Protocol
Protocolli di uso animale sono stati approvati dal comitato Health Science cura degli animali e l'uso presso l'Università di Alberta.
1. Preparazione degli strumenti, Animali e Setup Operativo
- Trasferire animali ad una nuova, pulita gabbia assente di tutto solido cibo 24 ore prima della procedura. Essi possono avere libero accesso all'acqua e dieta liquida ad lib fino al momento della procedura.
- Autoclavare tutti gli strumenti necessari per la procedura. Superficie operativo pulito e anestetico cono con il 70% di etanolo.
- Impostare la superficie operativa con il microscopio operatorio, macchina anestetica e forniture in un modo che è comodo per il chirurgo. I gomiti del chirurgo dovrebbe essere permesso di riposare comodamente sul tavolo operatorio, con le mani e le braccia non ostruite dalle attrezzature. Strumenti, suture, tamponi di cotone, e una siringa da 10 ml devono essere collocati in una posizione che consenta un facile accesso durante la procedura.
- Impostarelampade di calore aeree per fornire sia calore per l'animale durante la procedura e la luce per la superficie operativa.
- Riempire un tubo da 50 ml con soluzione fisiologica 0,9%, e una provetta da 1,5 ml con vaselina e posto vicino alla superficie operativa.
NOTA: Sterilizzare tutti gli strumenti e le forniture chirurgiche. Poiché l'intestino viene sezionato, la procedura stessa non è sterile. E 'considerata pulita-contaminata. Adottare misure per evitare l'introduzione di fonti esogene di infezione.
2. ileocolica resezione con anastomosi
- Indurre l'anestesia con la somministrazione di 4% isoflurano con un tasso di flusso di ossigeno di 2 L / min con cono dal vaporizzatore isoflurano fino a quando la frequenza respiratoria animali rallenta a circa 30-40 atti / min. Applicare una pressione moderata per il piede posteriore del mouse per garantire che non vi è alcuna risposta al dolore prima di iniziare la procedura. A questo punto, abbassare isoflurano al 2% e il flusso di ossigeno di 0,5 l / min. Intermittentecontrollare la risposta al dolore durante la procedura e regolare flusso isoflurano conseguenza.
- Applicare vaselina per gli occhi contro l'essiccamento durante l'intervento chirurgico, e immobilizzare il mouse nella posizione supina con gli arti fissati con del nastro trasparente.
- Pulire l'addome con la soluzione povodine / di iodio, e cambiare in nuovi guanti sterili.
- Fare un incisione cutanea 1,5 centimetri sulla linea mediana superiore dell'addome con punta acuminata dissezione forbici per esporre la fascia e del peritoneo. Aprire lo strato fasciale / peritoneale in modo simile attraverso la linea alba per esporre il contenuto peritoneale.
- In contrasto con gli esseri umani, il cieco del mouse si trova in genere nel quadrante superiore sinistro dell'addome. Una volta identificato, afferrare delicatamente il cieco con una pinza e consegnarlo attraverso l'incisione. Usare tamponi di cotone inumiditi a ventaglio di circa 3 cm di ileo terminale estende dal cieco su una garza sterile drappeggiato sulla superficie addominale (Figura 1A).Assicurarsi che l'intestino esposto è tenuto umido con 0,9% di soluzione salina durante l'interezza della procedura.
- Identificare l'arteria ileocecale dirama l'arteria mesenterica superiore lungo il colon (Figura 1A) utilizzando il microscopio operatorio. Sezionare i tessuti avascolari adiacenti all'arteria ileocecale, circondare e legare l'arteria con una cravatta di seta 5-0. Quindi, individuare l'apporto di sangue regionale per l'ileo terminale e scegliere un punto transection 1,5-2 cm prossimalmente alla giunzione ileocecale. Legare i rami a questa sezione di ileo come sopra. Dividere le arterie con micro dissezione forbici.
- Dividere le porzioni ischemici di ileo e del colon di assicurare un adeguato apporto di sangue alle estremità sezionati (Figura 1B). È spesso utile spatolate ileo dividendolo con un angolo di 30 gradi per aumentare il diametro del lume modo che corrisponde più strettamente il colon. Una volta che la porzione di intestino ileocecale è stato rimosso, allineare laestremità sezionati di ileo e del colon sulla garza, assicurando i confini di ogni mesenterici sono allineati.
- Costruire l'anastomosi approssimando la fine transected dell'ileo alla fine transected del colon mediante interrotto 8-0 suture in polipropilene (Figura 1C). Il primo punto è posto al confine mesenterica, con suture successive poste ogni 0,5 mm, fino anastomosi ileocolica è a tenuta stagna. Quando si passa l'ago di sutura attraverso l'ileo e colon, in modo che il bordo tagliato non viene arrotolata, e morsi di aghi sono mm 0,5 dai bordi tagliati dell'intestino. Una anastomosi tipico richiede da 14 a 16 punti staccati. Verificare l'integrità e la pervietà delle anastomosi al termine tirando un tampone di cotone prossimale a distale sopra l'ileo per forzare i contenuti attraverso l'anastomosi. Piccoli contenuto intestinale dovrebbero passare liberamente nel colon senza perdite anastomotica.
- Sciacquare l'intestino esposto con 3-4 ml di soluzione fisiologica 0,9% dalla siringa da 10 mlper lavare via feci dalla superficie delle viscere, e fornire dell'intestino nella cavità peritoneale. Utilizzo di 2 ml di soluzione salina allo 0,9% sciacquare la cavità peritoneale, e poi drenare il liquido applicando una leggera pressione alla parete addominale laterale.
- Chiudere l'incisione con una corsa 3-0 seta sutura, e interrompere il flusso di isoflurano. Somministrare 0,1 mg / kg di oppiacei lunga durata d'azione per via sottocutanea -buprenorphine- per il controllo del dolore post-operatorio.
- Osservare gli animali sotto la lampada di calore fino a quando non sono mobili poi trasferirli in una gabbia continuamente riscaldato.
3. Cura post-operatoria e monitoraggio
- Monitorare animali in gabbia continuamente riscaldato per segni di sofferenza per il resto della giornata. Di trasferire gli animali torna alla casa di cura degli animali in una nuova gabbia sterile con accesso a dieta liquida e acqua ad lib. Gli animali possono essere inseriti in gruppi di 3-4.
- Eseguire un controllo sugli animali post-operatorie la mattina seguente,garantire gli animali non appaiono in difficoltà. Alimentare solo dieta liquida. Se appaiono a disagio (ad esempio, la postura ingobbita o attività minima) somministrare un'ulteriore dose di buprenorfina per via sottocutanea. Controllare gli animali ancora una volta nel pomeriggio del giorno post-operatorio 1.
- La mattina del giorno post-operatorio 2 gli animali dovrebbero apparire pienamente recuperato. La prova dei consumi alimentari e stooling sono segnali positivi di ripresa. Ora, riprendere una dieta solida chow per gli animali.
NOTA: Segnali di pericolo includono postura ingobbita, povero governare, e l'attività minima. Se i segni di sofferenza sono importanti gli animali devono essere sacrificati. - Euthanize gli animali inducendo profonda anestesia con isoflurano 4% ad un tasso di O 2 flusso di 2 L / min fino a quando gli animali non rispondono alla pressione del piede. Eseguire dislocazione cervicale, e osservare i segni di una corretta euthanization.
- Linee guida variano, in modo da fare riferimento alle raccomandazioni delle istituzioni in materia di indicazionie metodi appropriati di euthanization nei topi.
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Representative Results
I tassi di mortalità e il cambiamento di peso dopo l'intervento.
I tassi di mortalità seguenti ICR in 129S1 topi wild type sono in genere ~ 5%. La causa più comune della moralità è occlusione intestinale al anastomosi. Altre cause di mortalità comprendono l'deiscenza anastomotica ed ernia interna per occlusione intestinale.
La perdita di peso può essere visto fino a 14 giorni dopo l'intervento, ma è generalmente non significativa. I topi tendono a riacquistare completamente peso pre-operatoria da post-operatorio giorno 28 (Figura 2).
Trasferibilità della tecnica
Un nuovo studente laureato (BM) è stato insegnato a eseguire la procedura ICR per determinare se un operatore senza formazione chirurgica precedente potrebbe imparare la tecnica. La formazione ha avuto inizio con l'apprendimento come eseguire i punti staccati singoli analoghi a quelli utilizzati per la anastomosi con 8-0 sutura in nylon. Le suture sono state effettuate per chiudere una incisione fatta in una glo latticeve. Dopo BM è stato in grado di mettere in modo efficiente suture attraverso il guanto senza strappi, hanno osservato tre procedure complete prima di tentare uno. Dopo la prima procedura è stata completata, hanno poi osservato un altro regime e tentato altri due. Dei tre animali completati, gli ultimi due ha continuato a sopravvivere e prosperare. Il primo animale è stato abbattuto a causa di complicazioni al anastomosi.
Figura 1. Fasi di resezione e anastomosi ileocolica. (A) regione ileocecale di intestino consegnato fuori dell'addome. Frecce nere indicano le navi da legatura, linee tratteggiate indicano i punti transection per colon e dell'ileo terminale. (B) regione ileocecale rimosso, estremità tagliate di intestino sono allineati, rimanendo apporto di sangue è dimostrato da frecce nere. (C) Completato anas ileocolicatomosis. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. pesi animali al basale, giorno post-operatorio 14 e post-operatoria giorno 28. Nessun cambiamento significativo nei pesi sono stati osservati post-procedura come determinato dal test statistico di Mann-Whitney. ICR (ileocolica gruppo resezione), di controllo (i controlli non operativi).
Figura 3. percorso rappresentativa di suture attraverso i tessuti intestinali. EE macchiati sezioni istologiche di ileo (a destra) e del colon (sinistra) sono allineati per dimostrare la traiettoria del ne suturaEDLE attraverso i tessuti (linea tratteggiata) iniziano al punto (a) fino al punto (b). Il nodo deve essere legato al punto (c). Si noti che meno la mucosa è incluso nel anastomosi rispetto ad altri tessuti. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il murino ICR è un modello potente che può essere usato per studiare gli effetti della chirurgia nelle malattie intestinali. Questo articolo descrive un metodo per l'esecuzione di ICR nei topi con un tasso di successo del 95% e nessun problema con difetto di crescita, come risulta da pesi stabili fino a 28 giorni dopo la procedura. Le sfide più importanti per il successo ICR includono evitare ostruzioni intestinali al anastomosi e perdite anastomotiche.
Elementi tecnici per l'intervento chirurgico per prevenire l'ostruzione hanno lo scopo di massimizzare il diametro del lume al anastomosi. Spatolamento dell'ileo nel punto transezione aumenta il diametro del lume dividendo l'intestino con un angolo di 30 gradi, come illustrato nella Figura 1A. Nel prendere morsi di tessuto intestinale con l'ago di sutura, è essenziale srotolare i bordi del viscere e passare l'ago di circa 0,5 mm dal bordo tagliato. Eccessivamente grandi morsi di tessuto saranno restringere il lume. Un'opzione per avoid restringimento del lume nel costruire il anastomosi è di impiegare l'uso di uno stent digeribili come descritto da Kiernan et al. 15. Aspetti non tecnici per evitare l'ostruzione includono la selezione di un sufficientemente piccola sutura 4 ed evitando contenuto luminale ingombranti per l'alimentazione degli animali una dieta liquida un giorno prima dell'intervento e due giorni dopo l'intervento.
La seconda causa più comune di mortalità post-operatoria è deiscenza anastomotica. Come evitare questa complicanza richiede un rigido rispetto dei principi di anastomosi intestinale. Il primo è un adeguato apporto di sangue. Dopo i vasi che forniscono sangue alla regione di intestino essere resecati sono stati legatura, l'intestino deve essere ispezionato visivamente prima della resezione. Il segmento di intestino ischemico apparirà scuro; questo dovrebbe essere completamente rimosso lasciando bordi sani. È importante visualizzare una piccola quantità di sanguinamento dai bordi tagliati dell'intestino rimanente. Un'acqua anas strettotomosis è anche essenziale per evitare la fuoriuscita del contenuto luminale che portano alla sepsi. Questo risultato è ottenuto evitando grandi spazi tra suture, e garantire che tutti gli strati dell'intestino sono inclusi nel punto (Figura 3). Forza della ferita è notevolmente diminuita nei primi due giorni post-operatorio, punti di sutura in tal modo correttamente posizionati sono essenziali per fornire la resistenza 16,17. Un potenziale problema è inavvertitamente solo compresa la mucosa come la mucosa può pucker fuori del lume del colon transected. Ciò può essere evitato visualizzando il bordo tagliato della sierosa e delicatamente riducendo mucosa prolasso indietro nel lume con una pinza.
Controlli chirurgici Sham dovrebbero essere presi in considerazione nel disegno sperimentale degli studi che utilizzano il modello ICR per controllare per i potenziali effetti confondenti di stress chirurgico, la manipolazione intestinale, e / o perdita della valvola ileocecale. La scelta della procedura simulata dipenderà dalla domanda primaria viene chiesto dilo studio. Ad esempio, se l'obiettivo della ricerca è di valutare la risposta dell'ospite dopo aver perso la valvola ileocecale, allora sarebbe opportuno includere un gruppo chirurgico sham in cui viene eseguita una anastomosi intestinale, lasciando la valvola ileocecale in posizione. Ciò avviene tipicamente da sezionare l'intestino tenue senza resezione quindi eseguire una piccola anastomosi intestinale nello stesso modo come l'anastomosi ileocolica 7,11. Ciò consentirebbe investigatori di commentare specificamente gli effetti della perdita valvola ileocecale controllando gli effetti di anastomosi intestinale. In alternativa, se l'obiettivo è solo quello di studiare gli effetti di resezione intestinale ed anastomosi senza commentare specificamente sulla perdita della valvola ileocecale, poi un intervento chirurgico sham dovrebbe includere una laparotomia, e l'intestino deve essere trattato come si farebbe per ICR, ma senza recisione e anastomosi. Ciò avrebbe controllato per lo stress chirurgico e la manipolazione intestinale. Le tecniche descritte inil protocollo di cui sopra può essere facilmente adattato per l'esecuzione di procedure fittizie.
Questo protocollo descrive una resezione ileocolica, che rimuove 1,5-2 cm di ileo terminale e la totalità del cieco, e imita da vicino l'operazione frequentemente eseguita nei pazienti con malattia di Crohn ileocolica. Procedure simili sono stati utilizzati in IL-10 - modello di colite dopo che i topi sviluppato infiammazione spontanea e fibrosi nel piccolo intestino analoga alla malattia di Crohn reiterazione 7,11 - /. I principi di questa procedura possono valere anche per altri modelli di malattia. Eliminando il 50% del piccolo intestino con anastomosi ileocolica, modelli murini sono stati utilizzati per studiare la risposta adattativa di crescita intestinale nella sindrome dell'intestino corto 4-6. In futuro questo può anche diventare un modello utile per studiare gli effetti sistemici e locali di chirurgia nel cancro del colon-retto.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LD101 liquid rodent diet | testdiet.com | ||
| 0.9% NaCl | Baxter | FKE1324 | Injection quality saline |
| Operating Microscope | Ziess | ||
| Isoflurane Anesthetic Vaporizer | Harvard Apparatus | 34-0483 | |
| Isoflurane | Abbott | 05260-05 | |
| Glass plate | For operating surface | ||
| Cotton swabs | |||
| Micro Castroviejo Needle holder, curved | World Precision Instruments | 503377 | |
| Castroviejo straight scissors | World Precision Instruments | 555530S | |
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| Dressing Forceps x 2 | World Precision Instruments | 500363 | |
| 5-0 silk pre-cut sutures | Ethicon | A182H | For vessel ligation |
| 8-0 Prolene on BV130-5 needle | Ethicon | 8732H | For anastomosis |
| 3-0 Silk on FS-2 needls | Ethicon | 8665G | For abdominal wall closure |
| Petroleum Jelly | Vaseline | ||
| 10 ml syringe | BD biosciences | ||
| Povidone-iodine 7.5% surgical Scrub | betadine.com | ||
| Heat lamps | |||
| buprenorphine 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | PL36699/0006 |
References
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