Protocol
Tiernutzung Protokolle wurden von der Health Science Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Universität von Alberta genehmigt.
1. Herstellung der Instrumente, Tiere und Operative-Setup
- Übertragen Tieren zu einem neuen, sauberen Käfig abwesend aller feste Nahrung 24 Stunden vor dem Eingriff. Sie können den freien Zugang zu Wasser und flüssige Diät ad lib bis zum Zeitpunkt des Verfahrens.
- Autoklav alle für das Verfahren erforderlichen Instrumente. Saubere Arbeitsfläche und Narkosenasenkegel mit 70% Ethanol.
- Richten Sie die Arbeitsfläche mit Operationsmikroskop, Narkosegerät und Zubehör in einer Weise, die angenehm für den Operateur ist. Die Ellenbogen des Chirurgen sollte erlaubt werden, um bequem auf dem OP-Tisch liegen, mit Händen und Armen unbehindert durch Ausrüstung. Instrumente, Nahtmaterial, Wattestäbchen und eine 10-ml-Spritze sollte an einem Ort, die einen einfachen Zugang während des Verfahrens ermöglicht platziert werden.
- EinrichtenOverhead-Wärmelampen, sowohl Wärme für das Tier während des Verfahrens und Licht für die Arbeitsfläche bereitzustellen.
- Füllen Sie eine 50 ml konischen Röhrchen mit 0,9% Kochsalzlösung und eine 1,5-ml-Röhrchen mit Vaseline und Ort in der Nähe der Arbeitsfläche.
HINWEIS: Sterilisieren alle Instrumente und OP-Bedarf. Da der Darm durchtrennt, ist das Verfahren selbst nicht steril. Es wird als Rein verunreinigt. Ergreifen Sie Maßnahmen, um die Einführung von exogenen Quellen von Infektionen zu vermeiden.
2. Ileocolische Resektion mit Anastomose
- Anästhesie zu induzieren durch Verabreichen von 4% Isofluran mit einer Sauerstofffließgeschwindigkeit von 2 L / min über Nasenkegel von der Isofluran-Verdampfer, bis die Tiere Atmungsrate verlangsamt etwa 30-40 Atemzüge / min. Mit mäßigem Druck auf den Hinterfuß der Maus, um sicherzustellen, gibt es keine Schmerzreaktion vor der Einleitung des Verfahrens. An dieser Stelle, drehen Sie Isofluran bis 2% und Sauerstofffluss auf 0,5 l / min. IntermittierendCheck Schmerzreaktion während des Verfahrens und stellen Isofluran Flussrate entsprechend.
- Vaseline in die Augen, um das Trocknen während der Operation zu verhindern und zu immobilisieren die Maus in die Rückenlage mit Gliedmaßen mit durchsichtigem Klebeband gesichert.
- Reinigen Sie den Bauch mit povodine / Jodlösung, und wechseln Sie in neue sterile Handschuhe.
- Machen Sie eine 1,5 cm Hautschnitt in der oberen Mittellinie des Bauches mit scharfen Punkt Dissektionsscheren die Faszien und Peritoneum aussetzen. Öffnen Sie die Faszien / Bauchfellschicht in ähnlicher Weise durch die Linea alba in die Bauch Inhalten aussetzen.
- Im Gegensatz zum Menschen, wird die Maus Blinddarm typischerweise im linken oberen Quadranten des Abdomens. Einmal identifiziert, sanft erfassen die Blinddarm mit einer Pinzette und bringt sie durch den Schnitt. Verwenden feuchten Wattetupfer auffächern etwa 3 cm von terminalen Ileum, der sich vom Blinddarm über eine sterile Gaze auf der Bauchfläche (1A) drapiert.Sicherzustellen, dass die freiliegenden Darm während der Gesamtheit des Verfahrens feucht mit 0,9% Kochsalzlösung aufbewahrt.
- Identifizieren Sie die ileozökalen Arterie abzweigt A. mesenterica superior entlang des Dickdarms (1A) mit dem Operationsmikroskop. Präparieren Sie sich die avaskuläre Gewebe neben dem ileozökalen Arterie, einzukreisen und zu ligieren die Arterie mit einem 5-0 Seidenkrawatte. Nächstes den regionalen Blutversorgung des terminalen Ileum und wählen Sie eine Durchtrennung Punkt 1,5-2 cm proximal der ileozökalen Kreuzung. Ligieren die Zweige zu diesem Abschnitt des Ileum wie oben. Teilen Sie die Arterien mit Mikro Dissektionsscheren.
- Teilen Sie die ischämische Bereiche des Ileum und Colon gewährleisten eine ausreichende Blutzufuhr zu den durchtrennten Enden (Abbildung 1B). Es ist oft hilfreich, um die Ileum durch Teilung in einem 30 Grad Winkel, um den Durchmesser des Lumens zu erhöhen, damit es den Dickdarm eher entspricht spatelförmig. Sobald der ileozökalen Teil Darm entfernt wurde, ausrichtentrennten Enden des Ileum und Colon auf die Gaze, die Gewährleistung der mesenterialen Grenzen jeweils ausgerichtet sind.
- Konstruieren Sie die Anastomose durch Annähern der durchtrennten Ende Ileum zum durchtrennten Ende Dick Verwendung unterbrochen 8-0 Polypropylen Nähte (Abbildung 1c). Der erste Stich wird an der mesenterialen Rand platziert, mit anschließender Nähte platziert alle 0,5 mm, bis die Ileocolische Anastomose wasserdicht ist. Beim Passieren der Nähnadel durch das Ileum und Kolon, sicherzustellen, dass die Schnittkante nicht gerollt wird, und die Nadelstiche sind 0,5 mm von den Schnittkanten des Darms. Eine typische Anastomose erfordert 14 bis 16 Einzelnähten. Testen Sie die Integrität und die Durchgängigkeit der Anastomose nach Fertigstellung durch Walzen ein Wattestäbchen proximal nach distal über das Ileum, Inhalte durch die Anastomose zu erzwingen. Dünndarminhalt sollte sich frei in den Dickdarm, ohne Anastomoseninsuffizienz geben.
- Spülung des belichteten Darm mit 3-4 ml 0,9% iger Kochsalzlösung aus der 10 ml Spritzevon der Oberfläche des Darms abzuwaschen Stuhl, und liefern Darm wieder in die Bauchhöhle. Mit 2 ml 0,9% Kochsalzlösung spülen Bauchhöhle, und dann abtropfen lassen diese Flüssigkeit durch leichten Druck auf die Bauchwand seitlich.
- Schließen Sie den Schnitt mit einem 3-0 Seidenfortlaufende Naht, und die Strömung von Isofluran einzustellen. Verwalten 0,1 mg / kg des lang wirkenden Opiat -buprenorphine- subkutan zur postoperativen Schmerzkontrolle.
- Beachten Sie die Tiere unter der Wärmelampe, bis sie sind mobil übertragen sie dann auf eine kontinuierlich erwärmt Käfig.
3. Postoperative Pflege und Überwachung
- Überwachung Tiere in einem kontinuierlich erwärmt Käfig für Anzeichen von Leiden für den Rest des Tages. Übertragen Tiere zurück in die Tierstation in einer neuen sterilen Käfig mit Zugang zu flüssigen Nahrung und Wasser ad lib. Die Tiere können in Gruppen von 3-4 untergebracht werden.
- Führen Sie eine Überprüfung der postoperativen Tiere am nächsten Morgen,sicherzustellen, dass die Tiere nicht in der Not erscheinen. Feed-nur flüssige Nahrung. Wenn sie unbequem (dh gekrümmte Haltung oder minimale Aktivität) erscheinen zu verwalten eine zusätzliche Dosis von subkutan Buprenorphin. Überprüfen Sie auf die Tiere noch einmal am Nachmittag am postoperativen Tag 1.
- Am Morgen des postoperativen Tag 2 sollte die Tiere vollständig erholt erscheinen. Der Nachweis der Lebensmittelkonsum und stooling sind positive Anzeichen für eine Erholung. Nun, wieder eine solide Chow-Diät für die Tiere.
HINWEIS: Anzeichen von Leiden sind gekrümmte Haltung, schlechte Pflege und minimale Aktivität. Wenn Anzeichen von Leiden sind prominente sollten die Tiere eingeschläfert werden. - Euthanize die Tiere durch Induktion tiefe Narkose mit 4% Isofluran in einem O 2 Strömungsgeschwindigkeit von 2 L / min, bis Tiere reagieren nicht auf Fußdruck. Führen Genickbruch, und beobachten Sie auf Anzeichen von richtigen Euthanasie.
- Richtlinien variieren, so finden Sie in den Institutionen Empfehlungen für Indikationenfür und geeignete Methoden der Euthanasie bei Mäusen.
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Representative Results
Sterblichkeit und Gewichtsveränderung nach der OP.
Die Sterblichkeitsraten folgenden ICR in 129S1 Wildtyp-Mäusen in der Regel ~ 5%. Die häufigste Ursache der Moral ist Darmverschluss an der Anastomose. Andere Todesursachen gehören Anastomoseninsuffizienz und interne Hernie, die zu Verstopfung Darm.
Gewichtsverlust kann bis zu 14 Tage nach der Operation zu sehen ist, ist jedoch im allgemeinen nicht signifikant. Mäuse sind in der Regel präoperativen Gewicht komplett wieder von postoperativen Tag 28 (Abbildung 2).
Übertragbarkeit der Technik
Ein neuer Student (BM) wurde gelehrt, die ICR Verfahren ausführen, um festzustellen, ob ein Betreiber ohne vorherige chirurgische Ausbildung könnte die Technik zu erlernen. Ausbildung begann mit dem Lernen, wie man die Einzelknopfnähten analog zu den in der Anastomose mit 8-0 Nylonnaht verwendet zuführen. Nähte wurden durchgeführt, um einen Einschnitt in einem Latex glo gemacht schließenve. Nachdem BM Lage, effizient zu platzieren Nähte durch den Handschuh, ohne zu reißen, beobachteten sie drei komplette Verfahren vor dem Versuch ein. Nachdem das erste Verfahren abgeschlossen war, sie dann beobachtet ein anderes Verfahren und versuchte zwei weitere. Von den drei Versuchstieren durchgeführt, die letzten beiden ging, um zu überleben und zu gedeihen. Das erste Tier wurde aufgrund von Komplikationen bei der Anastomose euthanasiert.
Abbildung 1. Die Stufen der Ileocolische Resektion und Anastomose. (A) Ileozökalgegend Darm von Bauch geliefert. Schwarze Pfeile zeigen Gefäße ligiert werden, gestrichelten Linien zeigen Trennung Punkte für Doppelpunkt und terminalen Ileum. (B) Ileozökalgegend entfernt wird, werden Schnittenden Darmausgerichtet sind, den restlichen Blutversorgung wird durch schwarze Pfeile demonstriert. (C) Abgeschlossene Ileocolische Anastomosis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Tiergewichte an der Grundlinie, postoperativen Tag 14 und postoperativen Tag 28 keine signifikanten Veränderungen der Gewichte wurden nach dem Eingriff beobachtet, wie durch den Mann-Whitney-U statistische Tests bestimmt. ICR (Ileocolische Resektion-Gruppe), Control (Nichtoperative Kontrollen).
Abbildung 3. Repräsentative Weg der Nähte durch Darmgewebe. H & E gefärbten histologischen Schnitten von Ileum (rechts) und Doppelpunkt (links) aufgereiht sind, die Flugbahn des Fadens ne demonstrierenEdle durch die Gewebe (gestrichelte Linie) ab Punkt (a) bis zum Punkt (b). Der Knoten sollte am Punkt (c) angebunden werden. Beachten Sie, dass weniger Schleimhaut in der Anastomose als andere Gewebe enthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die murine ICR ist ein leistungsfähiges Modell, das verwendet werden kann, um die Auswirkungen der Operation bei Darmerkrankungen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Durchführung ICR bei Mäusen mit einer Erfolgsquote von 95% und keine Probleme mit Gedeihstörungen wie durch stabile Gewichte reflektiert bis zu 28 Tage nach dem Eingriff. Die wichtigsten Herausforderungen für die erfolgreiche ICR gehören die Vermeidung Darm Hindernisse an der Anastomose und Anastomosen Lecks.
Technische Elemente der Operation zur Verhinderung Behinderung sind auf die Maximierung Lumendurchmesser an der Anastomose ab. Spateln des Ileums im Trennung Punkt erhöht den Lumendurchmesser, indem man den Darm in einer wie in Figur 1A dargestellten Winkel von 30 Grad. Bei der Aufnahme Bisse von Darmgewebe mit der Nähnadel, ist es unerlässlich, um die Ränder des Darms entrollen und übergeben Sie die Nadel etwa 0,5 mm von der Schnittkante. Zu große Bissen von Gewebe wird das Lumen einzugrenzen. Eine Option auf AVoid Lumeneinengung bei der Konstruktion der Anastomose ist, die Verwendung eines verdaulichen Stent einzusetzen, wie durch Kiernan et al. 15 beschrieben. Nicht-technische Aspekte der Obstruktion zu vermeiden, umfassen die Auswahl einer ausreichend kleinen Naht 4 und die Vermeidung von sperrigen Lumeninhalt durch die Fütterung von Tieren eine flüssige Diät einen Tag vor der Operation und 2 Tage nach der Operation.
Die zweithäufigste Ursache für postoperative Mortalität ist Anastomoseninsuffizienz. Die Vermeidung dieser Komplikation erfordert die strikte Einhaltung der Grundsätze der Darmanastomose. Die erste ist eine ausreichende Blutversorgung. Nachdem die Gefäße Blut zum Bereich des Darms ist reseziert wurden ligiert, sollte das Darm visuell inspiziert vor Durchtrennung werden. Der ischämische Darmabschnitt wird düster erscheinen; dies sollte vollständig entfernt werden, wobei gesunde Kanten. Es ist wichtig, eine kleine Menge von Blutungen aus den Schnittkanten des verbleibenden Darms sichtbar zu machen. Eine wasserdichte Anastomosis ist auch wichtig, um das Auslaufen von luminalen Inhalte, die zu Sepsis zu vermeiden. Dies wird durch die Vermeidung von großen Lücken zwischen den Fäden, und sicherzustellen, dass alle Schichten des Darms im Stich enthalten (Figur 3) erreicht. Wundfestigkeit wird enorm in den ersten beiden postoperativen Tag vermindert, sind also richtig platziert Nähte wichtig, Stärke 16,17 bereitzustellen. Eine potenzielle Gefahr versehentlich nur einschließlich der Schleimhaut wie die Schleimhaut kann aus dem Lumen des Dickdarms durchtrennt verziehen. Dies kann durch Visualisierung der Schnittkante der Serosa und sanft reduziert prolapsed Schleimhaut wieder in das Lumen mit einer Pinzette zu vermeiden.
Operativen Scheinkontrollen sollten in den experimentellen Studiendesign mit der ICR-Modell für die möglichen Verwechslung Wirkungen von chirurgischen Streß, Darm Manipulation und / oder Verlust der lleozökalklappe Steuerung berücksichtigt werden. Die Wahl des Schein-Verfahren wird auf der primären Frage abhängt, die in gefragtdie Studium. Zum Beispiel, wenn das Forschungsziel ist es, die Wirtsreaktion nach dem Verlust der lleozökalklappe bewerten, dann wäre es klug, eine Schein-OP-Gruppe, in der ein Darmanastomose durchgeführt, während die lleozökalklappe anstelle gehören. Dies wird typischerweise durch Durchschneiden in den Dünndarm ohne Resektion dann Durchführen einer Anastomose des Dünndarms in der gleichen Weise wie die Ileocolische Anastomose 7,11 geführt. Dies würde es Forschern, spezifisch auf die Auswirkungen der lleozökalklappe Verlust durch Steuern der Auswirkungen von Darmanastomose kommentieren. Alternativ, wenn das Ziel ist nur, die Auswirkungen der Darmresektion und Anastomose ohne zu kommentieren speziell auf Verlust des lleozökalklappe studieren, dann eine Scheinoperation sollte eine Laparotomie gehören, und der Darm sollte wie es für ICR behandelt werden, aber ohne Durchtrennung und Anastomose. Dies würde für die chirurgische Stress und Darmmanipulation steuern. Die im beschriebenen Verfahrenkann das Protokoll über leicht zur Durchführung Scheinverfahren angepasst werden.
Dieses Protokoll beschreibt eine Ileocolische Resektion, die 1,5-2 cm terminalen Ileum und die Gesamtheit der Blinddarm entfernt, und imitiert eine Operation häufig bei Patienten mit Ileocolische Morbus Crohn durchgeführt. / - - Colitis-Modell, nach dem Mäuse entwickelten spontane Entzündung und Fibrose im Dünndarm analog zu Morbus Crohn Rezidiv 7,11 Ähnliche Verfahren wurden in der IL-10 verwendet. Die Prinzipien dieses Verfahrens kann auch auf andere Krankheitsmodelle anzuwenden. Durch Entfernen von 50% des Dünndarms mit Ileocolische Anastomose wurden Mausmodelle wurden verwendet, um die adaptive Darmwachstumsantwort in Kurzdarmsyndrom 4-6 untersucht. In der Zukunft kann dies auch ein nützliches Modell für die Untersuchung der systemischen und lokalen Auswirkungen der Chirurgie bei Darmkrebs zu werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
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