le particelle sono completamente asciutti.

Nanocluster 3 Hybrid magneto-plasmonici Sintesi e Dimensione Separazione

1. Aggiungere la soluzione dal punto 3,1-10 ml di soluzione acquosa di sodio dodecil solfato (2,8 mg / ml) in un flaconcino di vetro da 20 ml con tappi attaccati. Aggiungere la sospensione di nanoparticelle ibride primaria goccia a goccia per evitare la miscelazione delle due fasi prima del passaggio successivo.
2. Sonicare la soluzione a due fasi in un bagno sonicatore per 2 ore, seguita da riscaldamento in un bagno d'acqua a 80 ° C per 10 min. Attendere che la soluzione si raffreddi a RT.
   1. Riempire acqua alla linea di livello operativo del bagno sonicazione. Centrare la fiala di vetro nel bagno di sonicazione. Una forma di emulsione immediatamente tra le due fasi. Agitare la soluzione a due fasi a mano dopo l'inizio della sonicazione; questo facilita la miscelazione tra la fase contenente nanoparticelle ibride primarie e la fase acquosa inferiore.
      NOTA: Tenere presente that il sonicatore si riscalda dopo 2 ore di funzionamento.
3. Centrifugare la sospensione nanocluster ibrido a 100 xg per 30 min. Raccogliere sia il precipitato e il surnatante. Risospendere il precipitato in 0.1 mM sodio citrato in 10 min sonicazione. La dimensione attesa dei nanocluster è ~ 180 nm di diametro.
4. Trasferire il surnatante dal punto 3.3 a un nuovo tubo conico.
5. Centrifugare la sospensione dal punto 3.4 a 400 xg per 30 min. Raccogliere sia il precipitato e il surnatante. Risospendere il precipitato in 0.1 mM sodio citrato in 10 min sonicazione. La dimensione attesa dei nanocluster è ~ 130 nm di diametro.
6. Trasferire il surnatante dal punto 3.5 a un nuovo tubo conico.
7. Centrifugare la sospensione dal punto 3.6 a 1.500 xg per 30 min. Raccogliere il precipitato e risospendere in citrato di sodio 0,1 mM in 10 min sonicazione. La dimensione attesa dei nanocluster è ~ 90 nm di diametro.
8. Aggiungere 300 _6; l sospensione nanocluster di un lettore di micropiastre a 96 pozzetti per misurare uno spettro di assorbimento UV-Vis-NIR. Goccia 10 microlitri di sospensione nanocluster sulla rete in rame di carbonio rivestite per l'imaging TEM.

4. Coniugazione di anticorpi monoclonali per nanocluster

1. Preparare 100 microlitri soluzione di anticorpo monoclonale (1 mg / ml) in PBS, pH 7,2, ad esempio, anti-Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2) anticorpi o anticorpi anti-Epidermal Growth Factor Receptor 1 (EGFR).
2. Aggiungere la soluzione di anticorpi da passo 4,1-3,9 ml 4 HEPES mM, pH 7,2. Centrifugare la soluzione attraverso un filtro centrifugo 10 k MWCO a 3.250 xg per 20 min a 8 ° C. Risospendere l'anticorpo a 4 mM HEPES, pH 7,2, per un volume finale di 100 ul.
   NOTA: Questa fase viene effettuata per sostituire il supporto originale nella soluzione di anticorpi con HEPES.
3. Aggiungere 10 ml di 100 mM Naio ₄ a 100 ml di soluzione di anticorpi. Coprire il flaconcino per reazione con un alfoglio uminum a RT e mescolare per 30 minuti con un agitatore orbitale.
4. Placare la reazione aggiungendo 500 ml di PBS 1x.
5. Aggiungere 2 ml di soluzione di linker 46,5 mm (dithiolaromatic PEG6-CONHNH ₂₎ per la soluzione di anticorpi dal punto 4.4 e agitare per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Filtrare la soluzione con un filtro di centrifuga 10 k MWCO a 3.250 xg per 20 min a 8 ° C. Risospendere l'anticorpo in 1x PBS fino ad un volume finale di 100 ml che porta ad una concentrazione di anticorpo di ~ 1 mg / ml.
7. Mescolare 100 ml di sospensione nanocluster a OD ~ 1,0 con 1 ml di anticorpi modificati dal punto 4.6 (1 mg / ml) per 120 minuti a temperatura ambiente.
8. Aggiungere 10 ml di 10 ^-3 M 5 kDa tiolo PEG e agitare per 15 minuti a temperatura ambiente.
9. Centrifugare la soluzione a 830 x g per 3 min. Eliminare il supernatante e risospendere il sedimento in 100 ml 2% w / v 5 kDa PEG in PBS, pH 7,2.
10. Misurare lo spettro di assorbimento dei nanocluster anticorpo-coniugato e confrontare tegli assorbanza spettro dei nanocluster nude. Aspettatevi un paio di nanometri spostamento verso il rosso dopo la coniugazione.
11. Se le nanoparticelle aggregato come mostrato da un cambiamento significativo con un aumento OD nella regione rosso-NIR, aumentare la concentrazione di PEG tiolico per 5 x 10 ^-3 M. Inoltre, aumentare il tempo di incubazione con tioli PEG per 30 min e diminuire la velocità di centrifuga con incrementi di 200 XG.
12. Per il cancro prova etichettatura delle cellule, aggiungere l'anticorpo nanoparticelle coniugate dal punto 4.9 a sospensione di cellule di cancro sia in media o PBS 1X (1 ml ~ 10 ⁶ celle) e mescolare per 60 min.

Representative Results

Uno schema per la sintesi di nanocluster magneto-plasmonica immunotargeted è mostrato nella Figura 2. Innanzitutto, magnetici Fe ₃ O ₄ nanoparticelle di ossido di ferro sono sintetizzati con il metodo di decomposizione termica. Poi, un sottile circa 1 guscio d'oro nm è depositato sulle particelle di nucleo di ossido di ferro tramite decomposizione termica. Le nanoparticelle ibride primaria circa 6 nm servono come semi per creare nanocluster magneto-plasmonica utilizzando un approccio microemulsione olio-in-acqua. I nanocluster sono funzionalizzati con anticorpi monoclonali per il targeting molecolare specifico.

La dimensione di as-sintetizzati nanoparticelle di ossido di ferro nucleo è ~ 5 nm di diametro. Dopo guscio oro deposizione sul nucleo magnetico, la dimensione del nucleo di ferro primario ossido / oro shell nanoparticelle aumenta a ~ 6 nm di diametro. I cambiamenti di colore da marrone per colloidali di ossidi di ferro nanoparticelle al rosso-viola dopo la deposizione del guscio d'oro e,infine, al colore viola-grigio dopo l'assemblaggio delle particelle primarie in ~ 180 nm di diametro nanocluster sferici (Figura 3). UV-Vis spettri mostrano che l'ossido di ferro nucleo primario / nanoparticelle di oro shell hanno un picco di risonanza caratteristico a 530 nm che non è presente in particelle di ossido di ferro nudi (Figura 4). In caso di formazione di cluster, lo spettro cambia notevolmente e presenta una forte ampio assorbanza NIR (Figura 4).

I nanocluster sono coniugati con anticorpi monoclonali per indirizzare specificamente biomolecole di interesse. Il protocollo coniugazione utilizza un eterofunzionale polietilene glicole (PEG), linker che attribuisce regione Fc degli anticorpi alla superficie nanocluster. Un'estremità del linker ha una porzione idrazide che interagisce con ossidata frazione anticorpo glicosilata. L'altra estremità del linker contiene un gruppo di-tiolo che ha una forte affinità per la superficie d'oro dei nanocluster. Per dimostrativee di targeting molecolare abbiamo scelto una linea di EGFR positivo cancro della pelle delle cellule (A-431) e una positiva linea di cellule di cancro al seno HER2 (SK-BR-3). Nanocluster sono stati funzionalizzati sia con anti-EGFR o anti-HER2 anticorpi seguita da miscelazione con cellule A-431 o SK-BR-3 di cancro, rispettivamente. Nella figura 5, un colore brillante oro-arancio su A-431 e SK-BR-3 cellule tumorali indica specifico legame molecolare di nanocluster ai corrispondenti recettori sulle cellule tumorali. Al contrario, non mirati nanocluster PEG non interagiscono con le cellule tumorali. Questi risultati dimostrano la specificità molecolare dei nanocluster funzionalizzati.

Figura 1 Un apparato sperimentale per la sintesi di ossido di ferro nanoparticelle primarie nucleo shell / oro. In un pallone a fondo rotondo è collegato ad un condensatore. La reazione viene effettuata in un bagno d'olio sotto controllo la temperatura con un termometro.

Figura 2 Uno schema che illustra i principali passaggi nella sintesi di nanocluster magneto-plasmonica immunotargeted. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3 immagini TEM e il colore di sospensioni colloidali di nanoparticelle: (Sinistra) nanoparticelle di base di ossido di ferro; (medio) oro rivestite nanoparticelle di ossido di ferro; nanocluster (Destra) ibrido magneto-plasmonica. Barra di scala per le immagini TEM è di 50 nm. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52090/52090fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 (A) UV-Vis-NIR spettri di ferro nanoparticelle di ossido di base (blu), nanoparticelle di ossido di ferro ricoperte d'oro (verde), e ibridi nanocluster magneto-plasmonica (rosso). (B) UV-Vis-NIR spettri di nanocluster magneto-plasmonica ibride con diverse dimensioni: 90 nm (blu), 130 nm (verde) e 180 nm (rosso). Tutti gli spettri sono normalizzati a uno al massimo di assorbanza per mostrare le differenze nei profili spettrali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. ank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 specificità molecolare di anticorpo coniugato nanocluster magneto-plasmonica: (Sinistra) esprimenti l'EGFR-431 A le cellule tumorali della pelle incubate con nanoclusters EGFR; (Middle) che esprimono HER2 cellule del cancro al seno SK-BR-3 incubate con nanoclusters HER2-targeting; (destra) A-431 cellule incubate con mirati nanoclusters PEG. Il colore giallo-arancio delle cellule indica etichettatura successo dai nanocluster funzionalizzati; colore grigio-bluastro corrisponde ad una dispersione endogena dalle cellule. Le immagini sono state acquisite con microscopio in posizione verticale con l'obiettivo 20X campo scuro e Xe lampada di eccitazione. Barra della scala è di 10 micron._blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Movie 1. Questo video mette a confronto la risposta delle cellule tumorali A-431 etichettati da entrambi nanoparticelle primarie o nanocluster di un campo magnetico esterno. Entrambi i tipi di particelle, dove coniugate con anticorpi anti-EGFR per specifici mirati gli EGFR (+) cellule A431. In primo luogo, una provetta Eppendorf è stato riempito con una sospensione di cellule marcate. Poi, un magnete è posizionato accanto al tubo e il movimento delle cellule è stato ripreso a circa 10 mm dal magnete. Il film sulla sinistra mostra cellule marcate con nanoparticelle primarie (6 nm di diametro) e il filmato sulla destra - cellule marcate con nanoclusters magneto-plasmonica (100 nm di diametro). I film sono stati acquisiti utilizzando un microscopio invertito in modalità campo chiaro con un obiettivo 20X. Barra della scala è di 100 micron.

Discussion

Passaggi critici di successo in sintesi di nanocluster magneto-plasmonica includono rendendo altamente monodisperse shell / ferro nanoparticelle di ossido di oro nucleo primario e dirigendo auto-assemblaggio delle particelle primarie in nanocluster. Un rapporto molare tra le particelle primarie e tensioattivi svolgono un ruolo importante nel determinare distribuzione dimensionale dei nanocluster. Non uniforme distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle primarie può causare la formazione di grandi aggregati durante il montaggio di nanocluster magneto-plasmonica. Inoltre, il metodo di microemulsione di formazione nanocluster deduce tensioattivi anfifiliche: gruppi coda idrofoba tengono nanoparticelle primarie insieme e gruppi testa idrofila stabilizzano nanocluster in soluzioni acquose. La concentrazione di tensioattivi determina montaggio nanocluster: alta concentrazione porterebbe alla formazione di nanocluster piccoli o particelle primarie individuali e una bassa concentrazione si tradurrebbe in aggregazione delle particelle.

circa 50 nm a circa 300 nm, che richiede un ulteriore fase di separazione. Centrifugazione con velocità progressivamente crescente come descritto nel protocollo precedente produce buoni risultati con le frazioni separate aventi distribuzioni di dimensione 90 ± 18 nm, 130 ± 26 nm e 180 ± 39 nm. Separazione Finer a produrre distribuzioni più strette dovrebbe essere possibile utilizzando una cromatografia di esclusione dimensionale. Va inoltre notato che i nanocluster dispongono di un ampio assorbanza nella regione rosso-NIR, che offre l'opportunità di eccitare risonanze plasmon con qualsiasi fonte tra circa 500 e 900 nm (Figura 4). Tuttavia, questa struttura limita anche l'applicabilità dei nanocluster imaging simultaneo di obiettivi multipli.

Un raggio idrodinamico di nanocluster aumenta di ~ 10-15 nm dopo anticorpo coniugazione. Questo aumento di diametro correla well con circa 12 nm dimensione di un anticorpo IgG che è collegato attraverso la porzione Fc alla superficie delle nanoparticelle. Pertanto, la variazione del diametro idrodinamico è coerente con la coniugazione chimica direzionale di anticorpi attraverso la porzione Fc implementato nel protocollo. Zeta potenziale delle nanoparticelle sposta da -47,6 mV prima coniugazione di anticorpi a -7.0 mV dopo la coniugazione. La variazione della carica superficiale fornisce ulteriori elementi di coniugazione di anticorpi a nanocluster.

La caratteristica unica del protocollo qui descritto è la sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica di varie dimensioni dai blocchi principali che hanno anche caratteristiche magneto-plasmonici. Questo metodo fornisce un modo semplice per controllare simultaneamente la forza di caratteristiche plasmonici e magnetiche di nanostrutture risultanti. Al contrario, precedenti protocolli utilizzati un insieme di nanomateriale plasmonica e magneticos dove un materiale servita come modello per deposizione dell'altro; in questo approccio un materiale occupa il volume e l'altra superficie delle nanostrutture risultanti. Nanoparticelle magneto-plasmonica riportati in letteratura hanno densità significativamente più basso e l'importo complessivo di particelle superparamagnetiche rispetto ai nanocluster fatte da nostro protocollo ^14,15. Nel nostro metodo frazioni magnetici e plasmoniche sono distribuite in modo uniforme in tutto il volume di nanoparticelle ibride magneto-plasmonica.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PYREX 50 ml round bottom boiling flask with short neck & 24/40 [ST] joint	Corning	4320A-50	Thermal decomposition reaction
PYREX 41 x 300 mm 5-bulb Allihn condenser with 24/40 [ST] outer/inner joints	Corning	2480-300	Thermal decomposition reaction
Silicone oil	Fisher	S159-500	Oil bath
Hot plate stirrer	Corning	PC-351	Heat the reacton with stirring function
Thermometer	ThermoWorks	221-092	Measure temperature
Iron(III) acetylacetonate	Fisher	AC11913-0250	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Oleic acid 99%	Fisher	A195-500	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Gold(III) acetate	Fisher	AA3974206	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Hexane	Fisher	H292-1	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Phenyl ether 99%	Fisher	AC13060-0025	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
1,2-Hexadecanediol 90%	Sigma	213748-50G	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Oleylamine 70%	Sigma	O7805-100G	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Sodium dodecyl sulfate	Fisher	BP166-100	Cluster synthesis
Sodium citrate dihydrate	Sigma	W302600	Cluster synthesis
Monoclonal anti-EGF receptor antibody	Sigma	E2156	Cell labeling specificity test
Monoclonal anti-HER2 antibody	Sigma	AMAB90627	Cell labeling specificity test
Sodium periodate	Sigma	311448	Oxidate Fc region of antibodies
Dithiolaromatic PEG6-CONHNH2	SensoPath Technologies	SPT-0014B	Heterofunctional linker for antibody conjugation to nanoclusters
Methoxy-PEG-thiol, 5 k	Creative PEGworks	PLS-604	Passivate the remaining gold surface after antibody conjugation
Amicon Ultra-4 centrifugal filter unit with Ultracel-10 membrane	Millipore	UFC801008	Protein purification
HEPES	Sigma	H3375	Buffer
PBS, 1x solution	Fisher	BP2438-20	Buffer
UV-Vis spectroscopy	BioTek	Synergy HT	Obtain spectrum
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Separation
Transmission Electron Microscope	FEI	TECNAI G2 F20 X-TWIN	Obtain morphology of nanostructures
Upright microscope	Leica	DM6000	Obtain dark-field images
Sonicator	Branson	1510	Sonication
Carbon film 300 mesh grid	EMS	CF300-Cu	TEM imaging
96-well plate	Corning	09-761-145	UV-Vis reading plate