Protocol
פרוטוקולי שימוש בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה למדעי בריאות טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אלברטה.
1. הכנת מכשירים, בעלי חיים והגדרה אופרטיבית
- העבר את החיות לנעדרו חדש, נקי כלוב של כל שעה המוצקה מזון 24 לפני ההליך. אולי יש להם גישה חופשית למים, וכופתות דיאטת נוזלים עד למועד ההליך.
- החיטוי כל המכשירים דרושים להליך. משטח נקי הפעלה וחרטומו הרדמה עם 70% אתנול.
- הגדר את משטח ההפעלה עם מיקרוסקופ, מכונה הרדמה וציוד באופן שנוח לי מנתח ההפעלה. מרפקיו של המנתח צריכים להיות מותר לנוח בנוחות על שולחן הניתוחים, עם ידיים והזרועות בלא הפרעה על ידי ציוד. מכשירים, תפרים, צמר גפן, ומזרק 10 מיליליטר צריכים להיות ממוקמים במיקום המאפשר גישה נוחה במהלך ההליך.
- הגדר אתמנורות חימום מעליו כדי לספק חום לבעלי החיים במהלך ההליך והאור למשטח ההפעלה.
- מלא שפופרת 50 מיליליטר חרוטי עם מי מלח 0.9%, וצינור 1.5 מיליליטר עם וזלין ומקום קרוב לפני השטח התפעולי.
הערה: לעקר את כל המכשירים וציוד ניתוחי. בגלל המעי transected, ההליך עצמו הוא לא סטרילי. זה נחשב מזוהם נקי. לנקוט בצעדים כדי למנוע את כניסתה של מקורות אקסוגני של זיהום.
2. Ileocolic כריתה עם ההשקה
- לגרום להרדמה על ידי מתן isoflurane 4% עם קצב זרימת חמצן של 2 ליטר / דקה באמצעות חרטומו מאידוי isoflurane עד קצב הנשימה בעלי החיים מאט לכ 30-40 נשימות / דקה. הפעל לחץ מתון לרגלו האחורית של העכבר כדי להבטיח שאין תגובת כאב לפני שתזם את ההליך. בשלב זה, לדחות את isoflurane עד 2% וזרימת חמצן 0.5 ליטר / דקה. לסירוגיןלבדוק את תגובת כאב במהלך ההליך ולהתאים קצב זרימת isoflurane בהתאם.
- החל זלין על העיניים כדי למנוע התייבשות במהלך ניתוח, ולשתק את העכבר במצב שכיבה עם גפיים מאובטחים באמצעות סרט שקוף.
- לנקות את הבטן עם פתרון povodine / יוד, ולשנות לכפפות סטריליות חדשות.
- לעשות חתך בעור 1.5 סנטימטרים בקו האמצע העליון של הבטן באמצעות נקודה חדה לנתח מספריים כדי לחשוף את fascia והצפק. פתח את שכבת fascial / הצפק באופן דומה באמצעות alba linea לחשוף את התוכן של הצפק.
- בניגוד לבני אדם, cecum העכבר הוא נמצאה בדרך כלל ברבע העליון השמאלי של הבטן. ברגע שזיהה, בעדינות לתפוס את cecum עם מלקחיים ויעביר אותו דרך החתך. השתמש בצמר גפן טבולה להתפרש כ 3 סנטימטר של מעי מסוף המשתרע מcecum על גזה סטרילית שנפרשה על פני הבטן (איור 1 א).ודא המעי החשוף הוא כל הזמן לח עם מי מלח 0.9% במהלך המכלול של ההליך.
- זהה את עורק ileocecal מתפצלים עורק mesenteric מעולה לאורך המעי הגס (איור 1 א) באמצעות מיקרוסקופ. לנתח את רקמות avascular הסמוכות לעורק ileocecal, להקיף ולקשור את העורק עם עניבת משי 5-0. בשלב הבא, לאתר את אספקת הדם האזורית למעי סופני ולבחור הפרוקסימלי סנטימטר 1.5-2 נקודת חיתוך רוחב לצומת ileocecal. ולקשור את הענפים לחלק זה של מעי כאמור לעיל. מחלקים את העורקים עם מיקרו לנתח מספריים.
- מחלקים את מנות איסכמי של מעי ומעי גס הבטחה יש אספקת דם מספקת לקצות transected (איור 1). זה בדרך כלל מועיל למרית המעי על ידי חלוקתו בזווית של 30 מעלות כדי להגדיל את הקוטר של לומן כך שיתאים למעי גס באופן הדוק יותר. לאחר חלק ileocecal של מעי הוסר, ליישרקצות transected של מעי ובמעי גס בגזה, הבטחת גבולות mesenteric של כל מיושרים.
- לבנות את ההשקה על ידי קירוב סוף transected של מעי עד סוף transected של מעי גס באמצעות נקטע 8-0 תפרי פוליפרופילן (איור 1 ג '). התפר הראשון ממוקם בגבול mesenteric, עם תפרים שלאחר מכן הוצבו למ"מ 0.5 עד ההשקה Ileocolic היא אטומה למים. כאשר עוברים את מחט התפר דרך המעי והמעי הגס, לוודא שהקצה לחתוך לא התגלגל, ועקיצות מחט 0.5 מ"מ מקצות החתך של המעי. השקה טיפוסית תדרוש 14-16 תפרים נקטעו. בדוק את השלמות וpatency של ההשקה עם השלמה על ידי גלגול הפרוקסימלי מקלון צמר גפן לדיסטלי על המעי לכפות תכנים באמצעות ההשקה. תוכן מעי דק צריך לעבור בחופשיות לתוך המעי הגס ללא דליפה בהשקה.
- יש לשטוף את המעי החשוף עם 3-4 מיליליטר של תמיסת מלח 0.9% מהמזרק 10 מיליליטרכדי לשטוף את הצואה מפני שטח של המעי, ולספק מעי בחזרה לתוך חלל הצפק. באמצעות 2 מיליליטר של תמיסת מלח 0.9% לשטוף את חלל הצפק, ולאחר מכן ניקוז נוזל זה על ידי הפעלת לחץ עדין על דופן הבטן רוחבית.
- סגירת החתך עם תפר ריצת 3-0 משי, ולהפסיק את זרימת isoflurane. נהל 0.1 מ"ג / קילוגרם של האופיום הארוך טווח -buprenorphine- תת-עורית לשליטה בכאב שלאחר ניתוח.
- שים לב לבעלי החיים תחת מנורת החום עד שהם ניידים ולאחר מכן להעביר אותם לכלוב חימם ללא הרף.
טיפול וניטור 3. לאחר ניתוח
- צג חיות בכלוב מחומם ללא הרף לסימני מצוקה לשארית היום. העבר את החיות בחזרה למתקן הטיפול בבעלי החיים בכלוב סטרילי חדש גישה לדיאטה נוזלית וכופתות מים. בעלי חיים עשויים להיות מאוחסנים בקבוצות של 3-4.
- לבצע בדיקה על בעלי החיים שלאחר הניתוח למחרת בבוקר,להבטיח את בעלי החיים אינם מופיעים במצוקה. להאכיל את דיאטת נוזלים בלבד. אם הם מופיעים (, יציבה כלומר כפוף או פעילות מינימאלית) שלא בנוח לנהל מנה נוספת של עצירות תת עורי. בדוק על בעלי החיים פעם נוספים בשעתי אחר הצהריים ביום שלאחר ניתוח 1.
- בבוקרו של יום שלאחר ניתוח 2 בעלי החיים אמורים להופיע התאוששו לחלוטין. עדות לצריכת מזון וstooling סימנים חיוביים של התאוששות. עכשיו, לחדש את דיאטת אוכל מוצקה לבעלי החיים.
הערה: סימנים של מצוקה כוללים יציבה כפופה, הזנחה עצמית, ופעילות מינימאלית. אם סימני המצוקה בולטים צריכים להיות מורדמים בעלי החיים. - להרדים את בעלי החיים על ידי גרימת הרדמה עמוקה עם isoflurane 4% בקצב זרימת O 2 של 2 ליטר / דקה עד בעלי חיים אינם מגיב ללחץ ברגל. בצע נקע בצוואר הרחם, ולבחון סימנים של euthanization הנכון.
- הנחיות משתנות, כך מתייחסות להמלצות גופים המוסדיות בדבר אינדיקציותולשיטות של euthanization בעכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיעורי תמותה ושינוי במשקל לאחר ניתוח.
שיעורי תמותה לאחר ICR בעכברים מסוג בר 129S1 הם בדרך כלל ~ 5%. הסיבה השכיחה ביותר למוסר היא חסימת מעי בהשקה. סיבות נוספות של תמותה כוללות דליפה בהשקה ובקע פנימי המוביל למעי חסימה.
ירידה במשקל שניתן לראות עד 14 ימים לאחר ניתוח, אבל הוא בדרך כלל לא משמעותי. עכברים נוטים להחזיר את משקל טרום ניתוחי לחלוטין ביום 28 שבלאחר הניתוח (איור 2).
עבירות טכניקה
תלמיד חדש לתואר שני (BM) לימד לבצע את הליך ICR כדי לקבוע אם מפעיל ללא הכשרה כירורגית קודמת יכול ללמוד את הטכניקה. אימון החל בלימוד כיצד לבצע את תפרי קטע אחד דומה לאלה ששימשו בהשקה באמצעות 8-0 תפר ניילון. תפרים בוצעו כדי לסגור חתך שנעשה על פני Glo לטקסve. לאחר BM הצליח למקם ביעילות תפרים באמצעות הכפפה מבלי לקרוע, הם הבחינו בשלושה נהלים מלאים לפני שתנסה אחת. לאחר ההליך הראשון הושלם, אז הם נצפו הליך אחר וניסו עוד שתיים. של השלושה בעלי החיים הושלמו, שני האחרונים המשיכו לשרוד ולשגשג. בעלי החיים הראשונים היה מורדמים בשל סיבוכים בהשקה.
איור 1. שלבי כריתה וההשקה ileocolic. (א) אזור ileocecal של מעי נמסר מבטן. חיצים שחורים מצביעים על כלי שיט ligated, קווים מקווקווים מציינים נקודות חיתוך רוחב למעי גס ובמעי עקום מסוף. אזור ileocecal הוסר (ב '), קצות חתך של מעי מיושרים, אספקת דם שנותר באה לידי ביטוי בחצים שחורים. (ג) שהושלמה אנאס ileocolictomosis. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. משקולות בעלי חיים בתחילת המחקר, יום שלאחר ניתוח 14 ולאחר הניתוח ביום 28. לא נצפתה שינויים משמעותיים במשקלות נצפו לאחר הליך כפי שנקבע על ידי המבחן הסטטיסטי Mann-Whitney U. ICR (קבוצת כריתת Ileocolic), בקרה (בקרה ללא ניתוח).
איור 3. נתיב נציג של תפרים דרך רקמות מעיים. H & E מוכתמת סעיפים היסטולוגית של מעי (מימין) ומעי גס (משמאל) בשורה למעלה כדי להדגים את המסלול של ne התפרedle דרך הרקמות (קו מקווקו) מתחילות בנקודה (א) עד לנקודה (ב). הקשר צריך להיות קשור בנקודה (ג). שים לב שפחות רירית כלולה בהשקה מאשר רקמות אחרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ICR העכברי הוא מודל רב עוצמה שיכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של ניתוח במחלות מעי. מאמר זה מתאר שיטה לביצוע ICR בעכברים עם שיעור הצלחה של 95% ואין בעיות עם כישלון בשגשוג כפי שמשתקף במשקל יציב עד 28 ימים לאחר הליך. האתגרים המשמעותיים ביותר לICR המוצלח כוללים הימנעות ממכשולי מעי בהשקה ודליפות בהשקה.
אלמנטים טכניים לניתוח למניעת חסימה נועדו למקסם את קוטר לומן בהשקה. Spatulation של המעי בנקודת חיתוך רוחב מגדיל את קוטר לומן על ידי חלוקת המעי בזווית של 30 מעלות כמתואר באיור 1 א. כאשר נגס ברקמת מעי עם מחט התפר, זה חיוני כדי לפרוש את הקצוות של המעי ולהעביר את המחט כ -0.5 מ"מ מהקצה לחתוך. יתר על עקיצות גדולות של רקמה תצמצמנה את לומן. אפשרות באבצמצום luminal OID בעת בניית ההשקה היא להעסיק את השימוש בסטנט לעיכול כפי שתואר על ידי קירנן et al. 15. היבטים שאינם טכניים כדי להימנע מחסימה כוללים בחירת תפר קטן מספיק 4 והימנעות תוכן luminal מגושם על ידי האכלת בעלי חיים דיאטת נוזלי יום אחד לפני הניתוח ו- 2 ימים לאחר ניתוח.
הגורם השני בשכיחותו לתמותה לאחר ניתוח הוא דליפה בהשקה. הימנעות סיבוך זה מחייבת הקפדה על העקרונות של השקה מעיים. אספקת הדם המספקת להיות ראשון. אחרי כלי המספקים דם לאזור של מעי שעברו כריתה כבר ligated, המעי יש לבדוק לפני חיתוך רוחב חזותי. קטע איסכמי של מעי יופיע אפלולי; זה יש להסיר לחלוטין משאיר קצוות בריאים. חשוב לדמיין כמות קטנה של דימום מהקצוות של המעי שנותר. אנאס מים חזקtomosis חיוני גם כדי למנוע דליפה של תוכן luminal המוביל לאלח דם. זו מושגת על ידי הימנעות מפערים גדולים בין תפרים, ולהבטיח כי כל השכבות של המעי כלולים בתפר (איור 3). כוח פצע הצטמצם מאוד ביומיים שלאחר הניתוח הראשונים, תפרים ובכך להציב כראוי חיוניים כדי לספק כוח 16,17. מכשול אפשרי הוא שלא מדעת כולל רק את הרירית כרירית יכולה כווצה מתוך לומן של מעי גס transected. זה יכול להימנע על ידי לדמיין קצה החתך של serosa ועדינות הפחתת רירית צניחה בחזרה ללומן עם מלקחיים.
בקרות כירורגית שאם יש לשקול בעיצוב ניסיוני של מחקרים באמצעות מודל ICR לשלוט על תופעות של בלבול הפוטנציאלית של לחץ כירורגית, מניפולציה מעיים, ו / או אובדן של שסתום ileocecal. הבחירה של הליך המזויף יהיה תלויה בשאלה העיקרית שנשאלה בהמחקר. לדוגמא, אם מטרת המחקר היא להעריך את תגובת המארח לאחר שאבד את שסתום ileocecal, אז יהיה זה נבון מצד לכלול קבוצת ניתוח דמה שבי השקה מעיים מתבצעת תוך השארת שסתום ileocecal במקום. זה נעשה בדרך כלל על ידי transecting המעי הדק ללא כריתה ולאחר מכן ביצוע השקה במעי דק בצורה זהה ההשקה ileocolic 7,11. הדבר זה יאפשר לחוקרים על מנת להגיב באופן ספציפי על ההשפעות של אובדן שסתום ileocecal על ידי שליטה על ההשפעות של השקה מעיים. לחלופין, אם המטרה היא רק כדי לחקור את ההשפעות של כריתה והשקה של מעי בלי להעיר במיוחד על אובדן של שסתום ileocecal, אז ניתוח דמה צריך לכלול laparotomy, והמעי יש להתייחס כפי שהיה לICR, אך ללא חיתוך רוחב והשקה. זה היה בשליטתו ללחץ כירורגית ומניפולציה של המעיים. הטכניקות מתוארות בהפרוטוקול הנ"ל ניתן להתאים בקלות לביצוע הליכי העמדת פנים.
פרוטוקול זה מתאר כריתת ileocolic, אשר מסירה 1.5-2 סנטימטר של מעי סופני והשלמות של cecum, ומקרוב מחקה פעולה שבוצעה לעתים קרובות בחולים עם מחלת קרוהן ileocolic. נהלים דומים היו בשימוש ב- IL-10 - מודל קוליטיס לאחר שהעכברים פיתחו דלקת ופיברוזיס ספונטניות במעי הדק המקביל להישנות מחלת קרוהן 7,11 - /. העקרונות של הליך זה עשויים לחול גם על מודלים אחרים של מחלה. על ידי הסרת 50% מהמעי דק עם ההשקה ileocolic, מודלים של עכברים שנעשו שימוש כדי לחקור את תגובת גידול במעי מסתגלת בתסמונת מעי קצר 4-6. בעתיד זה עלול גם להיות מודל שימושי לחקר ההשפעות מקומיות והמערכתיות של ניתוח בסרטן מעי גס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
- Hallet, J., Zih, F. S., Lemke, M., Milot, L., Smith, A. J., Wong, C. S. Neo-adjuvant chemoradiotherapy and multivisceral resection to optimize R0 resection of locally recurrent adherent colon cancer. European Journal of Surgical Oncology. 40 (6), (2014).
- Rutgeerts, P., Geboes, K., Vantrappen, G. Natural history of recurrent Crohn's disease at the ileocolonic anastomosis after curative surgery. Gut. 25 (6), 665-672 (1984).
- Davis, D., Rivadeneira, D. Complications of colorectal anastomoses: leaks, strictures, and bleeding. The Surgical clinics of North America. 93 (1), 61-87 (2013).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Dekaney, C. M., Fong, J. J., Rigby, R. J., Lund, P. K., Henning, S. J., Helmrath, M. A. Expansion of intestinal stem cells associated with long-term adaptation following ileocecal resection in mice. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 293 (5), (2007).
- Speck, K. E., De Cruz, P., et al. Inflammation enhances resection-induced intestinal adaptive growth in IL-10 null mice. The Journal of surgical research. 168 (1), 62-69 (2011).
- Rigby, R. J., Hunt, M. R., et al. A new animal model of postsurgical bowel inflammation and fibrosis: the effect of commensal microflora. Gut. 58 (8), 1104-1112 (2009).
- Kostic, A. D., Xavier, R. J., Gevers, D. The Microbiome in Inflammatory Bowel Disease: Current Status and the Future Ahead. Gastroenterology. , 1-11 (2014).
- Gevers, D., Kugathasan, S., et al. The Treatment-Naive Microbiome in New-Onset Crohn's Disease. Cell host & microbe. 15 (3), 382-392 (2014).
- Ahmed, T., Rieder, F., Fiocchi, C., Achkar, J. P. Pathogenesis of postoperative recurrence in Crohn's disease. Gut. 60 (4), 553-562 (2011).
- Borowiec, A., Sydora, B., et al. Small bowel fibrosis and systemic inflammatory response after ileocolonic anastomosis in IL-10 null mice. Journal of Surgical Research. 178 (1), 147-154 (2012).
- Devine, A. A., Gonzalez, A., et al. Impact of Ileocecal Resection and Concomitant Antibiotics on the Microbiome of the Murine Jejunum and Colon. 8 (8), (2013).
- Bij, G. J., Oosterling, S. J., Beelen, R. H. J., Meijer, S., Coffey, J. C., van Egmond, M. The perioperative period is an underutilized window of therapeutic opportunity in patients with colorectal cancer. Annals of surgery. 249 (5), (2009).
- Scott, A. D., Uff, C., Phillips, R. K. Suppression of macrophage function by suture materials and anastomotic recurrence of Crohn's disease. The British journal of surgery. 80 (3), (1993).
- Kiernan, J. A. Intestinal anastomosis in the rat facilitated by a rapidly digested internal splint and indigestible but absorbable sutures. Journal of Surgical Research. 45, 427-431 (1988).
- Andersen, T. L., et al. Action of matrix metalloproteinases at restricted sites in colon anastomosis repair: an immunohistochemical and biochemical study. Surgery. 140 (1), 72-82 (2006).
- Thompson, S. K., Chang, E. Y., Jobe, B. A. Clinical review: Healing in gastrointestinal anastomoses, Part I. Microsurgery. 26 (3), 131-136 (2006).
