Abstract
Lesioni del midollo spinale (SCI) causano gravi danni neurologici e conseguenze psicologiche, economiche e sociali per i pazienti e le loro famiglie. Clinicamente, più del 50% del SCI influisce sulla colonna cervicale 1. Come conseguenza della lesione primaria, una cascata di meccanismi secondari tra cui l'infiammazione, apoptosi, e demielinizzazione si verificano infine porta alla cicatrizzazione dei tessuti e sviluppo di cavità intramidollari 2,3. Entrambi rappresentano barriere fisiche e chimiche per il trapianto di cellule, l'integrazione, e la rigenerazione. Pertanto, plasmare l'ambiente inibitorio e bridging cavità per creare un ambiente favorevole per il trapianto di cellule e la rigenerazione è un promettente target terapeutico 4. Qui, un modello contusione / compressione cervicale SCI utilizzando una clip da aneurisma è descritto. Questo modello è più clinicamente rilevante rispetto ad altri modelli sperimentali, poiché transezione completa o rotture del cavo sono rare. Anche in CONFRONTOn al modello carico di caduta, quali in particolare i danni colonne dorso, la compressione circonferenziale del midollo spinale appare vantaggiosa. Clip forza di chiusura e la durata possono essere regolati per ottenere diverse gravità infortuni. Una molla anello facilita calibrazione precisa e costanza della clip di forza. In condizioni fisiologiche, peptidi autoassemblanti sintetici (SAP) di auto-assemblarsi in nanofibre e, quindi, sono attraenti per l'applicazione in SCI 5. Possono essere iniettato direttamente nella lesione minimizzare danneggiamento del cavo. SAP sono strutture biocompatibili erigere ponteggi per colmare le cavità intramidollari e quindi, dotare il cavo danneggiato per i trattamenti rigenerativi. K2 (QL) 6K2 (QL6) è un romanzo SAP introdotto da Dong et a l. 6 In confronto ad altri peptidi, QL6 auto-assembla in β-sheets a pH neutro 6 0,14 giorni dopo SCI, dopo la fase acuta, SAP vengono iniettati nel centro della lesione e cellule precursori neurali (NPC) sono InjeCTED in colonne dorsali adiacenti. Al fine di sostenere la sopravvivenza delle cellule, il trapianto è combinato con la somministrazione continua subdurale di fattori di crescita da parte di micro pompe osmotiche per 7 giorni.
Introduction
Più del 50% delle lesioni del midollo spinale sono legati alla colonna cervicale. Nella clinica impostazione due principali meccanismi patofisiologici sono descritti: il primo contusione del midollo spinale e successivamente, la compressione continua causata da fratture ossee, emorragie o gonfiore tessuto.
Le clip da aneurisma contusione modello / compressione imita entrambi i meccanismi fisiopatologici: scattare la clip produce una contusione e la durata del ritaglio rappresenta la componente di compressione, ammettendo che la compressione in ambito clinico causate da fratture ossee, emorragie o gonfiore dei tessuti ultima più significativa più a lungo. La clip da aneurisma utilizzato viene modificato da una molla ad anello che garantisce esatte e riproducibili forza clipping. Soprattutto in confronto al emi-resezione o il modello contusione, questa clip aneurisma modello imita migliori ambienti clinici. Mentre i pazienti con lesioni toraciche soffrono di paraplegia, la maggior parte dei pazienti con inj cervicaleuries sono tetraplegico e completamente dipendente. La struttura anatomica del midollo cervicale, tuttavia, mostra differenze significative rispetto alla toracica o lombare della colonna vertebrale, e quindi, è rivolto in particolare in questo protocollo.
Lo sviluppo di cavità intramidollari e cicatrici di tessuto sono ostacoli per il recupero e la rigenerazione. Per superare questi ostacoli l'uso di materiale scaffold è un approccio promettente. Peptidi autoassemblanti possono essere iniettati direttamente nel epicentro della lesione. Ci si riuniscono in scaffolds nano-fibre ponte della cavità e migliorare l'ambiente inibitorio, riducendo l'infiammazione e spaventare i tessuti. Mentre i materiali rigidi provocano danni considerevoli del midollo spinale durante l'impianto, i peptidi fluidi possono essere iniettati in modo sicuro e senza gravi danni aggiuntivi.
Migliorare l'ambiente inibitorio con peptidi autoassemblanti prima del trapianto di cellule staminali, quindi, sostenere cella integrazione, differenziazione e, infine, il recupero funzionale, dopo una lesione del midollo spinale cervicale.
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Protocol
NOTA: La seguente protocollo sperimentale è stato approvato dal comitato cura degli animali della University Health Network (Toronto, Canada), ed è in conformità con le politiche stabilite nella guida per la cura e l'uso di animali da esperimento preparata dal Consiglio canadese della cura degli animali .
1. cervicale Contusione Aneurysm Clip / compressione Modello
- Prima di strumenti autoclave chirurgia e mantenere condizioni di sterilità durante tutta la procedura surgcial mettendo gli strumenti in un bagno di alcool al 70%.
- Anestetizzare ratti Wistar (250-270 g) con una combinazione di ossigeno (O 2), protossido di azoto (N 2 O) (1: 1), e 1,8-2,2% isoflurano e sostenere la respirazione spontanea mediante una maschera di anestesia gas. Per l'induzione dell'anestesia iniziare con 5% isoflurano per 1 minuto e ridurre in seguito. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, il controllo di profondità dell'anestesia, dando uno stimolo doloroso (ad es. Le zampe). Applicare pomate grassenegli occhi per evitare secchezza e per prevenire le infezioni successive.
- Mettere i ratti su un cuscino di riscaldamento (37 ° C) e fissare la testa in un telaio stereotassico.
- Radere la regione chirurgica attorno alla colonna vertebrale cervicale e disinfettare con povidone iodio e il 70% di alcol.
- Eseguire un'incisione mediana sopra la spina dorsale della vertebra cervicale (C2), raggiungendo al processus spicco della toracico vertebrale corpo 2 (T2).
- Tagliare lo strato esterno dei muscoli vertebrali direttamente sulla linea mediana (per evitare sanguinamenti) in direzione cranio-caudale e ulteriormente sezionare gli strati muscolari più profondi senza mezzi termini, fino a raggiungere il spinosus processus e le lamine. Inserisci divaricatori.
- Orientare il processus spinosus spicco del corpo vertebra T2 ad osservare i livelli previsti per laminectomia. Dopo l'identificazione e la micro-chirurgica la preparazione delle lamine selezionato, tagliare il flavae ligamenti per allentare le lamine e la spinosus processus. Infine, cut attraverso le lamine laterali con un Clipper ossea al midollo spinale e rimuovere quelli delicatamente, evitando la compressione del midollo spinale stesso.
NOTA: I più comuni sono i livelli C5 / 6, C6 / 7, o C7 / T1. Il tasso di mortalità perioperatoria aumenta il più rostrale il livello di pregiudizio. Sanguinamento dal seno venoso paravertebrale è comune e può essere affrontato da compressione attento con la spugna. - Prima di inserire il clip per traumatizzare il cavo, identificare emergenti radici nervose per risparmiare loro di clipping (soprattutto a livello C5 / 6).
- Per garantire la clip un'induzione, allentare la dura ventrale dal lato dorsale dei corpi vertebrali con un gancio e preparare un corridoio per la clip.
- Infine, inserire la clip aperta e farlo scattare chiuso (chiusura rapida) per ottenere un infortunio contusione. Clip forza di chiusura e la durata della chiusura a clip determinano l'intensità del trauma e l'entità della compressione. Comunemente utilizzati sono forze di clip di tra 15-35 g ed un clipping durata es 1 min. (Figura 1).
- Dopo la rimozione della clip, adattare muscoli in 2 strati e chiudere la ferita.
- Smettere di anestesia e lasciare che il risveglio degli animali sotto la vostra osservazione continua fino a quando non riprende conoscenza sufficiente decubito sternale. Infine, mettere il topo in una singola gabbia e seguire le linee guida di trattamento post-operatorio.
- Poiché gli animali lottano con la gravità di questo tipo di lesioni, è necessario prestare particolare attenzione ai trattamenti post-operatori:
- Somministrare antidolorifici (buprenorfina e Meloxicam per 3 giorni e 5 giorni, rispettivamente e in base ai sintomi clinici).
- Dare ulteriore sottocutanea soluzione salina per 3 giorni (2 volte al giorno, 5-10 millilitri (ml)).
- Fornire antibiotici nell'acqua potabile 2 giorni prima e entro 7 giorni dopo l'intervento chirurgico (es moxifloxacina)
- Premere la vescica urinaria 2-3 volte al giorno fino al recupero della funzione della vescica è costantely apparente.
- Osservare deficit neurologici e condizioni fisiologiche degli animali operati, almeno una volta al giorno.
2. Iniezione SAP e NPC (14 giorni dopo la lesione)
- Indurre l'anestesia come descritto in 1.1. a 1,3, fissare la testa del topo in un telaio stereotassico, togliere i punti o clip ferita, e disinfettare la ferita e la zona chirurgica con povidone iodio e 70% di alcol.
- Sezionare con cura i muscoli paravertebrali, inserire divaricatori, rimuovere il tessuto cicatriziale microscopicamente dalla dura, e ri-esporre il sito della lesione.
- Preparare PAS in una concentrazione di 1% (w / v) effettuare un gel matrice extracellulare. SAP QL6 hanno un pH fisiologicamente compatibili e non devono essere tamponato prima dell'iniezione. Per la visualizzazione dei SAP nel midollo spinale, usare un derivato fluorescente QL6 (QL6-FITC).
- Iniettare SAP (5 microlitri (microlitri) al centro della lesione, distribuito in 2 porzioni, ciascuna2.5 bilaterali microlitri della linea mediana. Utilizzare una siringa Hamilton collegata al telaio stereotassico con un bicchiere micro capillare (100 micrometri (micron) di diametro esterno (OD)). Aprire la dura accuratamente con la punta di un ago appuntito, e inserire il capillare di vetro stereotactically 2 millimetri (mm) nel midollo spinale traumatizzato.
- Dopo l'iniezione 1/3 del volume, rimuovere l'ago alla profondità 1,5 mm e dopo altri 1/3 a 1 mm. Dopo l'iniezione dell'intero volume, e prima della rimozione della siringa, attendere 5 minuti per stabilizzare la formazione di gel.
- Per generare NPC, utilizzare topi adulti DsRed (o YFP topi positivi, verdi) e isolare e coltivare dalla zona paraventrical 4,18,21.
- Valutare la vitalità di NPC di Trypan Blue colorazione che indicano la presenza di cellule vive ~ 90% nella sospensione cellulare. Diluire le cellule nel terreno di crescita (50 x 103 cellule vive / ml) e poi li usano per il trapianto di cellule.
- Fare quattro 2 ml (8 microlitri vo totalelume, contenente 4 x 10 5 NPC) iniezioni intraspinali bilaterale a 2 mm rostrale e caudale del luogo di ferita. Dopo l'apertura della dura, inserire il vetro micro capillare Hamilton 1,5 millimetri sotto la superficie dorsale del midollo spinale e iniettare 2 ml di sospensione cellulare. Scegliere una velocità di iniezione a circa 0,5 ml / min (min).
- Alla fine di ogni iniezione e prima della rimozione del capillare fuori del cavo, attendere almeno 1 min permettendo tessuto estende per accogliere il nuovo volume cellulare. (Figura 2)
3. L'impianto di subdurale pompe per la crescita Application Factor
- Al fine di arricchire il liquido cerebro-spinale (CSF) con fattori di crescita sostenendo la sopravvivenza cellulare, utilizzare pompe micro-osmotica diluitivi fattori di crescita sub-durally tutto 7-14 giorni, con un tasso di diluizione di 0,5 microlitri / hr, un diametro del catetere di 0,04 OD cm, e un volume serbatoio di 100 microlitri.
- Scegli fattori di crescita preferiti(Ad esempio, il cervello derivato fattore di crescita (BDGF), fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita dei fibroblasti (FGF)), riempire le pompe 6-10 ore prima dell'impianto, e equilibrare le pompe in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Subito dopo iniezioni NPC, preparare un incavo sottocutaneo per posizionare la pompa. Località preferiti sono i fianchi laterali della regione addominale thoraco- evitando grande fastidio locale causati dalla pompa stessa.
- Per ottenere la più alta concentrazione di fattori di crescita, assicurarsi che la punta aperta del catetere finisce vicino al luogo della lesione. Pertanto, eseguire un salto-laminectomia del livello superiore o inferiore adiacente. Ad esempio, se il SCI è a C7 / T1, eseguire una piccola laminectomia C5.
- Mettere la pompa nella cavità sottocutaneo, abbreviare il catetere alla lunghezza necessaria, e fissarlo con diversi punti di sutura (6.0) sui muscoli paravertebrali evitando qualsiasi movimento lussazione associata.
- Dopo l'apertura della dura (per esempio, in C5) con la punta affilatadi un ago, introdurre il catetere nello spazio subdurale e farlo scivolare in una direzione caudale senza alcuna resistenza e senza danneggiare il cavo. La lamina saltato di esempio C6 serve come punto supplementare di fissazione e la stabilizzazione del catetere.
- Assicurarsi che il catetere senza intoppi e non si piega.
- Chiudi muscoli di strato, e la pelle, con suture o clip. (Figura 3)
- Smettere di anestesia e lasciare che il risveglio degli animali sotto la vostra osservazione continua fino a quando non riprende conoscenza sufficiente decubito sternale. Infine, riporli in una singola gabbia e seguire le linee guida di trattamento post-operatorio.
- Fornire un trattamento speciale post-operatorio, anche se, gli animali potrebbero aver recuperato in parte in questo momento-point:
- Somministrare antidolorifici (Buprenorthine e Meloxicam per 3 giorni e 5 giorni, rispettivamente e in base ai sintomi clinici).
- Fornire antibiotici in bottiglie d'acqua fino a 2 giorni prima7 giorni dopo l'intervento chirurgico (es moxifloxacina).
- Continuare comprimendo la vescica urinaria, se ancora necessario.
- Dare fluidi sottocutanei aggiuntive, se i topi appaiono disidratati.
- Mantenere osservando la funzione neurologica e condizioni fisiologiche degli animali operati almeno una volta al giorno.
- Somministrare trattamento immunosoppressione 2 giorni prima dell'iniezione NPC e entro 7 giorni dopo transplanation (minociclina) e fino al sacrificio (Sandimmune), rispettivamente.
4. Tissue Assessment
- Sacrifica animali alla fine del periodo di osservazione (ad es. 4 settimane dopo SCI) in anestesia profonda (5% isoflurano per 2-3 min) e li transcardially profumato con 50 ml freddo (4 ° C) seguito da soluzione fisiologica 150 ml freddo 4 % paraformaldeide in 0,1 M tampone fosfato salino (PBS).
- Rimuovere il midollo spinale e metterlo in 4% paraformaldeide in 0,1 M tampone fosfato salino (PBS) per 24 ore.
- Fornire criosezioni longitudinali con spessore <30 micron.
- Per la colorazione immunoistochimica di tutti i cellulari-nuclei fornire un uso di sfondo DAPI (1: 1.000). DsRed NPC positivi appaiono di colore rosso, QL-6 FITC appare verde, e sia quindi non ha bisogno di essere tinto appositamente. (Figura 4).
- Per la microscopia elettronica a scansione (SEM) lasciano i campioni in ammollo in glutaraldeide a 4 ° C per 2 ore, disidratano lentamente in 10 passi% di incremento di etanolo per 5 minuti e metterli in un liquido in pressione di CO 2 sifone per 1 ora. Ponteggi cappotto con oro utilizzando una verniciatura polverizzazione. Prendete le immagini con un microscopio elettronico a scansione Hitachi S-3400N. (Figura 5)
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Representative Results
Quando si esegue il procedimento sopra descritto, si otterrà un ponteggio SAP colmare la cavità e offrendo un miglioramento dell'ambiente inibitorio, meno spaventare tessuti e l'aumento di sopravvivenza NPC. Figura 4 mostra una sezione longitudinale di un ratto midollo spinale ottenuto al luogo di ferita sei settimane dopo SCI e 4 settimane dopo QL6 SAP iniezione e NPC trapianto. Peptidi QL6 sono state iniettate con successo nel cavo, aggregato nell'epicentro e diffusi rostro-caudale nella penombra. Microscopio elettronico di imaging mostra inoltre, in figura 5, il gruppo di 1% (w / v) QL6 peptidi ad un ponteggio nanofibre in 2 ore diluito in soluzione PBS.
Questa matrice fornisce un miglioramento dell'ambiente inibitorio contribuire ad un aumento della sopravvivenza delle cellule e differenziazione cellulare, meno cicatrici tessuto ed infine conduce ad una migliore possibilità di recupero funzionale.
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Figura 1: Clip modello aneurisma contusione / compressione (A) Fotografia al microscopio chirurgico dopo laminectomia C7 / T1 e la clip contusione / compressione del midollo spinale di un topo (B) Immagine della clip con la molla ad anello che garantisce precisione.. forza di chiusura.
Figura 2: illustrazione grafica dei punti di iniezione punti iniezione di SAP e di cellule staminali.: 2 iniezioni di SAP stereotactically svolte nel epicentro della lesione, seguiti da 4 iniezioni di NPC nelle colonne dorsali adiacenti con una distanza di 2 mm caudale e rostrale dall'epicentro.
Figura 4: fornitura di successo di SAP e NPC nel midollo spinale cervicale colorazione fluorescente (DAPI sfondo, blu) di una sezione longitudinale di un midollo spinale traumatizzato di un ratto.. SAP etichettati (QL6-FITC, verde) si sono aggregati in all'epicentro della lesione. NPC iniettati (DsRed positivo, rosso) hanno diffuso inindicazioni rostrale e caudale. Bar Scala si riferisce a 5 mm.
Figura 5:. Nanofibre scaffold formazione microscopio elettronico a scansione (SEM) immagine che mostra nanofibre impalcatura formazione di SAP assemblati. Bar Scala si riferisce a 1 micron).
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Discussion
Questo protocollo è stato sviluppato per consentire al lettore di eseguire un modello di lesione cervicale nei ratti e di utilizzare un approccio di trattamento combinato con SAP e NPC favore di un migliore recupero dopo cervicale SCI.
Soprattutto in confronto ad altri modelli traumi cervicali, come il (emi) -transection modello o modelli di peso goccia e concussione, il modello / compressione clip di contusione rappresenta sia principali meccanismi fisiopatologici traumi - contusione e per compressione e quindi imita migliori condizioni cliniche. Mentre è ben stabilita per l'utilizzo nel ratto e topo toracica colonna vertebrale 7-11, è stato recentemente adattato per l'uso della colonna vertebrale cervicale. Questo è stato un passo importante in quanto le lesioni del midollo spinale cervicale sono più frequentemente osservati in clinica e anatomia cervicale varia in modo significativo dalla colonna vertebrale toracica. Inoltre, i pazienti affetti da SCI cervicale tetraparesi sono pronti a riconquistare il motore almeno parziale funzione dei loro arti superiori.
Sfidare gli aspetti di una sperimentazione cervicale SCI, tuttavia, sono un alto tasso di mortalità che aumenta in direzione rostrale da C7 a C5 e può raggiungere fino al 20-30% della colonna vertebrale cervicale media e alta. Inoltre, radici nervose emergenti (specialmente a C5 / 6) sono sensibili alla manipolazione, e nel caso non si conservano, danni e irritazione potrebbe causare masticazione delle zampe frontali conseguente necessità di un sacrificio anticipata degli animali. In generale, gli animali con lesioni del midollo spinale cervicale bisogno di molta attenzione e di assistenza post-operatoria e mostrano un corso più lungo di recupero. D'altra parte, oltre a un'accurata preparazione chirurgica, questi problemi possono essere risolti in parte adattando la gravità della lesione selezionando una forza adeguata chiusura graffa (ad esempio 15 a 35 g) e un tempo di ritaglio adeguata (ad esempio 1 min). La modifica di questi parametri portano a diversi livelli di gravità delle lesioni (lievi, Moderate, o grave SCI). Inoltre, ci potrebbe essere un rischio di dipendenza o chirurgo una distribuzione ineguale del danno. Per affrontare questi problemi l'utilizzo di un applicatore clip è un'opzione dove la clip sempre viene rilasciato e pertanto chiuso con la stessa velocità e quindi la velocità. Prima di scattare la clip è obbligatorio per garantire che la clip ha sua posizione corretta e racchiude l'intero midollo spinale altrettanto. Sfida speciale chirurgica consiste nella ri-esposizione del sito di lesione rimozione del tessuto cicatriziale dalla dura. Si raccomanda che questa procedura viene eseguita micro-chirurgicamente, utilizzando la preparazione tagliente, ed evitando qualsiasi pressione o trazione del cavo fisso.
Peptidi autoassemblanti sono stati identificati con potenzialità per colmare la cavità e, inoltre, a migliorare l'ambiente inibitorio nel sito della lesione, infine, portando anche alla rigenerazione assonale e spuntano 5, 12,13,14. QL-6 nanofibre riuniscono per ponteggi bridgingla cavità intramidollare e, quindi, in grado di fornire una matrice per germinazione assonale e rigenerazione e migliorare l'ambiente inibitorio prima del trapianto di cellule. I vantaggi di questi peptidi giacevano nella loro bassa viscosità (liquido) e il pH neutro. Soprattutto in confronto a idrogel o ponteggi tessuto ad alta viscosità, SAP possono facilmente iniettato nel midollo spinale danneggiato e lesioni supplementari derivanti dalla iniezione si sono limitate.
Sebbene QL6 nanofibre si potrebbe migliorare la sopravvivenza delle cellule 4,15, tuttavia, l'uso di fattori di crescita sembra essere 16,17,18,19,20,21 vantaggioso. Possono essere somministrati mediante idrogel rilasciano fattori di crescita 22, o mediante applicazione tramite pompe osmotiche (come descritto sopra). Pompe osmotiche connessi ai cateteri subdurali offrono il vantaggio di un rilascio continuo e controllato e, quindi, l'arricchimento del liquido spinale cervicale (CSF). Posizionamento del catetere subdurale, tuttavia, è challenging soprattutto per quanto riguarda vasto cicatrici che potrebbe essersi verificato dopo alcune settimane dopo infortunio.
Al fine di garantire buone condizioni di tessuti per la sopravvivenza NPC e l'integrazione, diversi studi hanno scelto i punti di iniezione nella sostanza bianca adiacente, due millimetri rostrale o caudale al sito della lesione e non direttamente l'epicentro della lesione 4,15,18. C'è, NPC hanno una migliore possibilità di sopravvivenza, l'integrazione e la differenziazione in astrociti, oligodendrociti o neuroni, e possono migrare verso o nella lesione conseguente germinazione assonale e migliore connettività assonale.
Dopo aver imparato le tecniche di questa forza protocollo proposto da adottare da parte dei singoli utenti in base le loro necessità e gli interessi che comprende modifiche del livello e la gravità della lesione, l'uso di diversi tipi di cellule o fattori di crescita, o l'aggiunta di altre sostanze neuro-protettivo .
Insintesi, il trattamento combinato con SAP e NPC potrebbe offrire un nuovo approccio e promettente superare gli ostacoli più impegnativi nel trattamento di SCI: cavità e cicatrici di tessuto.
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Acknowledgments
Vorremmo riconoscere il sostegno finanziario per questo lavoro dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Family Foundation Krembil, il Halbert cattedra di riparazione Neural and Regeneration, Phillip e Peggy DeZwirek, e Gordon Yao per il contributo alla Figura 2 . Klaus Zweckberger è stato finanziato da una sovvenzione della "Deutsche Forschungsgesellschaft" (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aneurysmal clip | SharpTech | ||
| Surgical microscope | Leica | ||
| Micro injection system | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | ||
| Hamilton syringe | Hamilton company | ||
| Subdural pumps |  Alzet osmotic micro pump 1007D |
||
| Surgical instrument | Fine Science tools | ||
| Isoflurane USP | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | ||
| 0.9% Sodium Chloride injection USP | Baxter | ||
| 7.5% Povidone iodine | Purdue Pharma | ||
| 70% Isopropyl alcohol USP | GreenField Ethanol Inc. | ||
| QL6 SAP | Covidien | ||
| 0.4% Trypan blue | Gibco | ||
| Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) | Sigma | ||
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | ||
| Fibroblast Growth Factor (FGF) | Sigma |
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