Protocol
les protocoles d'utilisation des animaux ont été approuvés par le comité de soins et d'utilisation des animaux sciences de la santé à l'Université de l'Alberta.
1. Préparation des instruments, les animaux et configuration opérationnelle
- Transférer les animaux à une nouvelle, propre absent de la cage de tout solide nourriture 24 heures avant l'intervention. Ils peuvent avoir accès gratuitement à l'eau, et le liquide alimentation ad lib jusqu'à ce que le temps de la procédure.
- Autoclave tous les instruments nécessaires à la procédure. Surface de travail propre et anesthésique cône de nez avec 70% d'éthanol.
- Mettre en place la surface d'exploitation avec microscope opératoire, appareil d'anesthésie et des produits d'une manière qui est confortable pour le chirurgien. Les coudes du chirurgien devraient être autorisés à se reposer confortablement sur la table d'opération, avec les mains et les bras dégagée par les équipements. Instruments, des sutures, des cotons-tiges, et une seringue de 10 ml doivent être placés dans une position qui permet un accès facile au cours de la procédure.
- Installerlampes chauffantes puissent fournir à la fois la chaleur de l'animal durant la procédure et de la lumière pour la surface d'exploitation.
- Remplir un tube conique de 50 ml avec une solution saline à 0,9%, et un tube de 1,5 ml avec de la vaseline et le lieu près de la surface de fonctionnement.
REMARQUE: Stériliser tous les instruments et de fournitures chirurgicales. Parce que l'intestin est sectionné, la procédure elle-même ne sont pas stériles. Il est considéré comme propre-contaminée. Prendre des mesures pour éviter l'introduction de sources exogènes de l'infection.
2. iléocoliques résection avec anastomose
- Induire une anesthésie par administration de 4% d'isoflurane avec un débit d'oxygène de 2 L / min par l'intermédiaire de la coiffe jusqu'à ce que le vaporisateur isoflurane fréquence respiratoire des animaux ralentit à environ 30 à 40 respirations / min. Appliquer une pression modérée sur le pied arrière de la souris pour assurer qu'il n'y a pas de réponse à la douleur avant de lancer la procédure. À ce stade, baissez isoflurane à 2% et le flux d'oxygène à 0,5 L / min. Intermittentevérifier la réponse de la douleur au cours de la procédure et régler le débit de l'isoflurane en conséquence.
- Appliquez de la vaseline pour les yeux pour éviter le dessèchement pendant la chirurgie, et immobiliser la souris dans la position couchée sur le dos avec les membres sécurisées à l'aide du ruban adhésif transparent.
- Nettoyez l'abdomen avec une solution povodine / d'iode, et se transformer en nouveaux gants stériles.
- Faire un 1,5 cm incision de la peau sur la ligne médiane supérieure de l'abdomen à l'aide de ciseaux pointu dissection pour exposer le fascia et du péritoine. Ouvrez la couche aponévrotique / péritonéale de la même façon à travers la ligne blanche pour exposer le contenu du péritoine.
- En revanche chez l'homme, le caecum de souris se trouve généralement dans le quadrant supérieur gauche de l'abdomen. Une fois identifié, saisir doucement le caecum avec une pince et de le livrer à travers l'incision. Utilisez des cotons-tiges humectés de ventilateur sur environ 3 cm de l'iléon terminal extension du caecum sur une gaze stérile drapée sur la surface abdominale (figure 1A).Assurez-vous de l'intestin exposé est maintenu humide avec 0,9% de solution saline pendant toute la durée de la procédure.
- Identifier l'artère iléo-caecale bifurcation de l'artère mésentérique supérieure le long du côlon (Figure 1A) à l'aide du microscope opératoire. Disséquer les tissus adjacents avasculaire de l'artère iléo-colique, encercler et ligaturer l'artère avec une cravate de soie 5-0. Ensuite, localisez l'approvisionnement en sang régional de l'iléon terminal et choisir un point de sectionnement 1,5-2 cm en amont de la jonction iléo-colique. Ligaturer les branches de cette section de l'iléon comme ci-dessus. Diviser les artères avec micro dissection ciseaux.
- Diviser les parties ischémiques de l'iléon et du colon assurer qu'il ya un apport sanguin adéquat aux extrémités sectionnées (figure 1B). Il est souvent utile à la spatule en divisant l'iléon à un angle de 30 degrés pour augmenter le diamètre de la lumière de sorte qu'elle corresponde plus étroitement le côlon. Une fois la partie iléo-colique intestinale a été supprimé, aligner leextrémités sectionnées de l'iléon et du colon sur la toile, assurant les frontières de chaque mésentériques sont alignés.
- Construire l'anastomose en rapprochant l'extrémité sectionnée de l'iléon à l'extrémité sectionnée du côlon à l'aide interrompu 8-0 sutures en polypropylene (figure 1c). Le premier point est placé à la frontière mésentérique, avec des sutures ultérieures placés tous les 0,5 mm jusqu'à l'anastomose iléo-colique est étanche. Lors du passage de l'aiguille de suture à travers l'iléon et du côlon, de sorte que l'arête de coupe ne sont pas aplatis, et les piqûres d'aiguille sont de 0,5 mm à partir des bords de l'intestin de coupe. Une anastomose typique, il faudra 14 à 16 sutures interrompues. Testez l'intégrité et la perméabilité de l'anastomose à la fin en faisant rouler une proximale coton-tige à distal sur l'iléon de forcer contenu à travers l'anastomose. Contenu de l'intestin grêle devraient passer librement dans le côlon sans fuite anastomotique.
- Rincer l'intestin exposé avec 3-4 ml d'une solution saline à 0,9% à partir de la seringue de 10 mlpour laver les selles de la surface de l'intestin, et fournir l'intestin dans la cavité péritonéale. En utilisant 2 ml de solution saline 0,9% rincer la cavité péritonéale, et puis les égoutter ce fluide en appliquant une légère pression à la paroi abdominale latérale.
- Fermer l'incision avec une suture 3-0 fonctionnement de la soie, et interrompre le flux de l'isoflurane. Administrer 0,1 mg / kg de l'opiacé à action prolongée -buprenorphine- voie sous-cutanée pour le contrôle de la douleur post-opératoire.
- Observer les animaux sous la lampe de chaleur jusqu'à ce qu'ils soient mobiles puis de les transférer dans une cage sans cesse réchauffé.
3. Soins post-opératoires et de surveillance
- De surveiller les animaux dans une cage sans cesse réchauffé les signes de détresse pour le reste de la journée. Transférer les animaux vers le centre de protection des animaux dans une nouvelle cage stérile avec accès à l'alimentation liquide et de l'eau ad lib. Les animaux peuvent être hébergés en groupes de 3-4.
- Effectuer un contrôle sur les animaux post-opératoires, le lendemain matin,assurer que les animaux ne semblent pas en détresse. Nourrir seul régime liquide. Si elles apparaissent mal à l'aise (ie, une posture voûtée ou activité minimale) administrer une dose supplémentaire de buprénorphine sous-cutanée. Arrivée sur les animaux une fois de plus dans l'après-midi le jour post-opératoire 1.
- Le matin du jour post-opératoire 2, les animaux doivent apparaître complètement récupéré. Preuve de la consommation alimentaire et des selles sont des signes positifs de reprise. Maintenant, reprendre une alimentation chow solide pour les animaux.
REMARQUE: Les signes de détresse comprennent une posture voûtée, toilettage pauvres, et une activité minimale. Si des signes de détresse sont au premier plan les animaux doivent être euthanasiés. - Euthanasier les animaux en induisant anesthésie profonde avec 4% d'isoflurane à un débit O 2 de 2 L / min jusqu'à ce que les animaux ne réagissent pas à la pression du pied. Effectuer dislocation cervicale, et d'observer les signes de l'euthanasie approprié.
- Lignes directrices varient, se réfèrent à des institutions recommandations concernant les indicationspour et des méthodes appropriées d'euthanasie chez les souris.
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Representative Results
Les taux de mortalité et le changement de poids post-op.
Les taux de mortalité suivants IC chez les souris de type sauvage 129S1 sont généralement ~ 5%. La cause la plus fréquente de la morale est une occlusion intestinale à l'anastomose. Les autres causes de mortalité incluent fuite anastomotique et hernie interne entraînant une occlusion intestinale.
La perte de poids peut être vu jusqu'à 14 jours après l'opération, mais est généralement non significative. Les souris ont tendance à reprendre complètement poids pré-opératoire par post-opératoire de 28 jours (Figure 2).
Transférabilité de la technique
Un nouveau étudiant diplômé (BM) a appris à effectuer la procédure ICR pour déterminer si un opérateur sans formation chirurgicale antérieure peut apprendre la technique. La formation a commencé par apprendre à effectuer les sutures interrompues simples analogues à ceux utilisés dans l'anastomose en utilisant 8-0 suture en nylon. Les sutures ont été réalisées pour fermer une incision faite dans un glo de latexve. Après BM a pu placer efficacement sutures à travers le gant sans se déchirer, ils ont observé trois procédures complètes avant de tenter un. Après la première procédure a été terminée, ils ont observé ensuite une autre procédure et tenté à deux autres. Parmi les trois animaux terminés, les deux derniers sont allés pour survivre et prospérer. Le premier animal a été euthanasié en raison de complications à l'anastomose.
Figure 1. Stades de résection iléo-colique et anastomose. (A) Ileocecal région de l'intestin délivré de l'abdomen. Les flèches noires indiquent les navires à ligaturer, lignes pointillées indiquent les points de transection pour côlon et de l'iléon terminal. (B) de la région Ileocecal enlevé, extrémités coupées de l'intestin sont alignés, reste l'approvisionnement en sang est démontrée par des flèches noires. (C) complété des anas iléocoliquestomosis. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Les poids des animaux au départ, jour post-opératoire et 14 post-opératoire jour 28. Aucun changement significatif de poids ont été observées après l'intervention tel que déterminé par le test statistique de Mann-Whitney U. ICR (groupe de résection iléo-colique), de contrôle (contrôles non-opératoires).
Figure 3. Représentant chemin de sutures à travers les tissus intestinaux. H & E colorées coupes histologiques de l'iléon (à droite) et du côlon (à gauche) sont alignés pour démontrer la trajectoire du NE de sutureEdle à travers les tissus (ligne pointillée) à partir du point (a) par le point (b). Le nœud doit être lié au point (c). Notez que moins muqueuse est inclus dans l'anastomose que les autres tissus. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La souris ICR est un modèle puissant qui peut être utilisé pour étudier les effets de la chirurgie dans les maladies de l'intestin. Cet article décrit un procédé de réalisation IC chez la souris avec un taux de réussite de 95% et pas de problèmes avec un retard de croissance, comme en témoigne poids stables jusqu'à 28 jours après l'intervention. Les défis les plus importants de la réussite ICR notamment d'éviter obstructions intestinales à l'anastomose et les fuites anastomotiques.
Les éléments techniques à la chirurgie pour prévenir l'obstruction visent à maximiser diamètre lumière à l'anastomose. Spatulation de l'iléon au point de sectionnement augmente le diamètre de la lumière en divisant l'intestin à un angle de 30 degrés, comme représenté sur la figure 1A. Lorsque vous prenez les piqûres de tissu intestinal avec l'aiguille de suture, il est essentiel de dérouler les bords de l'intestin et de passer l'aiguille d'environ 0,5 mm de l'arête de coupe. Trop grandes bouchées de tissus rétrécissent la lumière. Une option AVoid rétrécissement luminal lors de la construction de l'anastomose consiste à employer l'utilisation d'un stent, comme décrit par digestible Kiernan et al., 15. Les aspects non-techniques pour éviter l'obstruction comprennent la sélection d'un assez petit suture 4 et évitant contenu luminal encombrants par l'alimentation des animaux une alimentation liquide un jour avant la chirurgie et 2 jours après la chirurgie.
La deuxième cause la plus fréquente de mortalité post-opératoire est anastomotique fuite. Éviter cette complication exige le strict respect des principes de l'anastomose intestinale. L'approvisionnement en sang adéquat premier être. Après les vaisseaux alimentant le sang de la région de l'intestin étant résection ont été ligaturé, l'intestin doit être inspecté visuellement avant sectionnement. Le segment de l'intestin ischémique apparaît sombre; ce doit être complètement retiré, laissant les bords sains. Il est important de visualiser une petite quantité de sang à partir des bords de l'intestin restant coupées. Un anas étanche à l'eautomosis est également essentiel pour éviter les fuites de contenu luminal conduisant à une septicémie. Ceci est réalisé en évitant les grands écarts entre les fils de suture, et faire en sorte que toutes les couches de l'intestin sont inclus dans la maille (Figure 3). Force de la plaie est fortement diminuée dans les deux premiers jours post-opératoires, les sutures ainsi bien placés sont essentiels pour fournir la force 16,17. Un écueil potentiel est par inadvertance inclut seulement la muqueuse comme la muqueuse peut froncer de la lumière du côlon sectionné. Ceci peut être évité par la visualisation de l'arête de coupe de la séreuse et muqueuse en réduisant doucement prolapsus arrière dans la lumière avec une pince.
Contrôles chirurgicales Sham doivent être pris en compte dans la conception expérimentale des études utilisant le modèle IC pour contrôler les effets de confusion potentiels du stress chirurgical, manipulation intestinale, et / ou la perte de la valvule iléo-colique. Le choix de simulacre de procédure dépendra de la question principale posée dansl'étude. Par exemple, si l'objectif de la recherche est d'évaluer la réponse de l'hôte après avoir perdu la valvule iléo-colique, alors il serait prudent d'inclure un groupe intervention chirurgicale fictive dans laquelle une anastomose intestinale est effectuée tout en laissant la valvule iléo-colique en place. Cela se fait habituellement par sectionnant l'intestin grêle sans résection effectuer ensuite une petite anastomose de l'intestin de la même façon que l'anastomose iléo-colique 7,11. Cela permettra aux enquêteurs de commenter spécifiquement sur les effets de la perte de valve iléo-colique en contrôlant les effets de l'anastomose intestinale. En revanche, si l'objectif est seulement d'étudier les effets de la résection intestinale avec anastomose sans commenter spécifiquement sur la perte de la valvule iléo-colique, puis une intervention chirurgicale fictive devrait inclure une laparotomie, et l'intestin doit être traité comme il le ferait pour IC, mais sans sectionnement et anastomose. Ce serait pour contrôler le stress chirurgical et manipulation intestinale. Les techniques décrites dansle protocole ci-dessus peut être facilement adapté pour effectuer les procédures de faux.
Ce protocole décrit une résection iléo-colique, qui supprime 1,5-2 cm de l'iléon terminal et l'intégralité du caecum, et reproduit fidèlement une opération fréquemment réalisée chez des patients atteints de la maladie de Crohn iléo-colique. Des procédures similaires ont été utilisés dans la IL-10 - modèle de colite après quoi souris ont développé une inflammation spontanée et de la fibrose dans le petit intestin analogue à la maladie de Crohn récurrence 7,11 - /. Les principes de cette procédure peuvent également demander à d'autres modèles de la maladie. En supprimant 50% de l'intestin grêle avec anastomose iléo-colique, des modèles de souris ont été utilisés pour étudier la réponse de croissance dans le syndrome intestinal d'adaptation à court intestin 4-6. Dans l'avenir, ce peut aussi devenir un modèle utile pour étudier les effets systémiques et locaux de la chirurgie dans le cancer colorectal.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
- Hallet, J., Zih, F. S., Lemke, M., Milot, L., Smith, A. J., Wong, C. S. Neo-adjuvant chemoradiotherapy and multivisceral resection to optimize R0 resection of locally recurrent adherent colon cancer. European Journal of Surgical Oncology. 40 (6), (2014).
- Rutgeerts, P., Geboes, K., Vantrappen, G. Natural history of recurrent Crohn's disease at the ileocolonic anastomosis after curative surgery. Gut. 25 (6), 665-672 (1984).
- Davis, D., Rivadeneira, D. Complications of colorectal anastomoses: leaks, strictures, and bleeding. The Surgical clinics of North America. 93 (1), 61-87 (2013).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Dekaney, C. M., Fong, J. J., Rigby, R. J., Lund, P. K., Henning, S. J., Helmrath, M. A. Expansion of intestinal stem cells associated with long-term adaptation following ileocecal resection in mice. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 293 (5), (2007).
- Speck, K. E., De Cruz, P., et al. Inflammation enhances resection-induced intestinal adaptive growth in IL-10 null mice. The Journal of surgical research. 168 (1), 62-69 (2011).
- Rigby, R. J., Hunt, M. R., et al. A new animal model of postsurgical bowel inflammation and fibrosis: the effect of commensal microflora. Gut. 58 (8), 1104-1112 (2009).
- Kostic, A. D., Xavier, R. J., Gevers, D. The Microbiome in Inflammatory Bowel Disease: Current Status and the Future Ahead. Gastroenterology. , 1-11 (2014).
- Gevers, D., Kugathasan, S., et al. The Treatment-Naive Microbiome in New-Onset Crohn's Disease. Cell host & microbe. 15 (3), 382-392 (2014).
- Ahmed, T., Rieder, F., Fiocchi, C., Achkar, J. P. Pathogenesis of postoperative recurrence in Crohn's disease. Gut. 60 (4), 553-562 (2011).
- Borowiec, A., Sydora, B., et al. Small bowel fibrosis and systemic inflammatory response after ileocolonic anastomosis in IL-10 null mice. Journal of Surgical Research. 178 (1), 147-154 (2012).
- Devine, A. A., Gonzalez, A., et al. Impact of Ileocecal Resection and Concomitant Antibiotics on the Microbiome of the Murine Jejunum and Colon. 8 (8), (2013).
- Bij, G. J., Oosterling, S. J., Beelen, R. H. J., Meijer, S., Coffey, J. C., van Egmond, M. The perioperative period is an underutilized window of therapeutic opportunity in patients with colorectal cancer. Annals of surgery. 249 (5), (2009).
- Scott, A. D., Uff, C., Phillips, R. K. Suppression of macrophage function by suture materials and anastomotic recurrence of Crohn's disease. The British journal of surgery. 80 (3), (1993).
- Kiernan, J. A. Intestinal anastomosis in the rat facilitated by a rapidly digested internal splint and indigestible but absorbable sutures. Journal of Surgical Research. 45, 427-431 (1988).
- Andersen, T. L., et al. Action of matrix metalloproteinases at restricted sites in colon anastomosis repair: an immunohistochemical and biochemical study. Surgery. 140 (1), 72-82 (2006).
- Thompson, S. K., Chang, E. Y., Jobe, B. A. Clinical review: Healing in gastrointestinal anastomoses, Part I. Microsurgery. 26 (3), 131-136 (2006).
