Protocol
Brugen af dyr protokoller blev godkendt af Health Science Animal Care og brug Udvalg ved University of Alberta.
1. Fremstilling af instrumenter, Dyr og operative Setup
- Overfør dyr til en ny, ren bur fraværende af alle faste fødevarer 24 timer før proceduren. De kan have fri adgang til vand og flydende diæt ad libitum indtil tidspunktet for proceduren.
- Autoklaver alle instrumenter, der er nødvendige for proceduren. Ren drift overflade og bedøvelsesmiddel næse kegle med 70% ethanol.
- Opsætning af operativsystemet overflade med operationsmikroskopet bedøvelsesmiddel maskine og forsyninger på en måde, der er behagelig for kirurgen. Albuerne af kirurgen skal have lov til at hvile komfortabelt på operationsbordet, med hænder og arme uhindret af udstyr. Instrumenter, suturer, vatpinde og en 10 ml sprøjte skal placeres på et sted, der tillader nem adgang under proceduren.
- Opsætningoverliggende varmelamper at give både varme for dyret under proceduren og lys til operativsystemet overflade.
- Fyld en 50 ml konisk rør med 0,9% saltvand, og et 1,5 ml rør med vaseline og sted nær operativsystemet overflade.
BEMÆRK: Steriliser alle instrumenter og kirurgiske forsyninger. Fordi tarmen gennemskæres, selve proceduren ikke er steril. Det anses for ren-kontamineret. Tag forholdsregler for at undgå indførelsen af udefrakommende smittekilder.
2. Ileocolic resektion med anastomose
- Narkosen ved indgivelse af 4% isofluran med en oxygen strømningshastighed på 2 l / min via næse kegle fra isofluran fordamperen, indtil dyrene respirationsfrekvens bremser til ca. 30-40 vejrtrækninger / min. Anvend moderat tryk på bagben på musen for at sikre, at der er ingen smerter svar forud for indledningen af proceduren. På dette tidspunkt, slå ned isofluran til 2%, og oxygen flow til 0,5 L / min. Intermitterendekontrollere smerte reaktion under proceduren og justere isofluran flow i overensstemmelse hermed.
- Påfør vaseline til øjnene for at forhindre udtørring under kirurgi, og immobilisere musen i liggende stilling med benene sikret ved hjælp af gennemsigtig tape.
- Rengør maven med povodine / jodopløsning, og ændre til nye sterile handsker.
- Lav en 1,5 cm hudincision i den øverste midterlinjen af maven ved hjælp af skarp punkt dissekere saks at eksponere fascia og bughinden. Åbn fascial / peritoneal lag på en tilsvarende måde gennem linea alba at blotlægge de peritoneale indhold.
- I modsætning til mennesker, er musen coecum typisk findes i den øverste venstre kvadrant af maven. Når identificeret Klem forsigtigt coecum med pincet og levere det gennem snittet. Brug fugtede vatpinde til fan ud ca. 3 cm terminal ileum strækker sig fra coecum over en steril gaze draperet på den abdominale overflade (figur 1A).Sikre den blotlagte tarm holdes fugtig med 0,9% saltvand under hele proceduren.
- Identificere ileocecal arterie forgrening den øvre mesenteriske arterie langs colon (figur 1A) ved hjælp af operativsystemet mikroskop. Dissekere de avaskulære væv støder op til ileocecal arterie, omringe og liger arterien med en 5-0 silke slips. Dernæst finde den regionale blodforsyning til terminale ileum og vælg en transection punkt på 1,5-2 cm proksimalt for ileocecal krydset. Ligere grenene til denne sektion af ileum som ovenfor. Opdel arterierne med micro dissekere saks.
- Opdele iskæmiske dele af ileum og colon sikre, at der er tilstrækkelig blodforsyning til de overskårne ender (figur 1B). Det er ofte nyttigt at spatulate ileum ved at opdele den i en 30 graders vinkel for at øge diameteren af hulrummet, så det mere ligner tyktarmen. Når ileocecal del af tarmen er fjernet, tilpasseoverskårne ender af ileum og colon på gaze, sikre mesenteriale grænser hver flugter.
- Konstruér anastomosen ved at tilnærme den overskårne ende af ileum til den overskårne ende af tyktarmen ved hjælp afbrudt 8-0 polypropylen suturer (figur 1c). Det første sting er placeret ved mesenterisk grænse, med senere suturer placeret hver 0,5 mm indtil Ileocolic anastomose er vandtæt. Ved passage af sutur nål gennem ileum og colon, sikre, at den afskårne kant ikke kastes, og broderede bites er 0,5 mm fra de afskårne kanter af tarmen. En typisk anastomose vil kræve 14 til 16 afbrudte suturer. Teste integriteten og åbenheden af anastomose ved afslutningen ved at rulle en vatpind proximalt til den distale over ileum at tvinge indhold gennem anastomosen. Tyndtarm indhold bør frit passere ind i tyktarmen uden anastomotisk lækage.
- Skyl udsat tarm med 3-4 ml 0,9% saltvand fra 10 ml sprøjteat vaske væk afføring fra overfladen af tarmen og levere tarm tilbage i bughulen. Brug 2 ml 0,9% saltvand skylle bughulen, og derefter dræne denne væske ved at anvende let tryk på bugvæggen sideværts.
- Luk snittet med en 3-0 silke kørende sutur, og afbryde strømmen af isofluran. Administrere 0,1 mg / kg af det langtidsvirkende opiater -buprenorphine- subkutant for postoperative smerter kontrol.
- Observere dyrene under varmelampe indtil de er mobile og derefter overføre dem til et kontinuerligt opvarmet bur.
3. postoperativ pleje og overvågning
- Overvåge dyr i en kontinuerligt opvarmet bur for tegn på angst for resten af dagen. Overfør dyr tilbage til dyret pleje facilitet i en ny steril bur med adgang til flydende kost og vand ad libitum. Dyrene kan enten anbringes i grupper på 3-4.
- Udfør en kontrol af postoperative dyr den følgende morgen,sikre dyrene vises ikke i nød. Feed kun flydende kost. Hvis de synes ubehagelige (dvs. krum stilling eller minimal aktivitet) administrere en ekstra dosis af subkutan buprenorphin. Tjek på de dyr, endnu engang i eftermiddag på postoperative dag 1.
- Om morgenen den postoperative dag 2 dyrene skal vises fuldt tilbagebetalt. Bevis for fødevareforbrug og stooling er positive tegn på bedring. Nu genoptage en solid foderdiæt for dyrene.
BEMÆRK: Tegn på angst omfatter krum stilling, dårlig pleje, og minimal aktivitet. Ved tegn på angst er fremtrædende dyrene skal aflives. - Aflive dyrene ved at inducere dyb anæstesi med 4% isofluran ved en O 2 strømningshastighed på 2 l / min, indtil dyrene reagerer ikke på foden tryk. Udfør cervikal dislokation, og observere for tegn på en ordentlig aflivning.
- Retningslinjer varierer, så henvise til institutionernes henstillinger vedrørende indikationerfor og passende metoder til aflivning i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dødeligheden og vægtændring post-op.
Dødeligheden efter ICR i 129S1 vild type mus er generelt ~ 5%. Den mest almindelige årsag til moral er tarmobstruktion på anastomosen. Andre årsager til mortalitet, inkluderer anastomotisk læk og intern brok fører til tarmobstruktion.
Vægttab kan ses op til 14 dage postoperativt, men er generelt ikke-signifikant. Mus en tendens til fuldstændigt at genvinde præoperativ vægt ved postoperativ dag 28 (figur 2).
Overdragelse af teknik
En ny ph.d.-studerende (BM) blev undervist i at udføre ICR procedure for at afgøre, om en operatør uden tidligere kirurgisk træning kunne lære teknikken. Træning begyndte med at lære, hvordan du udfører de enkelte afbrudte suturer er analoge med dem, der anvendes i anastomosen hjælp 8-0 nylonsutur. Suturer blev udført for at lukke et snit på tværs af en latex glove. Efter BM var i stand til effektivt at placere suturer gennem handsken uden at rive de observerede tre komplette procedurer forud for at forsøge en. Efter den første procedure blev afsluttet, så observerede de en anden procedure og forsøgte to mere. Af de tre dyr afsluttet, de sidste to gik på at overleve og trives. Det første dyr blev aflivet på grund af komplikationer ved anastomose.
Figur 1. Stadier af ileocolic resektion og anastomose. (A) ileocecal region af tarmen udfriet af maven. Sorte pile angiver fartøjer, der skal ligeres, stiplede linjer angiver transection point for colon og terminale ileum. (B) ileocecal region fjernes, afskårne ender af tarmen på linie, resterende blodforsyning påvises ved sorte pile. (C) Afsluttet ileocolic Anastomosis. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Animal vægte ved baseline postoperative dag 14 og postoperative dag 28. Ingen signifikante ændringer i kropsvægt blev observeret post-procedure som bestemt ved Mann-Whitney U statistisk test. ICR (Ileocolic resektion gruppe), kontrol (ikke-operative kontroller).
Figur 3. Repræsentant sti suturer gennem tarm væv. H & E farvede histologiske sektioner af ileum (til højre) og kolon (til venstre) er linet op til at demonstrere bane af suturen neEdle gennem væv (stiplet linje) startende fra punkt (a) til og med punkt (b). Knuden skal bindes i punkt (c). Bemærk, at mindre slimhinde er inkluderet i anastomosen end andre væv. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den murine ICR er en kraftfuld model, der kan bruges til at studere virkningerne af kirurgi i tarmsygdomme. Denne artikel beskriver en metode til at udføre ICR i mus med en succesrate på 95%, og ingen problemer med manglende trivsel som afspejlet ved stabile vægte op til 28 dage post-procedure. De væsentligste udfordringer for en vellykket ICR omfatter undgå tarm forhindringer på anastomosen og anastomoselækager.
Tekniske elementer til kirurgi for at forhindre obstruktion er rettet mod at maksimere lumen diameter på anastomosen. Spatulation af ileum ved overskæring punkt øger lumendiameteren ved at dividere tarmen på en 30 graders vinkel, som vist i figur 1A. Når man tager bid af tarmvæv med suturnål, er det vigtigt at oprulle kanterne af tarmen og passere nålen ca. 0,5 mm fra den afskårne kant. For store bidder af væv vil indsnævre lumen. En mulighed til AVOID luminale indsnævring ved konstruktion anastomosen er at ansætte brugen af en fordøjelig stent som beskrevet af Kiernan et al. 15. Ikke-tekniske aspekter for at undgå obstruktion omfatter valg af en tilstrækkelig lille sutur 4 og undgå voluminøse luminale indhold ved at fodre dyrene en flydende diæt en dag før operationen og 2 dage efter operationen.
Den anden mest almindelige årsag til postoperativ dødelighed er anastomotisk lækage. Undgå denne komplikation kræver streng overholdelse af principperne for intestinal anastomose. Den første er tilstrækkelig blodforsyning. Efter kar, der forsyner blod til området af tarmen bliver resekteres er blevet ligeret, bør tarmen inspiceres visuelt før overskæring. Den iskæmiske segment af tarmen vises mørke; dette bør fjernes helt forlader sunde kanter. Det er vigtigt at visualisere en lille mængde af blødning fra de afskårne kanter af det resterende tarmen. En vandtæt Anastomosis er også vigtigt at undgå spild af luminale indhold, der fører til sepsis. Dette opnås ved at undgå store huller mellem suturer, og sikre, at alle lag af tarmen er inkluderet i sting (figur 3). Sårstyrke er stærkt formindsket i de to første postoperative dage, således korrekt placeret suturer er afgørende for at give styrke 16,17. En potentiel faldgrube utilsigtet kun herunder slimhinden som slimhinden kan rynke ud af hulrummet i transekteret colon. Dette kan undgås ved at visualisere snitfladen af serosa og forsigtigt reducere diskusprolaps mucosa tilbage i lumen med en pincet.
Skinkirurgisk kontrol bør overvejes i den eksperimentelle design af studier ved hjælp af ICR-modellen til at styre for de potentielle forstyrrende virkninger af kirurgisk stress, intestinal manipulation, og / eller tab af ileocecal ventil. Valget af fingeret procedure vil afhænge af den primære spørgsmål bliver stillet iundersøgelsen. For eksempel, hvis målet forskning er at vurdere værtens respons efter at miste ileocecal ventil, så ville det være fornuftigt at inkludere en skinkirurgi gruppe, i hvilken en intestinal anastomose udføres mens ileocecal ventil på plads. Dette gøres typisk ved at gennemskærende tyndtarmen uden resektion derefter udføre en lille tarm anastomose på samme måde som ileocolic anastomose 7,11. Dette ville give efterforskerne at kommentere specifikt på effekten af iliocaekal ventil tab ved at kontrollere for effekten af intestinal anastomose. Alternativt, hvis målet kun er at undersøge virkningerne af intestinal resektion og anastomose uden at kommentere specifikt på tab af ileocecal ventil, så en skinkirurgi bør omfatte en laparotomi, og tarmen skal behandles som det ville for ICR, men uden overskæring og anastomose. Dette ville kontrollere for kirurgisk stress og intestinal manipulation. Beskrevet i teknikkerprotokollen ovenfor kan let tilpasses til at udføre skin procedurer.
Denne protokol beskriver en ileocolic resektion, som fjerner 1,5-2 cm terminal ileum og enkeltheder af coecum, og nøje efterligner ofte udført en operation hos patienter med ileocolic Crohns sygdom. Lignende procedurer er blevet anvendt i IL-10 - / - colitis model, hvorefter mus udviklede spontan og fibrose i tyndtarmen analog med Crohns sygdom gentagelse 7,11. Principperne i denne procedure kan også gælde for andre modeller af sygdom. Ved at fjerne 50% af tyndtarmen med ileocolic anastomose er musemodeller er blevet anvendt til at undersøge adaptive tarmvæksten respons i kort tarm syndrom 4-6. I fremtiden kan det også blive en nyttig model til at studere de systemiske og lokale virkninger af kirurgi i kolorektal cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
- Hallet, J., Zih, F. S., Lemke, M., Milot, L., Smith, A. J., Wong, C. S. Neo-adjuvant chemoradiotherapy and multivisceral resection to optimize R0 resection of locally recurrent adherent colon cancer. European Journal of Surgical Oncology. 40 (6), (2014).
- Rutgeerts, P., Geboes, K., Vantrappen, G. Natural history of recurrent Crohn's disease at the ileocolonic anastomosis after curative surgery. Gut. 25 (6), 665-672 (1984).
- Davis, D., Rivadeneira, D. Complications of colorectal anastomoses: leaks, strictures, and bleeding. The Surgical clinics of North America. 93 (1), 61-87 (2013).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Dekaney, C. M., Fong, J. J., Rigby, R. J., Lund, P. K., Henning, S. J., Helmrath, M. A. Expansion of intestinal stem cells associated with long-term adaptation following ileocecal resection in mice. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 293 (5), (2007).
- Speck, K. E., De Cruz, P., et al. Inflammation enhances resection-induced intestinal adaptive growth in IL-10 null mice. The Journal of surgical research. 168 (1), 62-69 (2011).
- Rigby, R. J., Hunt, M. R., et al. A new animal model of postsurgical bowel inflammation and fibrosis: the effect of commensal microflora. Gut. 58 (8), 1104-1112 (2009).
- Kostic, A. D., Xavier, R. J., Gevers, D. The Microbiome in Inflammatory Bowel Disease: Current Status and the Future Ahead. Gastroenterology. , 1-11 (2014).
- Gevers, D., Kugathasan, S., et al. The Treatment-Naive Microbiome in New-Onset Crohn's Disease. Cell host & microbe. 15 (3), 382-392 (2014).
- Ahmed, T., Rieder, F., Fiocchi, C., Achkar, J. P. Pathogenesis of postoperative recurrence in Crohn's disease. Gut. 60 (4), 553-562 (2011).
- Borowiec, A., Sydora, B., et al. Small bowel fibrosis and systemic inflammatory response after ileocolonic anastomosis in IL-10 null mice. Journal of Surgical Research. 178 (1), 147-154 (2012).
- Devine, A. A., Gonzalez, A., et al. Impact of Ileocecal Resection and Concomitant Antibiotics on the Microbiome of the Murine Jejunum and Colon. 8 (8), (2013).
- Bij, G. J., Oosterling, S. J., Beelen, R. H. J., Meijer, S., Coffey, J. C., van Egmond, M. The perioperative period is an underutilized window of therapeutic opportunity in patients with colorectal cancer. Annals of surgery. 249 (5), (2009).
- Scott, A. D., Uff, C., Phillips, R. K. Suppression of macrophage function by suture materials and anastomotic recurrence of Crohn's disease. The British journal of surgery. 80 (3), (1993).
- Kiernan, J. A. Intestinal anastomosis in the rat facilitated by a rapidly digested internal splint and indigestible but absorbable sutures. Journal of Surgical Research. 45, 427-431 (1988).
- Andersen, T. L., et al. Action of matrix metalloproteinases at restricted sites in colon anastomosis repair: an immunohistochemical and biochemical study. Surgery. 140 (1), 72-82 (2006).
- Thompson, S. K., Chang, E. Y., Jobe, B. A. Clinical review: Healing in gastrointestinal anastomoses, Part I. Microsurgery. 26 (3), 131-136 (2006).
