Protocol
Animal gebruik protocollen werden goedgekeurd door de Health Science Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Alberta.
1. Voorbereiding van de instrumenten, Dieren en Operative Setup
- Transfer dieren een nieuwe, schone kooi afwezigheid van vast voedsel 24 uur voorafgaand aan de procedure. Zij vrije toegang tot water en vloeibare voeding ad libitum tot het tijdstip van de procedure.
- Autoclaaf alle instrumenten die nodig zijn voor de procedure. Schoon werkoppervlak en verdoving neuskegel met 70% ethanol.
- Het opzetten van de operationele oppervlakte met operationele microscoop, verdoving machine en benodigdheden op een manier die comfortabel is voor de chirurg. De ellebogen van de chirurg moet worden toegestaan om comfortabel op de operatietafel, met handen en armen onbelemmerd door apparatuur. Instrumenten, hechtingen, wattenstaafjes, en een spuit van 10 ml moet in een locatie die gemakkelijk toegang tijdens de procedure toestaat worden geplaatst.
- Oprichtenoverhead warmtelampen om zowel warmte voor het dier tijdens de procedure en licht voor de operationele oppervlak.
- Vul een 50 ml conische buis met 0,9% zoutoplossing, en een 1,5 ml tube met vaseline en plaats in de buurt van het werkoppervlak.
OPMERKING: Steriliseer alle instrumenten en chirurgische benodigdheden. Omdat de darm wordt doorgesneden, de procedure zelf is niet steriel. Het wordt beschouwd als schoon-besmet. Neem maatregelen om de introductie van exogene bronnen van infectie te voorkomen.
2. ileocecaalresectie met Anastomosis
- Induceren anesthesie door toediening van 4% isofluraan met een zuurstof stroomsnelheid van 2 l / min via neuskegel van de isofluraan vaporizer totdat de dieren ademhaling vertraagt tot ongeveer 30-40 ademhalingen / min. Solliciteer matige druk op de achterste voet van de muis om te zorgen dat er geen pijn reactie voorafgaand aan de inleiding van de procedure. Op dit moment afwijzen isofluraan 2% en zuurstoftoevoer tot 0,5 l / min. Tussenpozencheck pijn respons tijdens de procedure en dienovereenkomstig aan te passen isofluraan debiet.
- Vaseline om de ogen te drogen tijdens de operatie te voorkomen, en te immobiliseren de muis in rugligging met ledematen beveiligd met transparante tape.
- Reinig de buik met povodine / jodium oplossing, en veranderen in nieuwe steriele handschoenen.
- Maak een 1,5 cm huid incisie in de bovenste middellijn van de buik met behulp van scherpe punt ontleden schaar om de fascia en het buikvlies bloot. Open de fasciaal / peritoneale laag op dezelfde wijze door de linea alba de peritoneale inhoud bloot.
- In tegenstelling tot de mens, is de muis blindedarm doorgaans te vinden in de linker bovenste kwadrant van de buik. Eenmaal geïdentificeerd, voorzichtig pak de blindedarm met een pincet en leveren het door de incisie. Gebruik bevochtigde wattenstaafjes uitwaaieren ongeveer 3 cm van het ileum dat zich uitstrekt van de blindedarm dan een steriel gaasje gedrapeerd op de buik oppervlak (Figuur 1A).Zorgen de blootgestelde darm tijdens de gehele procedure vochtig met 0,9% zoutoplossing gehouden.
- Identificeer de Bauhin slagader zich vertakt de mesenterica superior langs de dikke darm (figuur 1A) met behulp van de operationele microscoop. Ontleden de avasculaire weefsels grenzend aan de Bauhin slagader, omcirkelen en afbinden van de slagader met een 5-0 zijden stropdas. Zoek vervolgens de regionale bloedtoevoer naar de terminale ileum en kies een doorsnijding punt 1,5-2 cm proximaal van de Bauhin kruising. Afbinden de takken om dit deel van de dunne darm, zoals hierboven. Verdeel de slagaders met micro ontleden schaar.
- Verdeel het ischemische porties ileum en colon zodat er voldoende bloedtoevoer naar de doorgesneden uiteinden (figuur 1B). Het is vaak nuttig om het ileum spatulate door het verdelen in een hoek van 30 graden aan de diameter van het lumen te vergroten zodat deze beter overeenkomt met de colon. Zodra de Bauhin deel van de darm is verwijderd, plaatst u dedoorgesneden uiteinden van ileum en colon op het gaas, waardoor het mesenterium grenzen van elke uitgelijnd.
- Construeer de anastomose door de onderlinge aanpassing van de doorsneden einde van de dunne darm naar de doorsneden einde van de dikke darm met behulp van onderbroken 8-0 polypropyleen hechtingen (figuur 1C). De eerste steek wordt geplaatst op de mesenteriale rand, gevolgd hechtingen geplaatst om de 0,5 mm tot Ileocolic anastomose waterdicht. Bij het passeren van de hechtdraad naald door het ileum en colon, ervoor zorgen dat de snijrand niet wordt gegooid, en naald beten zijn 0,5 mm van de snijranden van de darm. Een typische anastomose 14-16 onderbroken hechtingen vereisen. Test de integriteit en de doorgankelijkheid van de anastomose na voltooiing door het rollen van een wattenstaafje proximaal naar distaal over de dunne darm om de inhoud te dwingen via de anastomose. Kleine darminhoud moet vrij kunnen overgaan in de dikke darm zonder naadlekkage.
- Spoel de blootgestelde darm met 3-4 ml 0,9% zoutoplossing uit de injectiespuit 10 mlweg te wassen ontlasting van het oppervlak van de darm en lever darm terug in de peritoneale holte. Met behulp van 2 ml van 0,9% zoutoplossing spoelen van de buikholte, en laat vervolgens deze vloeistof door het toepassen van lichte druk op de buikwand lateraal.
- Sluit de incisie met een 3-0 zijden hechtdraad lopen, en stop de stroom van isofluraan. Dien 0,1 mg / kg van de langwerkende opiaten -buprenorphine- subcutaan voor postoperatieve pijnbestrijding.
- Observeer de dieren onder de warmtelamp totdat ze mobiel vervolgens overbrengen naar een continu opgewarmd kooi.
3. Post-operatieve Zorg en Monitoring
- Monitor dieren in een continu opgewarmd kooi tekenen van ongerief voor de rest van de dag. Transfer dieren terug naar het dier zorginstelling in een nieuwe steriele kooi met toegang tot vloeibaar dieet en water ad lib. Dieren kunnen worden gehuisvest in groepen van 3-4.
- Voer een controle op de post-operatieve dieren de volgende ochtend,zorgen voor de dieren niet in nood. Feed alleen vloeibaar dieet. Als ze verschijnen ongemakkelijk (dwz, gebogen houding of minimale activiteit) toedienen van een extra dosis subcutaan buprenorfine. Bij de dieren opnieuw in de namiddag op postoperatieve dag 1.
- Op de ochtend van de dag na de operatie 2 de dieren moeten verschijnen volledig hersteld. Bewijs van de voedselconsumptie en stooling zijn positieve tekenen van herstel. Nu, weer een solide chow voeding voor de dieren.
OPMERKING: Tekenen van nood zijn onder gebogen houding, slechte verzorging, en minimale activiteit. Als tekenen van nood zijn prominent de dieren moeten worden gedood. - Euthanaseren de dieren bij het induceren diepe anesthesie met 4% isofluraan in een O2 debiet van 2 l / min tot dieren reageren op voetdruk. Voer cervicale dislocatie, en observeren op tekenen van een goede euthanization.
- Richtlijnen variëren, dus raadpleeg de instellingen aanbevelingen met betrekking tot indicatiesvoor en passende methoden van euthanization bij muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sterftecijfers en gewichtsverandering post-op.
Sterftecijfers volgende ICR in 129S1 wild-type muizen zijn over het algemeen ~ 5%. De meest voorkomende oorzaak van de moraal is darmobstructie bij de anastomose. Andere doodsoorzaken zijn onder anastomotische lek en interne hernia leidt tot obstructie darmen.
Gewichtsverlies kan postoperatief gezien worden tot 14 dagen, maar is over het algemeen niet-significant. Muizen meestal preoperatieve gewicht volledig herwinnen van postoperatieve dag 28 (Figuur 2).
Overdraagbaarheid van de techniek
Een nieuwe afgestudeerde student (BM) werd onderwezen aan de ICR procedure uit te voeren om te bepalen of een exploitant zonder eerdere chirurgische opleiding de techniek kan leren. Training begon met het leren hoe je de enkele onderbroken hechtingen analoog aan die gebruikt worden in de anastomose met behulp van 8-0 nylon hechtdraad voeren. Hechtingen werden uitgevoerd om een incisie gemaakt over een latex Glo sluitenve. Na BM was in staat om efficiënt te plaatsen hechtingen door de handschoen zonder scheuren, merkte ze drie volledige procedures voorafgaand aan het proberen een. Na de eerste procedure is voltooid, zij dan andere procedure genomen en geprobeerd twee. Van de drie dieren voltooid, de laatste twee gingen op om te overleven en te gedijen. Het eerste dier werd gedood door complicaties bij de anastomose.
Figuur 1. Fasen van ileocecaalresectie en anastomose. (A) Bauhin regio darm verlost uit de buik. Zwarte pijlen geven vaartuigen worden geligeerd stippellijnen aangegeven doorsnijding punten colon en ileum. (B) Bauhin regio verwijderd, afgesneden uiteinden van de darm worden uitgelijnd, resterende bloedtoevoer wordt aangetoond door zwarte pijlen. (C) Afgesloten ileocolic anastomosis. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Animal gewichten basislijn, post-operatieve dag 14 en postoperatieve dag 28. Geen significante veranderingen in gewichten werden waargenomen na de procedure zoals bepaald door de Mann-Whitney U statistische test. ICR (ileocecaalresectie groep), controle (niet-operatieve controles).
Figuur 3. Representatieve pad van hechtdraden door darmweefsel. H & E gekleurde histologische secties van ileum (rechts) en colon (links) zijn opgesteld aan de baan van de hechtdraad ne tonenEdle door de weefsels (stippellijn) begint bij punt (a) tot onder (b). De knoop moet bij punt (c) worden gekoppeld. Merk op dat er minder slijmvlies wordt opgenomen in de anastomose dan andere weefsels. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De muizen ICR is een krachtig model dat kan worden gebruikt om de effecten van chirurgie in darmziekten bestuderen. Dit artikel beschrijft een werkwijze voor het uitvoeren ICR muizen met een slagingspercentage van 95% en geen problemen met groeiachterstand zoals blijkt uit stabiel gewicht tot 28 dagen na de procedure. De belangrijkste uitdagingen voor succesvolle ICR omvatten het vermijden darm obstakels op de anastomose en anastomose lekken.
Technische elementen om de operatie te voorkomen obstructie zijn gericht op het maximaliseren lumen diameter aan de anastomose. Spatulation van het ileum in de doorsnijding stijgt het lumen diameter van de darm delen een hoek van 30 graden zoals in figuur 1A. Bij het nemen beten van darmweefsel de hechtdraad naald, is het essentieel om de randen van de darm en afrollen langs de naald ongeveer 0,5 mm van het snijvlak. Te grote happen van het weefsel zal het lumen versmallen. Een optie om avoid luminale vernauwing de geconstrueerde anastomose is het gebruik van een verteerbare stent gebruiken zoals beschreven door Kiernan et al. 15. Niet-technische aspecten aan obstructie te voorkomen zijn onder andere het selecteren van een voldoende kleine hechtdraad 4 en het vermijden van volumineuze luminale inhoud door het voeren van de dieren een vloeibaar dieet een dag voorafgaand aan de operatie en 2 dagen na de ingreep.
De tweede meest voorkomende oorzaak van postoperatieve sterfte is anastomotische lek. Het vermijden van deze complicatie vereist strikte naleving van de beginselen van de intestinale anastomose. De eerste is voldoende bloedtoevoer. Nadat de vaten die bloed leveren aan het gebied van de darm wordt weggesneden zijn geligeerd, de darm visueel worden geïnspecteerd voordat transection. De ischemische segment van de darm zal schemerige verschijnen; Dit moet volledig verwijderd waardoor gezond randen. Het is belangrijk om een kleine hoeveelheid bloeden uit de snijkanten van de overblijvende darm visualiseren. Een waterdichte anastomosis is ook essentieel om het morsen van luminale inhoud leidend tot sepsis te voorkomen. Dit wordt bereikt door het vermijden van grote verschillen tussen hechtingen, en ervoor zorgen dat alle lagen van de darm in de steek (figuur 3). Wond is sterk verminderd in de eerste twee postoperatieve dagen, dus juist geplaatste hechtingen essentieel sterkte 16,17 verschaffen. Een potentiële valkuil onbedoeld omvat slechts de mucosa het slijmvlies kan tuiten uit het lumen van het colon doorgesneden. Dit kan worden vermeden door het visualiseren van de snijrand van serosa en voorzichtig verminderen verzakte slijmvlies terug in het lumen met een tang.
Sham chirurgische controles moet worden gezien in de experimentele opzet van studies met behulp van de ICR-model om te controleren voor de mogelijke verstorende effecten van chirurgische stress, intestinale manipulatie en / of verlies van de Bauhin klep. De keuze van sham procedure hangt af van de primaire vraag gesteld inde studie. Als bijvoorbeeld het onderzoek moet de host reactie na verlies van de Bauhin klep evalueren, dan zou het verstandig een sham operatie groep waarin een intestinale anastomose wordt uitgevoerd terwijl de Bauhin afsluiter plaats wordt geregistreerd. Dit wordt typisch gedaan door doorsnijden de dunne darm zonder resectie vervolgens uitvoeren van een dunne darm anastomose op dezelfde wijze als de ileocolic anastomose 7,11. Dit stelt onderzoekers concrete uitspraken over de effecten van Bauhin klep verlies door het regelen van de intestinale anastomose. Alternatief, als het doel is alleen de intestinale resectie en anastomose bestuderen zonder speciaal commentaar op verlies van de Bauhin klep, dan schijn operatie moet een laparotomie, en de darmen worden behandeld gemeld als bij ICR, zonder doorsnijding en anastomose. Dit zou regelen voor chirurgische stress en intestinale manipulatie. De beschreven techniekenhet bovenstaande protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor het uitvoeren sham procedures.
Dit protocol beschrijft een ileocecaalresectie, die 1,5-2 cm van terminale ileum en het geheel van de blindedarm verwijderd, en nauw bootst een operatie vaak uitgevoerd bij patiënten met de ziekte van ileocolic Crohn. Vergelijkbare procedures zijn gebruikt in de IL-10 - / - colitis model waarna muizen ontwikkelden spontane ontsteking en fibrose in de kleine darm analoog aan Crohn herhaling 7,11. De principes van deze procedure kan ook van toepassing zijn op andere modellen van de ziekte. Door het verwijderen van 50% van de dunne darm met ileocolic anastomose zijn muizenmodellen gebruikt om de adaptieve respons intestinale groei in korte darmsyndroom 4-6 onderzoeken. In de toekomst kan dit ook een bruikbaar model voor het bestuderen van systemische en lokale effecten van chirurgie bij colorectale kanker worden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
- Hallet, J., Zih, F. S., Lemke, M., Milot, L., Smith, A. J., Wong, C. S. Neo-adjuvant chemoradiotherapy and multivisceral resection to optimize R0 resection of locally recurrent adherent colon cancer. European Journal of Surgical Oncology. 40 (6), (2014).
- Rutgeerts, P., Geboes, K., Vantrappen, G. Natural history of recurrent Crohn's disease at the ileocolonic anastomosis after curative surgery. Gut. 25 (6), 665-672 (1984).
- Davis, D., Rivadeneira, D. Complications of colorectal anastomoses: leaks, strictures, and bleeding. The Surgical clinics of North America. 93 (1), 61-87 (2013).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Dekaney, C. M., Fong, J. J., Rigby, R. J., Lund, P. K., Henning, S. J., Helmrath, M. A. Expansion of intestinal stem cells associated with long-term adaptation following ileocecal resection in mice. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 293 (5), (2007).
- Speck, K. E., De Cruz, P., et al. Inflammation enhances resection-induced intestinal adaptive growth in IL-10 null mice. The Journal of surgical research. 168 (1), 62-69 (2011).
- Rigby, R. J., Hunt, M. R., et al. A new animal model of postsurgical bowel inflammation and fibrosis: the effect of commensal microflora. Gut. 58 (8), 1104-1112 (2009).
- Kostic, A. D., Xavier, R. J., Gevers, D. The Microbiome in Inflammatory Bowel Disease: Current Status and the Future Ahead. Gastroenterology. , 1-11 (2014).
- Gevers, D., Kugathasan, S., et al. The Treatment-Naive Microbiome in New-Onset Crohn's Disease. Cell host & microbe. 15 (3), 382-392 (2014).
- Ahmed, T., Rieder, F., Fiocchi, C., Achkar, J. P. Pathogenesis of postoperative recurrence in Crohn's disease. Gut. 60 (4), 553-562 (2011).
- Borowiec, A., Sydora, B., et al. Small bowel fibrosis and systemic inflammatory response after ileocolonic anastomosis in IL-10 null mice. Journal of Surgical Research. 178 (1), 147-154 (2012).
- Devine, A. A., Gonzalez, A., et al. Impact of Ileocecal Resection and Concomitant Antibiotics on the Microbiome of the Murine Jejunum and Colon. 8 (8), (2013).
- Bij, G. J., Oosterling, S. J., Beelen, R. H. J., Meijer, S., Coffey, J. C., van Egmond, M. The perioperative period is an underutilized window of therapeutic opportunity in patients with colorectal cancer. Annals of surgery. 249 (5), (2009).
- Scott, A. D., Uff, C., Phillips, R. K. Suppression of macrophage function by suture materials and anastomotic recurrence of Crohn's disease. The British journal of surgery. 80 (3), (1993).
- Kiernan, J. A. Intestinal anastomosis in the rat facilitated by a rapidly digested internal splint and indigestible but absorbable sutures. Journal of Surgical Research. 45, 427-431 (1988).
- Andersen, T. L., et al. Action of matrix metalloproteinases at restricted sites in colon anastomosis repair: an immunohistochemical and biochemical study. Surgery. 140 (1), 72-82 (2006).
- Thompson, S. K., Chang, E. Y., Jobe, B. A. Clinical review: Healing in gastrointestinal anastomoses, Part I. Microsurgery. 26 (3), 131-136 (2006).
