Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Долгосрочный длительной Визуализация мыши Cochlear эксплантов

Published: November 2, 2014 doi: 10.3791/52101
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Biological Sciences Platform, Sunnybrook Research Institute, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Toronto, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

Summary

Живая томография эмбрионального улитки млекопитающих является сложной задачей, так как процессы развития в стороны действуют на временной градиента над десяти дней. Здесь мы представляем метод для культивирования, а затем визуализации эмбриональных кохлеарной эксплантов тканей, взятых из флуоресцентного репортера мыши в течение пяти дней.

Abstract

Здесь мы представляем метод для долгосрочного покадровой съемки живых эмбриональных мыши кохлеарных эксплантов. Программа развития отвечает за строительство высоко упорядоченную, сложную структуру млекопитающих улитки доходов в течение приблизительно десяти дней. С целью изучения изменений в экспрессии генов за этот период и их реакцию на фармацевтических или генетических манипуляций, долгосрочное изображений необходимо. Ранее в прямом эфире формирования изображения, как правило, были ограничены жизнеспособности эксплантированной ткани в увлажненной камере поверх стандартного микроскопа. Трудности в поддержании оптимальных условий для роста культуры в отношении влажности и температуры разместил пределы от длины экспериментов визуализации. Микроскоп интегрированы в модифицированной культуры ткани инкубатора обеспечивает отличные условия для долгосрочного проживанию изображений. В этом методе мы продемонстрируем, как создать эмбриональные мышиные кохлеарные эксплантов и как использовать инкубатор микроскоп для проведения промежуток времени томографовнг с использованием как яркий поле и флуоресцентной микроскопии для изучения поведения типичного эмбриональных день (E) 13 кохлеарной эксплантата и Sox2, маркера из prosensory клеток улитки, в течение 5 дней.

Introduction

Улитка млекопитающих является весьма приказал сложный орган. В мыши, между появлением примитивного внутреннего уха из слухового пузырька на день E11 и завершения программы развития на ранних этапах постнатального развития, множественные волны клеточной сигнализации и скоординированные изменения в экспрессии генов происходят. Запуск от основания к вершине из канала улитки звук обнаружения сенсорного эпителия, или орган Корти. Развитие органа Корти изысканно управляется таким образом, что к концу развития, он будет состоять из одного ряда внутренних волосковых клеток, три ряда наружных волосковых клеток перемежаются с пятью рядами поддерживающих клеток (два ряда столбов клеток, три Ряды клеток Дейтерса) 1. Отклонение от этой точных результатов порядка в потере слуха, heighlighting важность studye OFTHE генезиса и паттерна сенсорного epithemlium 2.

В пробирке культивирования эмбриональных Кок мышиЛеа является важным инструментом в изучении механизмов развития органа Корти. Эта техника была создана в 1974 году и в течение последних 40 лет, был использован для выяснения многих механизмов, посредством которых сенсорная эпителий указанных и орган Корти, установленных 3. Улитка представляет собой сложный орган с динамическими процессами развития; манипуляция может занять до семи дней, чтобы проявить 1. Например, при добавлении ингибиторов GSK 3β, чтобы кохлеарного культуры эксплантов на E13, оптимальный период инкубации наблюдать надежный эффект соединения составляет шесть дней 4.

Живая визуализация развивающихся улитки позволяет расследование изменений в морфологии органа Корти, изменения в экспрессии генов, отслеживание мигрирующих, пролиферирующие или умирающие клетки, и это позволяет в режиме реального времени наблюдать за результатами фармацевтических средств и нарушение сигнализации Пути. До сих пор не живут изображений улиткив основном были выполнены с помощью конфокальной микроскопии для изображения небольших участков органа Корти на короткие периоды времени 5-8, но эта техника имеет ограничения, связанные с эксплантата жизнеспособности. В визуализации эффектов долгосрочных манипуляций на медленных процессов развития, охраны окружающей среды визуализации имеет решающее значение. Обычно конфокальной системы живой визуализации использует увлажненный пластиковую коробку, которая сидит на микроскоп. Жара и влажность могут уйти через зазоры в инкубации поле, где она встречается со стола микроскоп, через окна доступа, через шарнирных отверстий и через зазоры вокруг различных частей microscope- такие как цель или источника света. Это не является оптимальным для поддержания здоровых эксплантов в течение более двух-трех дней.

Мы определяем «инкубатор микроскоп" в виде перевернутой буквы микроскопом запечатанном внутри стандартного CO 2 инкубаторе, а не инкубатор построен вокруг микроскопа. Инкубатор микроскоп эксимеет тенденцию жизнь эксперимента таким образом, что вместо того, визуализации в течение двух или трех дней, образцы могут быть отображены на срок до двух недель. Инкубатор микроскоп дает прекрасную среду для роста и дифференцировки клеток, с минимальным нарушением чтобы эксплант культур и стандартные контролируемых условиях. В исследованиях, которые проводятся в течение нескольких дней он является общим прибегать к образцам изображений на ежедневной основе, удаляя их из инкубатора и проведение их в перевернутом флуоресцентным микроскопом. Хотя такой подход может работать, как вынуть посуду из инкубатора наносит нагрузку на чувствительной развивающейся ткани. Изменения в кислотности среда для культивирования и колебаний температуры за счет удаления из инкубатора может привести к нерациональному развития и нездоровой ткани. Визуализация и ту же область, в то же фокальной плоскости, и в той же ориентации на каждый момент времени является чрезвычайно сложной задачей. С помощью автоматизированной системы в термостате, можно поддерживать здоровымткани, для сбора изображений в несколько моментов времени, и чтобы гарантировать, что тот же площадь захватывается в каждом кадре. В последние годы были разработаны несколько интегрированных инкубаторов микроскоп ткани, они были полезны не только в клинической практике 9, но и в стволовых клеток и рака исследований 10,11.

Здесь мы приводим протокол для долгосрочного живого изображения эмбриональных мыши кохлеарных эксплантов. Мы используем автоматизированную систему микроскопии внутри стандартного CO 2 инкубаторе, который имеет возможность захвата изображения нескольких образцов в точках заданного времени. Система состоит из инвертированного микроскопа, установленного внутри инкубатора. Образцы помещают во вращающийся возвышении, что дает возможность получить изображение из нескольких выборок в каждой временной точке. Освещение, захват изображения, и вращение помоста контролируются автоматизированной системы, работающей с помощью программного обеспечения Metamorph. Установив подпрограмму обработки изображений с помощью программного обеспечения мы можем установить эксперимент запустить до TWуплотнительные недели с минимальным вмешательством человека. В этом примере мы используем как яркий поле и флуоресценции, чтобы показать рост крупномасштабной и перегруппировку улитки, и, в частности, в prosensory регион. В этом эксперименте, cochleae будет расчленена из репортеров мышей Sox2 EGFP на эмбриональное день E13. Культур в пробирке будет создан, а затем изображается в течение пяти дней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Мышь ткани собирали из Sox2 EGFP -reporter мышей 12 эксплуатируемых и эвтаназии в соответствии с Канадским советом по руководящим принципам по уходу за животными для ухода и использования лабораторных животных.

1. Культивирование эмбриональных Cochleae

  1. Дополнение Игла в модификации Дульбекко (DMEM), смешивая 8,89 мл DMEM, 1 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 мкл 100-кратного N2 добавки, и 10 мкл 10 мг / мл ципрофлоксацин. Дополнение Хэнка сбалансированный солевой раствор (HBSS) путем смешивания 495 мл HBSS с 5 мл 100% HEPES.
  2. Подготовить стеклянные дно чашки для культивирования:
    1. В ламинарном боксе, ресуспендируют 200 мкл базальную мембрану экстракт подложку в 5 мл DMEM. Подготовьте 35 мм Диаметр стекла снизу чашки для культивирования с 10 мм скважин. Внесите 150 мкл субстрата / DMEM в центр каждого стеклянным дном блюдо. Эти блюда могут быть использованы после 40 мин инкубации, или может храниться в CO 2 ПРИМЕЧАНИЕ: Стекло дном блюда используются по следующим причинам: для того, чтобы база блюдо прозрачна и пригодны для работы с изображениями, чтобы создать хорошо в центр чашки, что позволяет экспланты урегулировать в легко расположенного области и, наконец, таким образом, что после эксперимента образец может быть обработан для иммунным окрашиванием и последующего анализа.
  3. Подготовьте рабочую станцию ​​и инструменты:
    1. Включите ламинарного потока чистом столе, и брызги вниз с 70% этанола, чтобы создать чистую рабочее место. Замочите щипцы, ложки, и черный 184 силиконовый эластомер блюдо (смесь 184 силиконового эластомера (10 частей), отвердитель (1 часть) и угольный порошок (2,5 г)) в 70% этанола.
  4. В чистой рабочей станции, урожай эмбрионы для эксперимента. Сбор эмбрионов соответствующей беременности в ледяной HBSS, дополненной 1% HEPES.
    1. Определите внешний или видимый орган, который будет демонстрироватьРепортер деятельность и изучить эмбрионы с помощью флуоресцентного стерео микроскоп. Сбор эмбрионов, которые проявляют активность репортера в ледяной ССРХ с добавлением 1% HEPES как это является предметом эксперимента.
  5. Сбор височных костей:
    1. Работа быстро, используя прохладный источник света и тонкий пинцет, собрать глав щенков. Позаботьтесь, чтобы обрезать на шейных позвонков и ниже челюсти, чтобы избежать повреждения височных костей.
    2. Аккуратно откройте череп. Снимите мозг, обрезать переднюю часть головы, и передавать заднюю череп на свежий ледяной ССРХ с добавлением 1% HEPES в чистом блюде. Тщательно рассекать из арахиса формы височных костей стараясь держаться вестибулярный аппарат в такт.
  6. Проанализируйте улитка:
    1. Передача временных кости в чашку черного силиконового эластомера с покрытием в ледяной HBSS, дополненной 1% HEPES, контактный вестибулярный область кости. Вставьте насекомых булавками накосым углом, чтобы стабилизировать височной кости и создать пространство для щипцов. Закрепление является важным шагом в процессе, как будто височная кость разрешено двигаться слишком много, это очень трудно собрать нетронутыми улитку.
    2. Осторожно снимите хряща вокруг улитки. Вставьте один зубец из щипцов в хрящ на внешнем краю основания улитки и клип отверстие в хрящ.
    3. Клип лоскут вверх по склону, вставьте выступ из щипцов и аккуратно отделить крышу воздуховода из хряща. Клип по горизонтали в верхней и по диагонали, и тщательно снимите переднюю часть капсулы. Вставьте штырь из щипцов между оставшейся хряща и воздуховода и аккуратно обрезать последний раздел. Верхушечный поверхность улитки теперь подвергается.
    4. Начиная с основания, поймать область, где крыша канал встречает кохлеарной эпителия и открыть канал улитки. Аккуратно отделите крышу, обрезкапри необходимости, пока не будет полностью удален. Обрезать любые части мембраны левого на медиальной стороне воздуховода. Очистите канал избыточного мезенхимальных тканей и отсоединить воздуховод от вестибулярной системы.
  7. Культура экспланты:
    1. Разместить эксплантов, просвета поверхности вверх, в центре подложки стекла с покрытием снизу блюдо культуры, тщательно оттянуть всю жидкость и оставьте на две минуты. Добавить 150 мкл дополненные DMEM каплям к эксплантата, стараясь не потревожить его. Если эксплантов свободно плавать, переместить щипцами, но позаботиться о том, что эксплант оседает на дно тарелки таким образом, чтобы его можно прикрепить к подложке.
    2. Разместите со стеклянным дном блюда в глубоком 12 см диаметр чашки Петри, с небольшим блюдом стерильной воды для поддержания влажности. Положите культур в к 35 ° С инкубатор ночь для того, чтобы эксплантат чтобы прикрепляться к субстрату и придавить.

2. Живая ImagING

  1. Выберите эксплантов образцы. С помощью флуоресцентного микроскопа стерео, чтобы оценить состояние каждого эксплантированной улитки. Только выберите эксплантов где воздуховод целости и прилагается к стеклу от основания к вершине.
  2. Установите инкубатор при 35 ° С с 5% CO 2 в культуральной кохлеарной ткани. Положите культур в инкубаторе микроскопом:
    1. Осторожно аспирации от дополненную DMEM и заменить, по крайней мере 500 мкл свежей информации. Для визуализации до 6 дней, 1-1,5 мл лучше. В тех случаях, когда эксплантаты слабо прикрепленных, пипетки кольцо массовой информации по краю блюда. Эта дополнительная жидкость сделает миниатюрный «влажной камере», не нарушая эксплантов в то время как она по-прежнему придает матрице.
      1. С другой стороны, использование шарнирно блюдо охватывает открывать крышки в то время как тарелка остается в его установки в микроскоп, если реагенты должны быть заменены в течение интервалов между коллекций изображений. Откидной крышкой блюдо позволяют веки бытьоткрыл, не нарушая образцы или вынуть посуду из своих настроек. Это поддерживает их точное положение для последующих захватов изображения.
    2. Вставьте стеклянные дно блюда, содержащие соответствующие образцы в держатель образца блюдо. Микроскоп в данном примере имеет вращающуюся платформу, которая содержит восемь 35-мм образца блюда.
    3. Под капотом потока ламинарного заменить пластмассовые крышки со стеклянными крышками и вставьте посуду в держатель образца блюдо. Поместите держатель образца блюдо внутри инкубатора, стараясь не выбить эксплантов из нижней части блюда или нарушить СМИ.
  3. Настройте процедуру изображений:
    1. Включите микроскопа, УФ-лампы и камеры и открыть для обработки изображений.
    2. Найдите образцы, выбрать область изображения, плоскость фокуса и отрегулируйте время экспозиции для каждого блюда в последовательности. Выберите плоскость фокусировки в зависимости не только от точки зрения эксплантата на момент запуска, но альтак памятуя, как ткань будет двигаться и как долго время курс будет проходить.
    3. Установка Z стек с центром вокруг выбранной фокальной плоскости в канале флуоресценции. Установите частоту и длину выборки для эксперимента. Частота выборки будет ограничено временем, которое требуется для сбора изображений, так что это должно быть определено после выбора поля зрения и установив Z стек. В этом случае имеет место каждые 30 мин в течение пяти дней выборки. Продолжительность эксперимента может быть до 14 дней.
  4. Генерация кино:
    1. В конце периода времени градиента открыть файлы изображений. В этом случае Metamorph программное обеспечение, которое открывает последовательные точки сбора используется. Кадр за кадром выбрать лучший фокальной плоскости для демонстрации популяции клеток интереса.
    2. Преобразование этих изображений в файл .avi, или экспортировать их в качестве монтажа, чтобы создать набор изображений, которые могут быть открыты и проанализированы в программное обеспечение для обработки изображений или преобразованы в многократном FORMATS, используя программное обеспечение для обработки видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Здесь мы показываем, фотомонтаж (рисунок 1) и кино (рисунок 2), показывающую, как типичный органотипической кохлеарной эксплантат будет расти, если высевали на E13.5. Sox2 репортер мышь используется для визуализации prosensory регион. Фильм показывает, что улитка претерпевает рост и конвергенцию и расширение, клетки в боковой области зеленого домена Sox2, похоже, не разделить, как ткань, окружающую он расширяется. Это характерно для органа Корти; на E13 предполагаемый сенсорный эпителий выходит из клеточного цикла и впоследствии известный как зоны нераспространения 13. Второй покадровой эксперимент с центром в середине базе другом кохлеарного эксплантов (фиг.3 и 4) показывает, что, как она распространяется, prosensory область сужается. Следует отметить, что после трех дней в культуре ткани имеет уплощенный значительно таким образом, чтобы можно визуализировать Indiviдвойные флуоресцирующие клетки, в то время как в начале есть регионы, где внутреннее отражение света из-за толщины ткани дают возможность идентифицировать области экспрессии, но не отдельные клетки.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Время - градиенты изображения Sox2 репортера кохлеарной ткани, собранной в течение пяти дней этот монтаж показывает прогресс рост эксплантов начиная от нулевого дня и заканчивая на пятый день, пробуя каждые 30 мин, используя цель 10X. Эксплантат была создана на E13 и культивировали в течение ночи до визуализации. Как эксплантат созревает его как растет и проходит конвергентные движения расширения. (A) Последовательные изображения, показывающие степень кохлеарной роста на 12 ч интервалом. Видимый свет канал перекрывается гена флуоресцентного GFPпо рейтингу по репортер EGFP Sox2. (B) GFP флуоресценции канал только. Масштабная линейка соответствует 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

На рисунке 2 :. замедленной анимации Sox2 репортера кохлеарного ткани, собранной в течение 5 дней Это тот же самый эксперимент эксплантов показано на рисунке 1, на этот раз кадры выбраны с интервалами 30 мин в течение 5 дней, и в сочетании, как файл .avi, чтобы генерировать фильм.

Рисунок 3
Рисунок 3:. Средний база переживает движений CE и уплощение Sequentiаль изображения, показывающие, что prosensory эпителий середине базы (EGFP) сужается, расширяется и выравнивается в течение 5 дней. Стрелки указывают регион, что сужает. Кадры, выбранные из 5 дневной последовательности перерыва в 12 интервалах ч, используя цель 10X. Масштабная линейка соответствует 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Покадровый анимация середине базы переживает движений CE и уплощение Анимированные последовательность покадровой показывая сближение и расширение сенсорного эпителия, показанной на рисунке 3 с кадрами выбранных с интервалом 30 мин..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Есть несколько технических моментов, чтобы рассмотреть, когда культуры устанавливаются и в создании покадровой микроскоп для того, для долгосрочного изображений.

Мы используем базальной мембраны матрицу в качестве субстрата для культивирования кохлеарные эксплантов, но подложка должна быть согласована с типом клеток. Например, для изображения нейрональных культур, может быть, лучше, чтобы обеспечить покрытие фибронектина. Температура инкубации и состав газа также должны быть выбраны в соответствии с типом ткани. Выбор возраст эксплантов важно. Начнем с E13 самое раннее, потому что на E12 направление роста менее предсказуема. Как важно, чтобы экспланты культивируют в течение ночи, чтобы прикрепляться к субстрату, эксперименты должны быть планируется начать на следующий день. Если эксперимент начнется в E15 или старше, культуры должны быть установлены на E13, как с течением времени ткани выравнивается и распространяется так клетки легче изображение (рисунок 3). Если кортиев орган должен быть отображены, очень важно, чтобы улитка рассекают очень осторожно. Никс в боковой край эксплантата сломать внутреннее напряжение в ткани, поэтому, когда улитка подвергается морфологические перестройки, клеток разлива 'через слезы, образуя' V 'образный protrusion.This выступ можете перемещать область интереса вне поля зрения , Кроме того, следует соблюдать осторожность, чтобы удалить как можно больше крыше канала на медиальной стороне, как это возможно. Эта ткань продолжает быстро увеличиваться, как эксплантов расширяется и может расти поверх области, представляющей интерес затмевающего его из виду.

При настройке рутину изображений, рост и изменения в морфологии улитки должны быть тщательно продуманы. Цель должна быть выбрана на основе не только на размер области для включения в образ, но и принимая во внимание, будет ли что область перемещения или расширения. Клетки в медиальной областиулитки (рис 1 и 2) разделяй и двигаться в ограниченном пространстве, так с большим увеличением можно использовать (20X, 40X, 60X). Клетки в кортиева органа или боковой эпителия, однако, будет двигаться как эксплантов растет; ниже увеличение (10X или 20X) лучше, как вероятность того, что эти клетки будут оставаться в поле зрения выше. Визуализация стационарных регионах улитки можно при больших увеличениях. Мы решили использовать цель 10X в разделе репрезентативные результаты, потому что мы хотели показать всю эксплантов, и потому движение ткани является динамической на ранних стадиях.

Далее следует рассмотреть плоскость фокуса. Учитывая, что эксплант будет расти наружу и сгладить, вполне вероятно, что в фокальной плоскости будет резко изменяться с течением времени в ходе. Если область интереса является органом Корти или боковой эпителия, предвидя это и ориентируясь на клеток, мигрирующих из эксплантата может помочь. Это альтак аргументом в пользу таких низких целей увеличения. Можно установить Z стеки как для флуоресценции и ДИК. Если клетки интерес, скорее всего, двигаться не в фокусе, создание Z пачку 3-5 мкм на шаг может противодействовать этому, особенно если последний шаг в плоскости покровного стекла. Это может быть трудно выбрать правильный самолет при просмотре культур в один день, как плотность упаковки клеток и отраженный свет от окружающих тканей может предотвратить четкое представление. При рассмотрении кадров для генерации фильм или монтаж позже, тщательный отбор Z-плоскостей также позволяет отслеживать движение клеток в трех измерениях. Эксперимент может быть приостановлена ​​в любой момент, чтобы изменить настройки фокуса, если образец выходит из диапазона.

Живая изображений кохлеарного эксплантата больше недели добавляет новое измерение к пониманию развития улитки, которые будут дополнять конфокальной живого изображения. Это отличный способ, чтобы использовать, когда орган широкий длинный-ной обследование необходимо, но не заменит большом увеличении конфокальной микроскопии для краткосрочных исследований одноклеточных. Выбор метода зависит от типа ткани для включения в образ и контексте эксперимента. Эта техника позволит исследователям изучить пространственно-временные изменения в экспрессии генов репортера, клеточной пролиферации и миграции в режиме реального времени и позволяет изучать реакции гена-репортера в фармацевтических агентов и жизнеспособности клеток более подробно, чем это было возможно ранее.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Спасибо Вилли ВС для оказания технической помощи и доктора Криса Gellynck за полезные замечания и три анонимных рецензентов за их конструктивные советы. Эта работа финансировалась слуха инициативы регенерации Sunnybrook

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle media Gibco 12430 Multiple brands manufacture this
Basement membrane extract  Corning 354230 Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers.
http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29
Fetal bovine serum Gibco 16000044 Multiple brands manufacture this
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
HEPES Gibco 5630080 Multiple brands manufacture this
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
100 x N2 supplement Gibco 17502-048 Multiple brands manufacture this
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850-5G-F Multiple brands manufacture this
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&region=CA
Hank's balanced salt solution Gibco 14170161 Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use.
http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s
Fine Forceps Fine Science tools 11254-20 Size number 5
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29
Curette  Fine Science Tools 10080-05 size 1 mm 
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118
Insect Pins Fine Science Tools 26001-35 Must be stainless Steel
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124
50 mm plastic dishes Corning/Falcon 351006 Multiple brands manufacture this
charcoal Sigma Aldrich 05105-250G Multiple brands manufacture similar items
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&region=CA
184 silicone elastomer Dow/Corning  SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT Dishes are home made several weeks in advance.  Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291
Glass bottom dishes MatTek P35G-0-10-C The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.  35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL.
http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2
Stereomicroscope Zeiss  495101-9804-000  Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items
http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html
Cold Light Source Zeiss 000000-1063-182 Multiple brands manufacture similar items
http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html
Fluorescent Stereomicroscope  Leica microsystems Contact Leica microsystems Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items
http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/
Incubator Microscope +imaging software Olympus Contact Olympus Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software.
http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0
Clean bench Thermo Scientific 51029701 Multiple brands manufacture similar items
http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html
CO2 incubator Thermo Scientific 3310 Multiple brands manufacture similar items
http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html
Laminar Flow hood Thermo Scientific 51026651 Multiple brands manufacture similar items
http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).
  2. Shim, K. The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception. The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).
  3. Van de Water, T., Ruben, R. J. Growth of the inner ear in organ culture. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).
  4. Jacques, B. E., et al. A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea. Development. 139, 4395-4404 (2012).
  5. Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy. Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).
  6. Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti. BMC developmental biology. 13, 6 (2013).
  7. Appler, J. M., et al. Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).
  8. Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry. Development. 138, 1143-1152 (2011).
  9. Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging. Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).
  10. Matsuoka, F., et al. Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells. PloS one. 8, (2013).
  11. Ma, G. F., et al. et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro. PloS one. 8, (2013).
  12. Taranova, O. V., et al. SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence. Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).
  13. Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. , 1581-1590 (1999).

Tags

Биоинженерия выпуск 93 Live-изображений промежуток времени улитка ухо репортер мыши развитие инкубатор микроскоп Sox2
Долгосрочный длительной Визуализация мыши Cochlear эксплантов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mulvaney, J. F., Dabdoub, A.… More

Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants. J. Vis. Exp. (93), e52101, doi:10.3791/52101 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter