Protocol
وتمت الموافقة على البروتوكولات استخدام الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام العلوم الصحية في جامعة ألبرتا.
1. إعداد الآلات، الحيوانات والإعداد المنطوق
- نقل الحيوانات إلى جديد، نظيف غائبة قفص من جميع المواد الغذائية الصلبة 24 ساعة قبل الإجراء. قد تكون لديهم حرية الوصول إلى المياه، والنظام الغذائي السائل ليب الإعلانية حتى وقت الإجراء.
- الأوتوكلاف جميع الأدوات اللازمة لإجراء العملية. تنظيف سطح التشغيل ومخروط الأنف مخدر مع الايثانول 70٪.
- إعداد سطح التشغيل مع مجهر التشغيل، آلة التخدير واللوازم بطريقة غير مريحة للجراح التشغيل. وينبغي أن يسمح المرفقين الجراح للراحة مريح على طاولة العمليات، مع اليدين والذراعين دون عائق من قبل الأجهزة. يجب وضع الصكوك، والخيوط الجراحية، ومسحات القطن، وحقنة 10 مل في موقع يسمح بسهولة أثناء العملية.
- نصبمصابيح الحرارة العلوية لتوفير الدفء سواء للحيوان أثناء الإجراء والضوء لسطح التشغيل.
- ملء أنبوب مخروطي 50 مل مع 0.9٪ محلول ملحي، وأنبوب 1.5 مل مع الفازلين ومكان بالقرب من سطح التشغيل.
ملاحظة: تعقيم جميع الأدوات الجراحية. لأنه مقطوع الأمعاء، الإجراء في حد ذاته ليس العقيمة. يعتبر نظيفة الملوثة. اتخاذ التدابير اللازمة لتجنب إدخال مصادر خارجية للعدوى.
2. استئصال اللفائفي القولوني مع التحام
- تحريض التخدير عن طريق إعطاء 4٪ الأيزوفلورين مع معدل تدفق الأوكسجين من 2 لتر / دقيقة عن طريق مخروط الأنف من المرذاذ الأيزوفلورين حتى يبطئ الحيوانات معدل التنفس إلى ما يقرب من 30-40 الأنفاس / دقيقة. ممارسة الضغط المعتدل في القدم الخلفية من الماوس لضمان عدم وجود استجابة الألم قبل البدء في الإجراء. عند هذه النقطة، رفض الأيزوفلورين إلى 2٪، وتدفق الأكسجين إلى 0.5 لتر / دقيقة. بشكل متقطعتحقق استجابة الألم أثناء العملية وضبط معدل تدفق الأيزوفلورين وفقا لذلك.
- تطبيق الفازلين على العينين لمنع جفاف أثناء الجراحة، ولشل حركة الماوس في موقف ضعيف مع أطرافه المضمون باستخدام الشريط الشفاف.
- تنظيف البطن بمحلول povodine / اليود، وتغيير في قفازات معقمة جديدة.
- جعل شق الجلد 1.5 سم في خط الوسط العلوي من البطن باستخدام مقص تشريح نقطة حادة لفضح اللفافة والغشاء البريتوني. فتح طبقة فافي / البريتوني بطريقة مماثلة خلال ألبا الخط لكشف محتويات البريتوني.
- وعلى النقيض من البشر، وعادة ما وجد الأعور الماوس في الربع العلوي الأيسر من البطن. وبمجرد تحديدها، فهم بلطف الأعور مع ملقط وتسليمها من خلال شق. استخدام قطعة قطن مبللة لمروحة من حوالي 3 سم من محطة الدقاق تمتد من الأعور على شاش معقم رايات على السطح البطني (الشكل 1A).ضمان أن يظل الأمعاء تتعرض رطبة مع 0.9٪ المالحة خلال مجمل العملية.
- تحديد الشريان اللفائفية المتفرعة من الشريان المساريقي العلوي على طول القولون (الشكل 1A) باستخدام مجهر التشغيل. تشريح الأنسجة من اوعائي المجاورة للشريان اللفائفية، وتطويق الشريان ligate بالتعادل 5-0 الحرير. المقبل، وتحديد وصول الدم الإقليمي لمحطة الدقاق واختيار نقطة transection 1.5-2 سم الأقرب إلى تقاطع اللفائفية. Ligate فروع هذا القسم من الدقاق على النحو الوارد أعلاه. تقسم الشرايين الصغيرة مع مقص تشريح.
- تقسيم الأجزاء الدماغية من اللفائفي والقولون ضمان عدم وصول الدم الكافي للانتهاء مقطوع (الشكل 1B). غالبا ما يكون من المفيد أن يستلوق؛ يمزج بالملوق الدقاق بتقسيمه بزاوية 30 درجة لزيادة قطر التجويف بحيث يتوافق بشكل وثيق القولون. مرة واحدة تمت إزالة جزء من الأمعاء اللفائفية، محاذاةيتم محاذاة نهايات مقطوع من اللفائفي والقولون على الشاش، وضمان حدود كل المساريقي.
- بناء مفاغرة عن طريق تقريب نهاية مقطوع من الدقاق إلى نهاية مقطوع من القولون باستخدام توقف 8-0 خيوط البولي بروبلين (الشكل 1C). يتم وضع غرزة الأول على الحدود المساريقي، مع الغرز اللاحقة وضعت كل 0.5 مم حتى مفاغرة اللفائفي القولوني هو ماء. عند تمرير إبرة خياطة من خلال الدقاق والقولون، تأكد من أن قطع الحافة لا تدحرجت، ولدغ إبرة هم 0.5 ملم من قطع حواف الأمعاء. وهناك مفاغرة نموذجية يتطلب 14 إلى 16 الغرز توقف. اختبار سلامة والمباح من مفاغرة عند الانتهاء من قبل المتداول الداني إلى القاصي مسحة القطن على الدقاق لإجبار محتويات من خلال مفاغرة. يجب أن محتويات الأمعاء الصغيرة تمر بحرية في القولون دون تسرب توصيلي.
- شطف الأمعاء يتعرض مع 3-4 مل من المياه المالحة 0.9٪ من حقنة 10 ملليغسل البراز من سطح الأمعاء، وتقديم الأمعاء مرة أخرى في التجويف البريتوني. باستخدام 2 مل من 0.9٪ المالحة مسح التجويف البريتوني، ومن ثم استنزاف هذا السائل من خلال تطبيق ضغط لطيف على جدار البطن أفقيا.
- إغلاق شق مع 3-0 خياطة الحرير التوالي، ووقف تدفق الأيزوفلورين. إدارة 0.1 ملغ / كغ من الأفيون طويل المفعول -buprenorphine- تحت الجلد للسيطرة على الألم بعد العمليات الجراحية.
- مراقبة الحيوانات تحت مصباح الحرارة حتى أنهم المحمول ثم نقلها إلى قفص تحسنت باستمرار.
العناية والمراقبة 3. مرحلة ما بعد المنطوق
- مراقبة الحيوانات في قفص تحسنت باستمرار بحثا عن علامات الضيق للفترة المتبقية من اليوم. نقل الحيوانات إلى مرفق رعاية الحيوان في قفص معقم جديد مع الوصول إلى النظام الغذائي السائل وعفوي المياه. ويمكن إيواء الحيوانات في مجموعات من 3-4.
- إجراء فحص على الحيوانات بعد العملية في صباح اليوم التالي،ضمان لا تظهر حيوانات في محنة. تغذية حمية سائلة الوحيد. إذا كانت تبدو غير مريحة (أي الموقف منحنية أو الحد الأدنى من النشاط) إدارة جرعة إضافية من البوبرينورفين تحت الجلد. اطمئنان على الحيوانات مرة أخرى في فترة ما بعد الظهر في يوم 1 بعد العمليات الجراحية.
- في صباح يوم 2 بعد العملية يجب أن تظهر الحيوانات تعافى تماما. الأدلة على استهلاك الأغذية وstooling دلائل إيجابية على الانتعاش. الآن، واستئناف اتباع نظام غذائي طعام صلبة للحيوانات.
ملاحظة: تشمل علامات الضائقة الموقف منحنية، قلة النظافة، والحد الأدنى من النشاط. إذا علامات الضائقة بارزة يجب أن يتم التخلص من الحيوانات. - الموت ببطء الحيوانات عن طريق إحداث التخدير العميق مع 4٪ الأيزوفلورين بمعدل تدفق O 2 من 2 لتر / دقيقة حتى الحيوانات لا تستجيب لضغط القدم. أداء خلع عنق الرحم، ومراعاة لعلامات euthanization السليم.
- المبادئ التوجيهية تختلف، لذلك الرجوع إلى توصيات المؤسسات بشأن مؤشراتلوالأساليب المناسبة لeuthanization في الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
معدلات الوفيات وتغير الوزن بعد العملية.
معدلات وفيات التالية النواب في 129S1 الفئران النوع البري عموما ~ 5٪. السبب الأكثر شيوعا للأخلاق هو انسداد الأمعاء في مفاغرة. وتشمل الأسباب الأخرى للوفيات تسرب تفاغري وفتق داخلي مما يؤدي إلى انسداد الأمعاء.
ويمكن رؤية فقدان الوزن تصل إلى 14 أيام بعد العملية، ولكن عموما غير مهم. الفئران تميل إلى استعادة كامل الوزن قبل العملية من قبل بعد الجراحة يوم 28 (الشكل 2).
إمكانية نقل التقنية
كان يدرس للطالب خريج جديد (BM) لتنفيذ الإجراء النواب لتحديد ما إذا كان المشغل مع أي تدريب الجراحي السابق يمكن أن تتعلم هذه التقنية. وبدأ التدريب مع تعلم كيفية تنفيذ الغرز انقطاع واحدة مماثلة لتلك المستخدمة في مفاغرة باستخدام النايلون 8-0 خياطة. تم إجراء الغرز لإغلاق شق جعلت عبر بالشبكة اللاتكسهاء. بعد BM كان قادرا على وضع الخيوط الجراحية بكفاءة من خلال القفازات دون تمزق، أنهم لاحظوا ثلاثة إجراءات كاملة قبل محاولة واحدة. بعد الانتهاء من الإجراء الأول، ثم أنها لاحظت إجراء آخر وحاول اثنين آخرين. الحيوانات أتم ثلاثة، ذهب الماضيين على البقاء على قيد الحياة وتزدهر. كان الموت الرحيم للحيوان الأول بسبب مضاعفات في مفاغرة.
الشكل 1. مراحل استئصال اللفائفي القولوني ومفاغرة. (A) المنطقة اللفائفية من الأمعاء سلمت من البطن. السهام السوداء تشير إلى أن السفن و ligated، وتشير الخطوط المتقطعة نقاط transection لالقولون ومحطة الدقاق. (ب) المنطقة اللفائفية إزالتها، ويتم محاذاة الغايات قطع من الأمعاء، ويتجلى المتبقية امدادات الدم عن طريق السهام السوداء. (C) الانتهاء أنس اللفائفية القولونيةtomosis. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. أوزان الحيوانات في الأساس، يوم بعد العمليات الجراحية 14 وبعد العمليات الجراحية يوم 28. لم يلاحظ أي تغييرات كبيرة في أوزان ما بعد الإجراء على النحو الذي يحدده الاختبار الإحصائي مان ويتني U. مجلس النواب (اللفائفي القولوني مجموعة بتر)، التحكم (الضوابط غير المنطوق).
الشكل 3. مسار الممثل من الغرز من خلال أنسجة الأمعاء. H & E الملون أقسام نسيجية من الدقاق (يمين) والقولون (يسار) واصطف لإظهار مسار شمال شرق خياطةedle من خلال الأنسجة (خط متقطع) ابتداء من النقطة (أ) إلى نقطة (ب). يجب أن يكون عقد قرانه في نقطة (ج). لاحظ أن أقل الغشاء المخاطي يتم تضمينها في مفاغرة من الأنسجة الأخرى. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وICR الفئران هو نموذج القوية التي يمكن أن تستخدم لدراسة آثار عملية جراحية في أمراض الأمعاء. توضح هذه المقالة طريقة لأداء مجلس النواب في الفئران مع نسبة نجاح 95٪ وأي مشاكل مع فشل النمو كما يتجلى في أوزان ثابتة تصل إلى 28 يوما بعد العملية. وتشمل أهم التحديات لنجاح ICR تجنب العوائق الأمعاء في مفاغرة والتسريبات المفاغرة.
وتهدف العناصر الفنية لعملية جراحية لمنع انسداد في تعظيم قطر التجويف في مفاغرة. استلواق؛ مزج بالملوق من الدقاق عند نقطة transection يزيد من قطر التجويف بقسمة الأمعاء بزاوية 30 درجة كما هو مبين في الشكل 1A. عندما أخذ لدغات من الأنسجة المعوية مع إبرة خياطة، فمن الضروري أن انبسط حواف الأمعاء وتمرير الإبرة حوالي 0.5 ملم من قطع الحافة. مفرط لدغات كبيرة من الأنسجة وتضييق التجويف. خيار AVOID تضييق اللمعية عند بناء مفاغرة هو لتوظيف استخدام دعامة قابلة للهضم كما وصفها كيرنان وآخرون 15. وتشمل الجوانب غير الفنية لتجنب عرقلة تختار خياطة صغيرة بما فيه الكفاية 4 وتجنب محتويات اللمعية ضخمة عن طريق تغذية الحيوانات على حمية سائلة يوم واحد قبل الجراحة و2 أيام بعد الجراحة.
السبب الثاني الأكثر شيوعا للوفيات بعد العملية هو تسرب توصيلي. تجنب هذا التعقيد يتطلب الالتزام الصارم بمبادئ مفاغرة الأمعاء. وكونها أول إمدادات الدم الكافية. بعد الاوعية الدموية التي تمد الدم إلى المنطقة من الأمعاء التي تم مقطوعة و ligated، الأمعاء يجب أن يتم فحص بصريا قبل transection. وهذا الجزء من نقص تروية الأمعاء تظهر داكن. هذا ينبغي إزالتها تماما وترك حواف صحية. من المهم أن تصور كمية صغيرة من النزف من قطع الحواف من الأمعاء المتبقية. وأنس ضيق المياهtomosis هو أيضا ضروري لتجنب تسرب محتويات اللمعية مما يؤدي إلى التسمم. ويتحقق هذا عن طريق تجنب فجوات كبيرة بين الخيوط الجراحية، والتأكد من أن جميع طبقات الأمعاء مدرجة في غرزة (الشكل 3). وتضاءلت قوة الجرح كثيرا في اليومين الأولى بعد العملية، وبالتالي الغرز وضعها بشكل صحيح ضرورية لتوفير قوة 16،17. وهناك شرك محتمل هو قصد فقط بما في ذلك الغشاء المخاطي كما الغشاء المخاطي يمكن تجعد من تجويف القولون مقطوع. هذا يمكن تجنبها من خلال وضع تصور لخفض حافة المصلية والحد من الغشاء المخاطي هابط مرة أخرى في التجويف مع ملقط بلطف.
وينبغي النظر في الضوابط الجراحية صورية في التصميم التجريبي من الدراسات باستخدام نموذج ICR للسيطرة على الآثار المحتملة للالتباس الإجهاد الجراحي، والتلاعب في الأمعاء، و / أو فقدان صمام اللفائفية. اختيار الإجراء خدعة سيعتمد على السؤال الأساسي الذي يطرح فيالدراسة. على سبيل المثال، إذا كان هدف البحث هو تقييم استجابة المضيف بعد خسارته صمام اللفائفية، فإنه سيكون من الحكمة أن تشمل مجموعة الجراحة الزائفة التي يتم إجراء مفاغرة معوية مع ترك صمام اللفائفية في المكان. وعادة ما يتم ذلك عن طريق transecting الأمعاء الدقيقة دون استئصال ثم يؤدون ومفاغرة الأمعاء الصغيرة في نفس منوال مفاغرة اللفائفية القولونية 7،11. هذا من شأنه أن تسمح للمحققين التعليق تحديدا على آثار فقدان الصمام اللفائفي الأعوري عن طريق التحكم عن آثار مفاغرة الأمعاء. بدلا من ذلك، إذا كان الهدف هو فقط لدراسة الآثار المترتبة على استئصال الأمعاء ومفاغرة دون التعليق تحديدا على فقدان صمام اللفائفية، ثم جراحة صورية يجب أن تتضمن البطن، وينبغي أن يعامل الأمعاء كما أنه سيكون لمجلس النواب، ولكن من دون transection ومفاغرة. وهذا من شأنه السيطرة على الإجهاد الجراحي والتلاعب في الأمعاء. التقنيات الموضحة فيبروتوكول أعلاه يمكن أن تتكيف بسهولة لأداء إجراءات صورية.
يصف هذا البروتوكول لاستئصال اللفائفي القولوني، الذي يزيل 1.5-2 سم من محطة الدقاق ومجمل الأعور، ويحاكي عن كثب عملية تنفيذ كثير من الأحيان في المرضى الذين يعانون من مرض كرون اللفائفي القولوني. وقد استخدمت إجراءات مشابهة في IL-10 - نموذج التهاب القولون وبعد ذلك وضعت الفئران التهاب عفوية وتليف في الأمعاء الدقيقة مماثلة لتكرار مرض كرون 7،11 - /. قد يتم تطبيق مبادئ هذا الإجراء أيضا إلى نماذج أخرى من المرض. عن طريق إزالة 50٪ من الأمعاء الدقيقة مع مفاغرة اللفائفية القولونية، وقد استخدمت نماذج الماوس للتحقيق في استجابة نمو الأمعاء التكيف في متلازمة الأمعاء القصيرة 4-6. في المستقبل قد تصبح أيضا نموذجا مفيدا لدراسة الآثار النظامية والمحلية الجراحة في سرطان القولون والمستقيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
- Hallet, J., Zih, F. S., Lemke, M., Milot, L., Smith, A. J., Wong, C. S. Neo-adjuvant chemoradiotherapy and multivisceral resection to optimize R0 resection of locally recurrent adherent colon cancer. European Journal of Surgical Oncology. 40 (6), (2014).
- Rutgeerts, P., Geboes, K., Vantrappen, G. Natural history of recurrent Crohn's disease at the ileocolonic anastomosis after curative surgery. Gut. 25 (6), 665-672 (1984).
- Davis, D., Rivadeneira, D. Complications of colorectal anastomoses: leaks, strictures, and bleeding. The Surgical clinics of North America. 93 (1), 61-87 (2013).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Dekaney, C. M., Fong, J. J., Rigby, R. J., Lund, P. K., Henning, S. J., Helmrath, M. A. Expansion of intestinal stem cells associated with long-term adaptation following ileocecal resection in mice. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 293 (5), (2007).
- Speck, K. E., De Cruz, P., et al. Inflammation enhances resection-induced intestinal adaptive growth in IL-10 null mice. The Journal of surgical research. 168 (1), 62-69 (2011).
- Rigby, R. J., Hunt, M. R., et al. A new animal model of postsurgical bowel inflammation and fibrosis: the effect of commensal microflora. Gut. 58 (8), 1104-1112 (2009).
- Kostic, A. D., Xavier, R. J., Gevers, D. The Microbiome in Inflammatory Bowel Disease: Current Status and the Future Ahead. Gastroenterology. , 1-11 (2014).
- Gevers, D., Kugathasan, S., et al. The Treatment-Naive Microbiome in New-Onset Crohn's Disease. Cell host & microbe. 15 (3), 382-392 (2014).
- Ahmed, T., Rieder, F., Fiocchi, C., Achkar, J. P. Pathogenesis of postoperative recurrence in Crohn's disease. Gut. 60 (4), 553-562 (2011).
- Borowiec, A., Sydora, B., et al. Small bowel fibrosis and systemic inflammatory response after ileocolonic anastomosis in IL-10 null mice. Journal of Surgical Research. 178 (1), 147-154 (2012).
- Devine, A. A., Gonzalez, A., et al. Impact of Ileocecal Resection and Concomitant Antibiotics on the Microbiome of the Murine Jejunum and Colon. 8 (8), (2013).
- Bij, G. J., Oosterling, S. J., Beelen, R. H. J., Meijer, S., Coffey, J. C., van Egmond, M. The perioperative period is an underutilized window of therapeutic opportunity in patients with colorectal cancer. Annals of surgery. 249 (5), (2009).
- Scott, A. D., Uff, C., Phillips, R. K. Suppression of macrophage function by suture materials and anastomotic recurrence of Crohn's disease. The British journal of surgery. 80 (3), (1993).
- Kiernan, J. A. Intestinal anastomosis in the rat facilitated by a rapidly digested internal splint and indigestible but absorbable sutures. Journal of Surgical Research. 45, 427-431 (1988).
- Andersen, T. L., et al. Action of matrix metalloproteinases at restricted sites in colon anastomosis repair: an immunohistochemical and biochemical study. Surgery. 140 (1), 72-82 (2006).
- Thompson, S. K., Chang, E. Y., Jobe, B. A. Clinical review: Healing in gastrointestinal anastomoses, Part I. Microsurgery. 26 (3), 131-136 (2006).
